一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的试剂盒
文献发布时间:2023-06-19 11:08:20
技术领域
本申请属于生物检测技术领域,具体为一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的试剂盒。
背景技术
血脂异常是多种心脑血管疾病的危险因素,降低胆固醇是预防心脑血管不良事情的基石。他汀类药物具有良好的降脂作用,但往往患者的服用效果并不相同,而ApoE和SLCO1B1基因是影响他汀降脂疗效主要的遗传因素。
载脂蛋白E(apolipoprotein E,APOE)是血浆中重要的载脂蛋白之一。ApoE主要在肝脏合成、分泌和代谢,参与脂质的运输、储存及排泄,有修复组织、抑制血小板聚集、免疫调节等作用。流行病学资料表明载脂蛋白E的基因多态性对血脂浓度有明显的影响。该基因有两个功能性SNP位点:rs429358(c.388T>C)和rs7412(c.526C>T),可以形成ε2、ε3、ε4三个等位基因,共构成ε2/2、ε2/3、ε2/4、ε3/3、ε4/3、ε4/4六种基因型。近年来研究发现,ApoE基因多态性与冠心病、老年痴呆、高胆固醇血症、脑梗塞等疾病有着密切的关系,还影响个体对特汀类药物治疗的响应。
SLCO1B1基因编码有机阴离子转运多肽OATP1B1,OATP1B1为跨膜转运蛋白,主要分布于肝脏,具有介导肝细胞膜转运内、外源性物质并对其进行代谢和消除的生理功能。SLCO1B1基因的最常见的两个突变为388A>G和rs4149056(521T>C),SLCO1B1基因多态性将改变OATP1B1转运能力,增加他汀类药物血浆浓度,从而诱发他汀类肌肉毒性,增加横纹肌溶解症或肌病的发生风险,是导致药物疗效及不良反应差异的重要因素。
心血管疾病是基因和环境因素相互作用下的综合表现,包括生化、生理和病理过程,若能早期进行风险评估,甄别高危患者,对降低心血管疾病风险,做好早期预防及制定合适的治疗策略都有重要的指导意义。
目前,针对ApoE和SLCO1B1基因多态性的检测方法很多,如荧光定量PCR法、限制性片段长度多态性分析法、高分辨率溶解曲线法、直接测序、基因芯片等。但是这些方法基本上都操作复杂、检测周期长,且需要复杂的仪器设备、成本也较高,不适合临床推广。
重组酶聚合酶扩增(Recombinase Mediated Amplification,RMA)技术是一种核酸等温扩增技术,主要依赖重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种酶。RMA反应可以在37~42℃进行,整个过程在30min内即可达到检测水平。锁核酸(LockedNucleic Acid,LNA)是一种特殊的双环状寡核苷酸衍生物,其结构中核糖的2'-O位和4'-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥,并连接成环形,这个环形桥锁定了呋喃糖C3'-内型的N构型,降低了核糖结构的柔韧性,增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性,提高了扩增反应中DNA分子的稳定性和亲和力。研究发现,在错配位点修饰1-3个锁核酸可明显提高单碱基错配的识别能力。LNA修饰的探针比传统的DNA探针有更高的灵敏度、稳定性、扩增效率和较低的探针浓度,是一种更为可靠的检测基因分型的方法。
本发明采用锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法(LNA-RMA法)进行ApoE和SLCO1B1基因多态性检测,更加快速、简便,能够提高单碱基突变检测的特异性和灵敏度。
发明内容
为了解决现有技术的问题,本申请提供了一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的试剂盒,本申请是通过下述方案实现的:
一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的引物探针组,所述引物探针组分为两组,A组为检测ApoE 388T>C和526C>T的引物对、野生型探针和突变型探针;B组为检测SLCO1B1 388A>G和521T>C的引物对、野生型探针和突变型探针。
其中,A组的ApoE 388T>C引物和探针序列为:
上游引物:5’-AGACGCGGGCACGGCTGTCCAAGGAGCTGCA-3’;
下游引物:5’-TCGGTGCTCTGGCCGAGCATGGCCTGCACCT-3’;
野生型探针:
突变型探针:
A组的ApoE 526C>T引物和探针序列为:
上游引物:5’-AGGCCATGCTCGGCCAGAGCACCGAGGAGCT-3’;
下游引物:5’-TTGGCGCGCACCTCCGCCACCTGCTCCTTCA-3’;
野生型探针:
突变型探针:
B组的SLCO1B1 388A>G引物和探针序列为:
上游引物:5’-TGCTGGGAAATTGACAGAAAGTACTCTGGTAA-3’;
下游引物:5’-AACCTGTGTTGTTAATGGGCGAACTGTGTATA-3’;
野生型探针:
突变型探针:
B组的SLCO1B1 521T>C引物和探针序列为:
上游引物:5’-CAGCCATGAGGAACTATGAGTCCATTAGACC-3’;
下游引物:5’-ATGGTACTATGGGAGTCTCCCCTATTCCAC-3’;
野生型探针:
突变型探针:
5’-AGGAATCTGGGTCATACATGTGGATATA(CY5-dT)G
优选的,所述探针上修饰有荧光基团和淬灭基团,所述淬灭基团修饰在THF 3’端的T碱基上,荧光基团修饰在SNP位点的5’端T碱基上或SNP位点互补碱基的5’端T碱基上。
优选的,所述荧光基团用FAM、HEX、ROX或CY5修饰,所述淬灭基团用BHQ修饰。
优选的,所述探针3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。
优选的,所述探针覆盖SNP位点,在探针的SNP位点上做锁核酸(LNA)修饰。
一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的试剂盒,所述试剂盒包括含有扩增反应试剂A的检测管、含有扩增反应试剂B的检测管、缓冲液、醋酸镁、阳性对照、阴性对照。
优选的,所述扩增反应试剂A包括ApoE 388T>C上下游引物、ApoE 388T>C野生型和突变型探针、ApoE 526C>T上下游引物、ApoE 526C>T野生型和突变型探针、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。
优选的,所述扩增反应试剂B包括SLCO1B1 388A>G上下游引物、SLCO1B1 388A>G野生型和突变型探针、SLCO1B1 521T>C上下游引物、SLCO1B1 521T>C野生型和突变型探针、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。
优选的,所述引物对及检测探针组在扩增体系中的终浓度分别为10μM;所述聚环氧乙烷的终浓度为10%w/v;所述海藻糖的终浓度为2mM;所述甘露醇的终浓度为2.5mM;所述ATP的终浓度为10mM;所述dNTPs的终浓度为2mM;所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/mL;所述磷酸肌酸的终浓度为25mM;所述大肠杆菌RecA蛋白的终浓度为100ng/μL;所述UvsY蛋白的终浓度为40ng/μL;所述单链结合蛋白GP32的终浓度为800ng/μL;所述Bst聚合酶的终浓度为60ng/μL;所述核酸外切酶III的终浓度为80ng/μL。
优选的,所述阳性对照为ApoE 388T>C野生型质粒和突变型质粒、ApoE 526C>T野生型质粒和突变型质粒、SLCO1B1 388A>G野生型质粒和突变型质粒、SLCO1B1 521T>C野生型质粒和突变型质粒。
优选的,所述阴性对照为无菌双蒸水。
优选的,所述试剂盒可以检测的样品为人全血或外周血样本。
一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的方法,包括以下步骤:
(1)提取待测样本DNA作为模板;
(2)设计用于ApoE 388T>C和526C>T、SLCO1B1 388A>G和521T>C基因多态性检测的引物对及探针;
(3)以提取的待测样本DNA作为模板,加入上述试剂盒中的反应试剂进行RMA扩增反应,扩增反应条件为在实时恒温荧光检测器中39℃下扩增20分钟;
(4)检测结果判定:
对于野生纯合型样本,只有野生型探针产生荧光信号,而突变型探针没有产生荧光信号,说明突变型探针对野生型模板不会产生非特异性扩增;对于突变纯合型样本,只有突变型探针产生荧光信号,而野生型探针没有产生荧光信号,说明野生型探针对突变型模板不会产生非特异性扩增;对于突变杂合型样本,突变型探针和野生型探针都产生了荧光信号。
有益效果:本发明能够快速的同时检测ApoE 388T>C和526C>T、SLCO1B1 388A>G和521T>C基因位点的多态性,具有极高的灵敏度和特异性;采用锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法(LNA-RMA法),反应可以在37~42℃进行,对仪器设备的要求不高,操作简单,在30min内即可得到结果;整个反应过程采用全封闭形式,避免了交叉污染的可能;扩增反应试剂采用冻干工艺,提高试剂稳定性,降低运输成本;用锁核酸修饰探针能够提高单碱基突变的检测特异性,比传统的DNA探针有更高的灵敏度,适用于基因分型检测。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1ApoE 388TT野生纯合型样本检测结果;
图2ApoE 388CC突变纯合型样本检测结果;
图3ApoE 388TC突变杂合型样本检测结果;
图4ApoE 526CC野生纯合型样本检测结果;
图5ApoE 526TT突变纯合型样本检测结果;
图6ApoE 526CT突变杂合型样本检测结果;
图7SLCO1B1 388AA野生纯合型样本检测结果;
图8SLCO1B1 388GG突变纯合型样本检测结果;
图9SLCO1B1 388AG突变杂合型样本检测结果;
图10SLCO1B1 521TT野生纯合型样本检测结果;
图11SLCO1B1 521CC突变纯合型样本检测结果;
图12SLCO1B1 521TC突变杂合型样本检测结果。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本申请实施方式作进一步地详细描述。
实施例1
1、引物和探针的设计
基于ApoE 388T>C和526C>T、SLCO1B1 388A>G和521T>C基因突变序列或其互补序列设计的LNA-RMA检测引物和探针如下表1所示;
表1 ApoE和SLCO1B1基因引物与探针序列
注:LNA修饰的突变位点碱基用斜体加粗加下划线表示;ApoE 388T>C和SLCO1B1388A>G的野生型探针的荧光基团都用FAM修饰;ApoE 388T>C和SLCO1B1 388A>G的突变型探针的荧光基团都用ROX修饰;ApoE 388T>C和SLCO1B1 388A>G的野生型探针和突变型探针的淬灭基团都用BHQ修饰;ApoE 526C>T和SLCO1B1 521T>C的野生型探针的荧光基团都用HEX修饰;ApoE 526C>T和SLCO1B1 521T>C的突变型探针的荧光基团都用CY5修饰;ApoE 526C>T和SLCO1B1 521T>C的野生型探针和突变型探针的淬灭基团都用BHQ修饰。
2、样本的提取
采用血液基因组DNA提取试剂盒提取待测样本的DNA作为模板;
3、RMA反应体系的建立
将42.5μL缓冲液和5μL提取的待测样本DNA加入到含有扩增反应试剂A的检测管中,混匀,并向检测管中加入2.5μL的280mM醋酸镁溶液并混匀;将42.5μL缓冲液和5μL提取的待测样本DNA加入到含有含有扩增反应试剂B的检测管中,混匀,并向检测管中加入2.5μL的280mM醋酸镁溶液并混匀;将两个检测管在实时恒温荧光检测器中39℃扩增20分钟;
其中,所述扩增反应试剂A包括ApoE 388T>C上下游引物、ApoE 388T>C野生型和突变型探针、ApoE 526C>T上下游引物、ApoE 526C>T野生型和突变型探针、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸;
所述扩增反应试剂B包括SLCO1B1 388A>G上下游引物、SLCO1B1 388A>G野生型和突变型探针、SLCO1B1 521T>C上下游引物、SLCO1B1 521T>C野生型和突变型探针、大肠杆菌RecA蛋白、、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸;
所述引物对及检测探针组在扩增体系中的终浓度分别为10μM;所述聚环氧乙烷的终浓度为10%w/v;所述海藻糖的终浓度为2mM;所述甘露醇的终浓度为2.5mM;所述ATP的终浓度为10mM;所述dNTPs的终浓度为2mM;所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/mL;所述磷酸肌酸的终浓度为25mM;所述大肠杆菌RecA蛋白的终浓度为100ng/μL;所述UvsY蛋白的终浓度为40ng/μL;所述单链结合蛋白GP32的终浓度为800ng/μL;所述Bst聚合酶的终浓度为60ng/μL;所述核酸外切酶III的终浓度为80ng/μL;
所述阳性对照为ApoE 388T>C野生型质粒和突变型质粒、ApoE 526C>T野生型质粒和突变型质粒、SLCO1B1 388A>G野生型质粒和突变型质粒、SLCO1B1 521T>C野生型质粒和突变型质粒;
所述阴性对照为无菌双蒸水;
4、检测结果判定:
通过实时恒温荧光检测器上显示的荧光信号判断所检测的ApoE 388T>C和526C>T、SLCO1B1 388A>G和521T>C基因多态性位点。图1显示该样本为ApoE 388TT野生纯合型样本,仅野生型探针产生荧光信号,突变型探针无荧光信号;图2显示该样本为ApoE 388CC突变纯合型样本,仅突变型探针产生荧光信号,野生型探针无荧光信号;图3显示该样本为ApoE 388TC突变杂合型样本,野生型探针和突变型探针都产生荧光信号;图4显示该样本为ApoE 526CC野生纯合型样本,仅野生型探针产生荧光信号,突变型探针无荧光信号;图5显示该样本为ApoE 526TT突变纯合型样本,仅突变型探针产生荧光信号,野生型探针无荧光信号;图6显示该样本为ApoE 526CT突变杂合型样本,野生型探针和突变型探针都产生荧光信号;图7显示该样本为SLCO1B1 388AA野生纯合型样本,仅野生型探针产生荧光信号,突变型探针无荧光信号;图8显示该样本为SLCO1B1 388GG突变纯合型样本,仅突变型探针产生荧光信号,野生型探针无荧光信号;图9显示该样本为SLCO1B1 388AG突变杂合型样本,野生型探针和突变型探针都产生荧光信号;图10显示该样本为SLCO1B1 521TT野生纯合型样本,仅野生型探针产生荧光信号,突变型探针无荧光信号;图11显示该样本为SLCO1B1 521CC突变纯合型样本,仅突变型探针产生荧光信号,野生型探针无荧光信号;图12显示该样本为SLCO1B1 521TC突变杂合型样本,野生型探针和突变型探针都产生荧光信号。
以上所述仅为本申请的较佳实施例,并不用以限制本申请,凡在本申请的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本申请的保护范围之内。
序列表
<110> 济南国益生物科技有限公司
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- 一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的试剂盒
- 一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ALDH2基因多态性的试剂盒及检测方法