一种人脐带间充质干细胞的分离培养方法及应用

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种人脐带间充质干细胞的分离培养方法及应用。

背景技术

细胞治疗的出现为当前没有有效治疗方法的疾病，提供了突破性的技术手段，例如Car-T细胞治疗肿瘤和间充质干细胞治疗免疫异常疾病。其中间充质干细胞通过旁分泌产生大量免疫调节的细胞因子，对许多免疫异常疾病都有突出疗效。

在常规的间充质干细胞分离培养过程中，由于遗传的不稳定性和过氧化物累积，导致细胞随着细胞代次增加逐渐累加基因突变，有文献报道当干细胞传代至P8以后，间充质干细胞的遗传突变将显著增加。除了干细胞的遗传突变，在临床中发现间充质干细胞表达组织因子，作为凝血因子3参与到凝血过程中，因此间充质干细胞在临床使用过程中，静脉注射间充干细可能导致血栓的发生。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人脐带间充质干细胞的分离培养方法及应用，该分离培养方法得到的人脐带间充质干细胞能够保持较高的细胞干性、CXCR4高表达以及TissueFactor表达下调，显著降低间充质干细胞静脉输注时的栓塞风险，且能够更精确的迁移至病灶部位，提高临床疗效。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明第一方面提供一种人脐带间充质干细胞的分离培养方法，所述分离培养方法包括如下步骤：

(a)从脐带组织中分离得到脐带华通氏胶；

(b)将脐带华通氏胶进行剪碎并添加含有褪黑素的无血清培养基，再置于1.5％～2.5％的O

(c)待培养结束，消化分散细胞，然后，离心、接种进行传代培养，得到人脐带间充质干细胞。

目前，传统的细胞培养条件要求CO

优选地，所述步骤(b)中，脐带华通氏胶剪碎至1～3mm

优选地，置于1.5％～2.5％O

将剪碎的脐带华通氏胶进行平铺，并置于1.5％～2.5％的O

优选地，所述步骤(b)中，弃掉脐带华通氏胶碎块并继续培养包括：

弃掉脐带华通氏胶碎块后，添加含有褪黑素的无血清培养基继续培养2～3天。

优选地，所述含有褪黑素的无血清培养基中褪黑素的浓度为5～15μM。

优选地，所述步骤(a)中，从脐带组织中分离得到脐带华通氏胶包括：

将离体人脐带组织置于含有抗生素、褪黑素和海藻糖的DMEM培养基中保存运输，时间不超过42～55h，采用PBS进行冲洗并剔除动静脉血管；

优选地，含有抗生素、褪黑素和海藻糖的DMEM培养基中抗生素浓度为100U/mL～200U/mL，褪黑素浓度为2～4mM，海藻糖浓度为0.5％～2％。

优选地，所述抗生素为青霉素和链霉素，且青霉素和链霉素的终浓度为100U/mL。

优选地，所述步骤(c)中，消化分散细胞包括：

采用0.05％Try-EDTA的消化液消化细胞，待细胞有长梭形逐渐变圆并飘起时，用含10μM褪黑素的无血清培养基终止消化；

优选地，接种密度为8000～12000cell/cm

优选地，所述分离培养方法还包括：

步骤(d)采用体积比为10％DMSO+90％FBS的溶液重悬人脐带间充质干细胞，然后进行细胞程控降温，再转移至液氮中长期保存；

优选地，重悬后的人脐带间充质干细胞浓度为(1～5)×10

本发明第二方面提供一种上述分离培养方法得到的人脐带间充质干细胞在制备人脐带间充质干细胞注射液中的应用。

本发明第三方面提供一种人脐带间充质干细胞注射液，包括上述分离培养方法得到的人脐带间充质干细胞。

与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：

本发明上述分离培养方法对人脐带间充质干细胞低氧处理并联合褪黑素抗过氧化处理，使收获的人脐带间充质干细胞产生更多免疫调节的细胞因子和趋化受体，人脐带间充质干细胞冻存复苏后收获的细胞活力更高，更为重要是本发明制备的人脐带间充质干细胞制剂能够降低干细胞组织因子的表达，从而降低干细胞静脉注射过程导致的血栓风险，进而本发明制备的干细胞制剂能够更好的适用于免疫系统疾病，并且更加安全有效。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。

图1为本发明实施例2中不同实验组的原代细胞收获细胞数；

图2为本发明实施例2中不同实验组的细胞活力；

图3为本发明实施例3中流式细胞术检测P5代细胞CD142阳性率结果；

图4为本发明实施例3中流式细胞术检测P5代细胞CD184阳性率结果；

图5为本发明实施例4中不同培养方法血浆凝固时间。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。

实施例1

本实施例为一种人脐带间充质干细胞的分离培养方法，该分离培养方法包括如下步骤：

(a)采集符合标准的脐带组织，将离体人脐带组织置于含有抗生素(抗生素为青霉素和链霉素，且终浓度分别为100U/mL)、3mM褪黑素和1％海藻糖的DMEM培养基中，在4℃保存运输，48h内进行组织处理；然后采用PBS进行冲洗并使用手术剪剔除动静脉血管，剩余组织即为脐带华通氏胶；

(b)将脐带华通氏胶置于培养皿中，并添加10mL的含10μM褪黑素的无血清培养基(无血清培养基为SFM基础培养基)，再用组织专用剪将脐带华通氏胶剪碎至1～3mm

(c)待培养结束，弃除培养皿中的培养基，并使用PBS冲洗2次，再用0.05％Try-EDTA的消化液消化细胞，待细胞由长梭形逐渐变圆并飘起时用含10μM褪黑素的无血清培养基终止消化，离心后按照10000cell/cm

步骤(d)采用体积比为10％DMSO+90％FBS的溶液重悬人脐带间充质干细胞，细胞浓度为3×10

实施例2

本实施例为人脐带间充质干细胞培养过程中细胞数量及活力的研究

研究方法为：

(a)将实例1收获的细胞作为实验组，并且在实例1中分离培养的干细胞的同时，设置干细胞非处理对照组，即干细胞在分离培养过程培养基不添加褪黑素，并且不采用低氧方式培养细胞，其余操作均与实例1相同。细胞培养20天后，收获并冻存细胞。

(b)采用37度水浴快速复苏冻存的实验组干细胞和对照组干细胞。

(c)细胞数量及活力检测按照细胞自动计数仪方法获得。

整个脐带间充质干细胞分离培养过程中，比较原代收获的细胞数量，见图1，由图1数据表明实验组细胞数量显著大于对照组细胞数量。

细胞冻存复苏后实验组细胞活力显著大于对照组细胞活力，见图2，实验表明经褪黑素联合低氧处理的间充质干细胞保持着较高的细胞活力。

实施例3

本实施例为流式细胞术检测不同培养方法得到的人脐带间充质干细胞的组织因子和趋化因子表达：

(1)按照表一，取1.5*10^6细胞，1500rpm离心7min。弃上清，加入4mL PBS重悬细胞，1500rpm离心7min。再加入1.5mLPBS重悬细胞，使用尼龙网过滤细胞悬液。

(2)取4支流式上机试管，标记1～4，预先加入流式抗体组合(使用移液器添加抗体至上机试管的底部不同位置，防止流式抗体交叉)。

(3)每支上机试管添加100μL细胞(至少1.0*10^5细胞)，细胞使用300目(40μM)细胞筛过滤，充分震动混匀抗体和细胞悬液，可以瞬时离心使管壁细胞沉到管底。4度避光孵育30min。

(4)加入2mL PBS重悬，1500rpm离心7min收集细胞。后加入200μL PBS重悬细胞后上机检测。

表一：间充质干细胞组织因子和趋化因子流式检测抗体组合表

流式检测结果见图3显示，褪黑素联合低氧处理的脐带间充质干细胞CD142阳性率显著低于常规方法获得的干细胞，P值＝0.037，结果呈显著性差异，数据表明本方案获得的干细胞具有较低的血栓风险；图4显示，褪黑素联合低氧处理的脐带间充质干细胞CD184阳性率显著高于常规方法获得干细胞，P值＝0.042，结果呈显著性差异，数据表明本方案获得的干细胞趋化能力提高。

实施例4

本实施例为不同培养方法得到的人脐带间充质干细胞的促凝血研究

(1)向1.5mL EP管加入1mL血浆，2.0*10^6干细胞。

(2)加入50μL注射用CaCl

(3)记录血浆凝固时间，以倒扣EP管血浆不回流为标准。

以血浆+CaCl2为对照组，常规方法获得的细胞及褪黑素联合低氧处理的细胞为实验组。

分析检测数据发现，常规方法获得细胞凝血时间较对照组有所减少，表明间充质干细胞有一定的促凝血作用；而褪黑素联合低氧处理的间充质干细胞较对照组凝血时间明显延长；对实验结果做统计学分析见图5得出P值<0.0001，故本发明方法获得间充质干细胞具有较低凝血作用，此间充质干细胞在静脉输注方面具有更好的临床安全性。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。