一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的试剂盒

技术领域

本申请属于生物检测技术领域，具体为一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的试剂盒。

背景技术

血脂异常是多种心脑血管疾病的危险因素，降低胆固醇是预防心脑血管不良事情的基石。他汀类药物具有良好的降脂作用，但往往患者的服用效果并不相同，而ApoE和SLCO1B1基因是影响他汀降脂疗效主要的遗传因素。

载脂蛋白E(apolipoprotein E，APOE)是血浆中重要的载脂蛋白之一。ApoE主要在肝脏合成、分泌和代谢，参与脂质的运输、储存及排泄，有修复组织、抑制血小板聚集、免疫调节等作用。流行病学资料表明载脂蛋白E的基因多态性对血脂浓度有明显的影响。该基因有两个功能性SNP位点：rs429358(c.388T>C)和rs7412(c.526C>T)，可以形成ε2、ε3、ε4三个等位基因，共构成ε2/2、ε2/3、ε2/4、ε3/3、ε4/3、ε4/4六种基因型。近年来研究发现，ApoE基因多态性与冠心病、老年痴呆、高胆固醇血症、脑梗塞等疾病有着密切的关系，还影响个体对特汀类药物治疗的响应。

SLCO1B1基因编码有机阴离子转运多肽OATP1B1，OATP1B1为跨膜转运蛋白，主要分布于肝脏，具有介导肝细胞膜转运内、外源性物质并对其进行代谢和消除的生理功能。SLCO1B1基因的最常见的两个突变为388A>G和rs4149056(521T>C)，SLCO1B1基因多态性将改变OATP1B1转运能力，增加他汀类药物血浆浓度，从而诱发他汀类肌肉毒性，增加横纹肌溶解症或肌病的发生风险，是导致药物疗效及不良反应差异的重要因素。

心血管疾病是基因和环境因素相互作用下的综合表现，包括生化、生理和病理过程，若能早期进行风险评估，甄别高危患者，对降低心血管疾病风险，做好早期预防及制定合适的治疗策略都有重要的指导意义。

目前，针对ApoE和SLCO1B1基因多态性的检测方法很多，如荧光定量PCR法、限制性片段长度多态性分析法、高分辨率溶解曲线法、直接测序、基因芯片等。但是这些方法基本上都操作复杂、检测周期长，且需要复杂的仪器设备、成本也较高，不适合临床推广。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Mediated Amplification,RMA)技术是一种核酸等温扩增技术，主要依赖重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种酶。RMA反应可以在37～42℃进行，整个过程在30min内即可达到检测水平。锁核酸(LockedNucleic Acid，LNA)是一种特殊的双环状寡核苷酸衍生物，其结构中核糖的2'-O位和4'-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3'-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性，提高了扩增反应中DNA分子的稳定性和亲和力。研究发现，在错配位点修饰1-3个锁核酸可明显提高单碱基错配的识别能力。LNA修饰的探针比传统的DNA探针有更高的灵敏度、稳定性、扩增效率和较低的探针浓度，是一种更为可靠的检测基因分型的方法。

本发明采用锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法(LNA-RMA法)进行ApoE和SLCO1B1基因多态性检测，更加快速、简便，能够提高单碱基突变检测的特异性和灵敏度。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的试剂盒，本申请是通过下述方案实现的：

一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的引物探针组，所述引物探针组分为两组，A组为检测ApoE 388T>C和526C>T的引物对、野生型探针和突变型探针；B组为检测SLCO1B1 388A>G和521T>C的引物对、野生型探针和突变型探针。

其中，A组的ApoE 388T>C引物和探针序列为：

上游引物：5’-AGACGCGGGCACGGCTGTCCAAGGAGCTGCA-3’；

下游引物：5’-TCGGTGCTCTGGCCGAGCATGGCCTGCACCT-3’；

野生型探针：

突变型探针：

A组的ApoE 526C>T引物和探针序列为：

上游引物：5’-AGGCCATGCTCGGCCAGAGCACCGAGGAGCT-3’；

下游引物：5’-TTGGCGCGCACCTCCGCCACCTGCTCCTTCA-3’；

野生型探针：

突变型探针：

B组的SLCO1B1 388A>G引物和探针序列为：

上游引物：5’-TGCTGGGAAATTGACAGAAAGTACTCTGGTAA-3’；

下游引物：5’-AACCTGTGTTGTTAATGGGCGAACTGTGTATA-3’；

野生型探针：

突变型探针：

B组的SLCO1B1 521T>C引物和探针序列为：

上游引物：5’-CAGCCATGAGGAACTATGAGTCCATTAGACC-3’；

下游引物：5’-ATGGTACTATGGGAGTCTCCCCTATTCCAC-3’；

野生型探针：

突变型探针：

5’-AGGAATCTGGGTCATACATGTGGATATA(CY5-dT)G

优选的，所述探针上修饰有荧光基团和淬灭基团，所述淬灭基团修饰在THF 3’端的T碱基上，荧光基团修饰在SNP位点的5’端T碱基上或SNP位点互补碱基的5’端T碱基上。

优选的，所述荧光基团用FAM、HEX、ROX或CY5修饰，所述淬灭基团用BHQ修饰。

优选的，所述探针3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。

优选的，所述探针覆盖SNP位点，在探针的SNP位点上做锁核酸(LNA)修饰。

一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的试剂盒，所述试剂盒包括含有扩增反应试剂A的检测管、含有扩增反应试剂B的检测管、缓冲液、醋酸镁、阳性对照、阴性对照。

优选的，所述扩增反应试剂A包括ApoE 388T>C上下游引物、ApoE 388T>C野生型和突变型探针、ApoE 526C>T上下游引物、ApoE 526C>T野生型和突变型探针、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。

优选的，所述扩增反应试剂B包括SLCO1B1 388A>G上下游引物、SLCO1B1 388A>G野生型和突变型探针、SLCO1B1 521T>C上下游引物、SLCO1B1 521T>C野生型和突变型探针、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。

优选的，所述引物对及检测探针组在扩增体系中的终浓度分别为10μM；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mM；所述甘露醇的终浓度为2.5mM；所述ATP的终浓度为10mM；所述dNTPs的终浓度为2mM；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/mL；所述磷酸肌酸的终浓度为25mM；所述大肠杆菌RecA蛋白的终浓度为100ng/μL；所述UvsY蛋白的终浓度为40ng/μL；所述单链结合蛋白GP32的终浓度为800ng/μL；所述Bst聚合酶的终浓度为60ng/μL；所述核酸外切酶III的终浓度为80ng/μL。

优选的，所述阳性对照为ApoE 388T>C野生型质粒和突变型质粒、ApoE 526C>T野生型质粒和突变型质粒、SLCO1B1 388A>G野生型质粒和突变型质粒、SLCO1B1 521T>C野生型质粒和突变型质粒。

优选的，所述阴性对照为无菌双蒸水。

优选的，所述试剂盒可以检测的样品为人全血或外周血样本。

一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样本DNA作为模板；

(2)设计用于ApoE 388T>C和526C>T、SLCO1B1 388A>G和521T>C基因多态性检测的引物对及探针；

(3)以提取的待测样本DNA作为模板，加入上述试剂盒中的反应试剂进行RMA扩增反应，扩增反应条件为在实时恒温荧光检测器中39℃下扩增20分钟；

(4)检测结果判定：

对于野生纯合型样本，只有野生型探针产生荧光信号，而突变型探针没有产生荧光信号，说明突变型探针对野生型模板不会产生非特异性扩增；对于突变纯合型样本，只有突变型探针产生荧光信号，而野生型探针没有产生荧光信号，说明野生型探针对突变型模板不会产生非特异性扩增；对于突变杂合型样本，突变型探针和野生型探针都产生了荧光信号。

有益效果：本发明能够快速的同时检测ApoE 388T>C和526C>T、SLCO1B1 388A>G和521T>C基因位点的多态性，具有极高的灵敏度和特异性；采用锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法(LNA-RMA法)，反应可以在37～42℃进行，对仪器设备的要求不高，操作简单，在30min内即可得到结果；整个反应过程采用全封闭形式，避免了交叉污染的可能；扩增反应试剂采用冻干工艺，提高试剂稳定性，降低运输成本；用锁核酸修饰探针能够提高单碱基突变的检测特异性，比传统的DNA探针有更高的灵敏度，适用于基因分型检测。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1ApoE 388TT野生纯合型样本检测结果；

图2ApoE 388CC突变纯合型样本检测结果；

图3ApoE 388TC突变杂合型样本检测结果；

图4ApoE 526CC野生纯合型样本检测结果；

图5ApoE 526TT突变纯合型样本检测结果；

图6ApoE 526CT突变杂合型样本检测结果；

图7SLCO1B1 388AA野生纯合型样本检测结果；

图8SLCO1B1 388GG突变纯合型样本检测结果；

图9SLCO1B1 388AG突变杂合型样本检测结果；

图10SLCO1B1 521TT野生纯合型样本检测结果；

图11SLCO1B1 521CC突变纯合型样本检测结果；

图12SLCO1B1 521TC突变杂合型样本检测结果。

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施方式作进一步地详细描述。

实施例1

1、引物和探针的设计

基于ApoE 388T>C和526C>T、SLCO1B1 388A>G和521T>C基因突变序列或其互补序列设计的LNA-RMA检测引物和探针如下表1所示；

表1 ApoE和SLCO1B1基因引物与探针序列

注：LNA修饰的突变位点碱基用斜体加粗加下划线表示；ApoE 388T>C和SLCO1B1388A>G的野生型探针的荧光基团都用FAM修饰；ApoE 388T>C和SLCO1B1 388A>G的突变型探针的荧光基团都用ROX修饰；ApoE 388T>C和SLCO1B1 388A>G的野生型探针和突变型探针的淬灭基团都用BHQ修饰；ApoE 526C>T和SLCO1B1 521T>C的野生型探针的荧光基团都用HEX修饰；ApoE 526C>T和SLCO1B1 521T>C的突变型探针的荧光基团都用CY5修饰；ApoE 526C>T和SLCO1B1 521T>C的野生型探针和突变型探针的淬灭基团都用BHQ修饰。

2、样本的提取

采用血液基因组DNA提取试剂盒提取待测样本的DNA作为模板；

3、RMA反应体系的建立

将42.5μL缓冲液和5μL提取的待测样本DNA加入到含有扩增反应试剂A的检测管中，混匀，并向检测管中加入2.5μL的280mM醋酸镁溶液并混匀；将42.5μL缓冲液和5μL提取的待测样本DNA加入到含有含有扩增反应试剂B的检测管中，混匀，并向检测管中加入2.5μL的280mM醋酸镁溶液并混匀；将两个检测管在实时恒温荧光检测器中39℃扩增20分钟；

其中，所述扩增反应试剂A包括ApoE 388T>C上下游引物、ApoE 388T>C野生型和突变型探针、ApoE 526C>T上下游引物、ApoE 526C>T野生型和突变型探针、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸；

所述扩增反应试剂B包括SLCO1B1 388A>G上下游引物、SLCO1B1 388A>G野生型和突变型探针、SLCO1B1 521T>C上下游引物、SLCO1B1 521T>C野生型和突变型探针、大肠杆菌RecA蛋白、、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸；

所述引物对及检测探针组在扩增体系中的终浓度分别为10μM；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mM；所述甘露醇的终浓度为2.5mM；所述ATP的终浓度为10mM；所述dNTPs的终浓度为2mM；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/mL；所述磷酸肌酸的终浓度为25mM；所述大肠杆菌RecA蛋白的终浓度为100ng/μL；所述UvsY蛋白的终浓度为40ng/μL；所述单链结合蛋白GP32的终浓度为800ng/μL；所述Bst聚合酶的终浓度为60ng/μL；所述核酸外切酶III的终浓度为80ng/μL；

所述阳性对照为ApoE 388T>C野生型质粒和突变型质粒、ApoE 526C>T野生型质粒和突变型质粒、SLCO1B1 388A>G野生型质粒和突变型质粒、SLCO1B1 521T>C野生型质粒和突变型质粒；

所述阴性对照为无菌双蒸水；

4、检测结果判定：

通过实时恒温荧光检测器上显示的荧光信号判断所检测的ApoE 388T>C和526C>T、SLCO1B1 388A>G和521T>C基因多态性位点。图1显示该样本为ApoE 388TT野生纯合型样本，仅野生型探针产生荧光信号，突变型探针无荧光信号；图2显示该样本为ApoE 388CC突变纯合型样本，仅突变型探针产生荧光信号，野生型探针无荧光信号；图3显示该样本为ApoE 388TC突变杂合型样本，野生型探针和突变型探针都产生荧光信号；图4显示该样本为ApoE 526CC野生纯合型样本，仅野生型探针产生荧光信号，突变型探针无荧光信号；图5显示该样本为ApoE 526TT突变纯合型样本，仅突变型探针产生荧光信号，野生型探针无荧光信号；图6显示该样本为ApoE 526CT突变杂合型样本，野生型探针和突变型探针都产生荧光信号；图7显示该样本为SLCO1B1 388AA野生纯合型样本，仅野生型探针产生荧光信号，突变型探针无荧光信号；图8显示该样本为SLCO1B1 388GG突变纯合型样本，仅突变型探针产生荧光信号，野生型探针无荧光信号；图9显示该样本为SLCO1B1 388AG突变杂合型样本，野生型探针和突变型探针都产生荧光信号；图10显示该样本为SLCO1B1 521TT野生纯合型样本，仅野生型探针产生荧光信号，突变型探针无荧光信号；图11显示该样本为SLCO1B1 521CC突变纯合型样本，仅突变型探针产生荧光信号，野生型探针无荧光信号；图12显示该样本为SLCO1B1 521TC突变杂合型样本，野生型探针和突变型探针都产生荧光信号。

以上所述仅为本申请的较佳实施例，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

序列表

<110> 济南国益生物科技有限公司

<120> 一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的试剂盒

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 载脂蛋白E(apolipoprotein E，388T>C)

<400> 1

agacgcgggc acggctgtcc aaggagctgc a 31

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 载脂蛋白E(apolipoprotein E，388T>C)

<400> 2

tcggtgctct ggccgagcta ggcctgcacc t 31

<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213> 载脂蛋白E(apolipoprotein E，388T>C)

<400> 3

aggcccggct gggcgcggac atggaggacg tgtgcggccg cctggtgca 49

<210> 4

<211> 49

<212> DNA

<213> 载脂蛋白E(apolipoprotein E，388T>C)

<400> 4

aggcccggct gggcgcggac atggaggacg tgcgcggccg cctggtgca 49

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 载脂蛋白E(apolipoprotein E，526C>T)

<400> 5

aggccatgct cggccagagc accgaggagc t 31

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 载脂蛋白E(apolipoprotein E，526C>T)

<400> 6

ttggcgcgca cctccgccac ctgctccttc a 31

<210> 7

<211> 47

<212> DNA

<213> 载脂蛋白E(apolipoprotein E，526C>T)

<400> 7

tcctccgcga tgccgatgac ctgcagaagc gcctggcagt gtaccag 47

<210> 8

<211> 47

<212> DNA

<213> 载脂蛋白E(apolipoprotein E，526C>T)

<400> 8

tcctccgcga tgccgatgac ctgcagaagt gcctggcagt gtaccag 47

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> SLCO1B1基因(SLCO1B1 388A>G)

<400> 9

tgctgggaaa ttgacagaaa gtactctggt aa 32

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> SLCO1B1基因(SLCO1B1 388A>G)

<400> 10

aacctgtgtt gttaatgggc gaactgtgta ta 32

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<211> 48

<212> DNA

<213> SLCO1B1基因(SLCO1B1 388A>G)

<400> 11

agttacaggt attctaaaga aactaatatc aattcatcag aaaattca 48

<210> 12

<211> 48

<212> DNA

<213> SLCO1B1基因(SLCO1B1 388A>G)

<400> 12

agttacaggt attctaaaga aactaatatc gattcatcag aaaattca 48

<210> 13

<211> 31

<212> DNA

<213> SLCO1B1基因(SLCO1B1 521T>G)

<400> 13

cagccatgag gaactatgag tccattagac c 31

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> SLCO1B1基因(SLCO1B1 521T>G)

<400> 14

atggtactat gggagtctcc cctattccac 30

<210> 15

<211> 49

<212> DNA

<213> SLCO1B1基因(SLCO1B1 521T>G)

<400> 15

aggaatctgg gtcatacatg tggatatatg tgttcatggg taatatgct 49

<210> 16

<211> 49

<212> DNA

<213> SLCO1B1基因(SLCO1B1 521T>G)

<400> 16

aggaatctgg gtcatacatg tggatatatg cgttcatggg taatatgct 49