矿化微生物粉剂制备方法

技术领域

本发明属于微生物学和土木工程材料领域的交叉科学技术，具体涉及一种矿化微生物粉剂制备方法。

背景技术

微生物矿化技术在工程材料领域的应用引起了广大学者的关注。由于矿化微生物能诱导生物矿物沉积，且相比于化学方法形成的矿物具有显著胶结能力，可以胶结砂土形成具有一定强度的胶结体，因此可应用于岩土工程，如抑制扬尘、边坡防护等。此外，矿化微生物诱导矿物沉积可封堵混凝土裂缝，达到自愈合的效果，提高混凝土耐久性；在重金属污染的土壤和水体中也有较好的应用，可以沉积重金属离子，达到修复的目的；近年来，微生物矿化技术还被用于处理固体废弃物，为固废资源化利用提供了新途径。

相比传统方法，微生物矿化技术绿色、环保，无二次污染，在土木工程材料领域具有广阔应用前景，但具体实际运用中，还没有可广泛使用的微生物粉剂产品。

发明内容

发明目的：针对上述现有技术，本申请提供了一种可广泛使用，使得矿化微生物在工程材料领域的应用过程更加方便快捷的矿化微生物粉剂的制备方法。

技术方案：本发明所述的一种矿化微生物粉剂制备方法，包括以下步骤：

(1)取矿化微生物培养至对数期后取出，高速离心浓缩菌液，细胞总数为(5～7)×10

(2)将浓缩菌液和冷冻保护剂混合后预冻；

(3)真空冷冻干燥获得矿化微生物粉剂，储存。

步骤(1)中，所述矿化微生物能诱导矿化产物生成，对人体无害且生态性良好。进一步的，所述矿化微生物为胶质芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌等一种或多种。

步骤(1)中，培养矿化微生物所用培养基成分包括牛肉膏、蛋白胨；其中，每升培养基含有牛肉膏2～5g，蛋白胨3～8g。其中，牛肉膏为矿化微生物生长提供氮源、碳源、无机盐，蛋白胨为微生物生长提供氮源、碳源、生长因子。

进一步的，培养条件为30±2℃、170±5rpm。

所述离心分离方法优选高速离心法，其特点是，操作简便快捷，比如再仪器的清洗和消毒，较易控制污染等方面具有优势。

进一步的，所述高速离心法的离心速度为4000～6000r/min，离心时间为5～15min。

本申请中，所述细胞总数测试方法包括血球计数板计数法、流式细胞仪法或OD值法。

步骤(2)中，所述真空冷冻干燥技术需使用冻干保护剂对微生物进行保护，优选的冻干保护剂为甘油、葡萄糖、L–半胱氨酸盐、脱脂奶粉、吐温-80、谷氨酸钠的一种或几种复配。

当选用单一冻干保护剂时，以水作为溶剂，甘油的质量分数优选为5％～10％，葡萄糖的质量分数优选为10％～15％，L–半胱氨酸盐的质量分数优选为10％～15％、脱脂奶粉的质量分数优选为10％～15％、吐温-80的质量分数优选为2％～4％、谷氨酸钠的质量分数优选为0.5％～1.5％，此时具有最佳保护效果。

当选用冻干保护剂进行复配时，以水作为溶剂，脱脂乳粉的质量分数为10％～15％，葡萄糖的质量分数为10％～15％，甘油的质量分数为3～8％，谷氨酸钠的质量分数为0.5％～1％。

步骤(2)中，所述冻干保护剂与菌体的混合条件包括保护剂pH值、保护剂与菌体混合比例、保护剂与菌体混合平衡时间，保护剂pH值优选为7～9，保护剂与菌液的混合比例优选为2:3～3:2，混合平衡时间优选为50～70min。

进一步的，保护剂的pH值使用乙酸和碳酸氢钠调节。

步骤(2)中，所述预冻冻干厚度优选的为3～8mm，预冻的具体操作方法为，使用超低温冰箱预冻2～3h，温度设置为-80±2℃。

本申请所述干燥技术优选真空冷冻干燥技术，其特点是：干燥在低温下进行，物质中的一些挥发性成分损失很小；微生物的生长和酶的作用无法进行，因此能保持原来的性状；能排除95～99％以上的水分，后产品能长期保存而不致变质等。

步骤(3)中，所述储存条件为-68～4℃，温度越低，粉剂越稳定。

进一步的，对粉剂稳定性的判断条件为酶活性和含水量。酶活性的测试方法为电导率法或比色法；含水量的测试方法为重量测量法。

所述微生物矿化能力验证方法为：在去离子水中掺加矿化微生物和可被矿化的金属离子，置于25～30℃振荡培养箱中培养，3～5d后取出，对沉淀产物进行验证。

进一步的，所述可被矿化的金属离子包括钙离子、锌离子、铅离子等的一种或几种，其中离子浓度优选为10～80mmol/L。

有益效果：与现有技术相比，本发明提出一种矿化微生物粉剂制备方法，该方法操作简单，不影响矿化微生物活性，便于保存，可直接掺加到工程材料中使用，可用于岩土工程、环境岩土工程、废渣利用和水泥基材料领域。

附图说明

图1为粉剂制备工艺流程图；

图2为矿化产物粒径分布对比图；

图3为矿化产物XRD对比图；

图4为矿化产物微观形貌对比图。

具体实施方式

为更好的理解本发明，将结合具体实施例进一步阐述本发明所述内容。

本发明提供一种矿化微生物粉剂制备方法，工艺流程如图1所示，具体操作过程如下：

1.将微生物接种到培养基进行培养，其中培养基成分包括牛肉膏和蛋白胨，培养条件为30±2℃、170±5rpm，培养至对数期后取出；

2.离心机消毒后对菌液进行高速离心分离，离心分离条件优选为4000～6000rpm、5～15min，获得浓缩菌液待用，菌液中细菌数为(5～7)×10

3.按照保护剂配方配制保护剂，使用乙酸和碳酸氢钠调节将pH调节至7～9范围内待用；

4.将步骤2浓缩的菌液与步骤3配制的保护剂按照2:3～3:2的比例混合50～70min；

5.将混合后菌液放入超低温冰箱预冻2～3h，冻干厚度为3～8mm；

6.将预冻好的菌液放入真空冷冻干燥机中，经过24h的冻干获得冻干粉剂，密封后放入超低温冰箱储存。

7.在去离子水中掺加矿化微生物和可被矿化的金属离子，置于25-30℃振荡培养箱中培养，3-5d后取出，对沉淀产物进行验证。

实施例1

一种矿化微生物粉剂制备方法：

(1)称取牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，配置成液体培养基，在121℃条件下灭菌30min后接种胶质芽孢杆菌，在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC No:M 2012406，在30±2℃、170±5rpm条件下培养；

(2)将培养至对数期的菌液倒入离心管置于高速离心机中。设置离心速度4000r/min，离心时间5min，获得浓缩菌液，测得细菌总数为5.233×10

(3)以水作为溶剂配制保护剂，其中脱脂乳粉的质量分数为15％，葡萄糖的质量分数为15％，甘油的质量分数为5％，谷氨酸钠的质量分数为1％，使用乙酸和碳酸氢钠调节将pH调节至8；

(4)将配制的保护剂与离心所得的浓缩菌液按1:1的体积平衡混合60min，然后放入超低温冰箱中预冻2h，冻干厚度为5mm；

(5)将预冻好的菌液放入真空冷冻干燥机中，经过24h的冻干获得冻干粉剂，密封后放入超低温冰箱储存，性质稳定；

(6)在去离子水中掺加步骤(5)粉剂/微生物原菌液和氯化钙，使得细胞总数为10

实施例2

一种矿化微生物粉剂制备方法：

(1)称取牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，配置成液体培养基，在121℃条件下灭菌30min后接种胶质芽孢杆菌，在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC No:M 2012406，在30±2℃、170±5rpm条件下培养；

(2)将培养至对数期的菌液倒入离心管置于高速离心机中。设置离心速度5000r/min，离心时间5min，获得浓缩菌液，测得细菌总数为5.453×10

(3)以水作为溶剂配制保护剂，其中脱脂乳粉的质量分数为10％，葡萄糖的质量分数为15％，甘油的质量分数为3％，谷氨酸钠的质量分数为1％，使用乙酸和碳酸氢钠调节将pH调节至8；

(4)将配制的保护剂与离心所得的浓缩菌液按1:1的体积平衡混合70min，然后放入超低温冰箱中预冻2h，冻干厚度为6mm；

(5)将预冻好的菌液放入真空冷冻干燥机中，经过24h的冻干获得冻干粉剂，密封后放入超低温冰箱储存，性质稳定；

(6)在去离子水中掺加步骤(5)粉剂和氯化钙，使得细胞总数为10

实施例3

一种矿化微生物粉剂制备方法：

(1)称取牛肉膏5g/L，蛋白胨5g/L，配置成液体培养基，在121℃条件下灭菌30min后接种胶质芽孢杆菌，在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC No:M 2012406，在30±2℃、170±5rpm条件下培养；

(2)将培养至对数期的菌液倒入离心管置于高速离心机中。设置离心速度5000r/min，离心时间10min，获得浓缩菌液，测得细菌总数为5.475×10

(3)以水作为溶剂配制保护剂，其中脱脂乳粉的质量分数为15％，葡萄糖的质量分数为10％，甘油的质量分数为3％，谷氨酸钠的质量分数为1％，使用乙酸和碳酸氢钠调节将pH调节至8；

(4)将配制的保护剂与离心所得的浓缩菌液按3:2的体积平衡混合50min，然后放入超低温冰箱中预冻2h，冻干厚度为5mm；

(5)将预冻好的菌液放入真空冷冻干燥机中，经过24h的冻干获得冻干粉剂，密封后放入超低温冰箱储存，性质稳定；

(6)在去离子水中掺加步骤(5)粉剂和氯化钙，使得细胞总数为10

实施例4

一种矿化微生物粉剂制备方法：

(1)称取牛肉膏5g/L，蛋白胨5g/L，配置成液体培养基，在121℃条件下灭菌30min后接种嗜碱芽孢杆菌，中国工业微生物菌种保藏管理中心菌株保藏编号为CICC 23037，在30±2℃、170±5rpm条件下培养；

(2)将培养至对数期的菌液倒入离心管置于高速离心机中。设置离心速度6000r/min，离心时间10min，获得浓缩菌液，测得细菌总数为5.616×10

(3)以水作为溶剂配制保护剂，其中脱脂乳粉的质量分数为15％，葡萄糖的质量分数为15％，甘油的质量分数为5％，谷氨酸钠的质量分数为1％，使用乙酸和碳酸氢钠调节将pH调节至8；

(4)将配制的保护剂与离心所得的浓缩菌液按1:1的体积平衡混合60min，然后放入超低温冰箱中预冻2h，冻干厚度为5mm；

(5)将预冻好的菌液放入真空冷冻干燥机中，经过24h的冻干获得冻干粉剂，密封后放入超低温冰箱储存，性质稳定；

(6)在去离子水中掺加步骤(5)粉剂和氯化锌，使得细胞总数为10