一种提高高原人群运动潜能的微生物组合物及其应用

技术领域：

本发明涉及一种提高高原人群运动潜能的微生物组合物及其应用，属于生物医药技术领域。

背景技术：

人体肠道中存在大量的共生菌群，其数量超过1000万亿个，大约是人体细胞总数的10倍。同时肠道内微生物基因的数量约为300万个，大约是人类基因组基因数量的100多倍，如此海量的微生物形成了与人体密不可分的共生关系，能够帮助人群适应多变的环境。人体内微生态环境与人体健康密切相关，微生态环境的改变会影响人体的临床指标。维持人体内微生态环境的稳定有利于维护人体的身体健康。可以通过补充益生菌来帮助维护肠道微生态环境的稳定，预防和治疗疾病，提高人体机能。

中国专利文献CN109504615A(申请号：CN201811074629.5)公开了单形巨单胞菌(Megamonas funiformis)及其应用，该发明中提到补充Megamonas funiformis菌种有益人体心血管健康。

迄今为止，尚未见肠道中同时补充Veillonella atypica菌种和Megamonasfuniformis菌种有利于提高上高原人群的运动潜能的报道。

发明内容：

针对现有技术的不足，本发明提供了一种提高高原人群运动潜能的微生物组合物及其应用，本发明中的微生物组合物有助于提高高原人群的运动潜能。

术语说明：

Veillonella atypica：非典型韦荣球菌，

Megamonas funiformis：单形巨单胞菌。

本发明的技术方案如下：

一种提高高原人群运动潜能的微生物组合物，所述微生物组合物包括安全有效剂量的Veillonella atypica和Megamonas funiformis菌种。

根据本发明优选的，所述微生物组合物还包括食品上或药学上可接受的载体。

根据本发明优选的，所述高原人群为汉族人群。

根据本发明优选的，所述微生物组合物为口服制剂。

根据本发明优选的，所述微生物组合物为粉末剂、散剂、片剂、糖衣剂、胶囊剂、颗粒剂、悬浮剂、溶液剂、糖浆剂、滴剂、舌下含片、或其组合。

上述微生物组合物在提高高原人群运动潜能中的应用。

根据本发明优选的，所述高原人群为汉族人群。

一种提高高原人群运动潜能的方法，所述方法为给高原人群施用上述微生物组合物。

根据本发明优选的，所述高原人群为汉族人群。

有益效果：

本发明研究了高原汉族人群和平原汉族人群肠道微生物菌群的差异，发现Veillonella atypica菌种和Megamonas funiformis菌种在高原汉族人群和平原汉族人群之间差异显著，并且Veillonella atypica菌种和Megamonas funiformis菌种与和人群运动潜能有关的临床指标密切相关，因此本发明提供了一种包含Veillonella atypica菌种和Megamonas funiformis菌种的微生物组合物，通过施用该微生物复合物，可针对性的提高高原汉族人群的运动潜能。

附图说明

图1为三组人群肠道中Veillonella atypica菌种丰度的箱式图；图中，Han1000为平原汉族人群，H4A4为一周内的高原汉族人群，H4LB为两个月以上的高原汉族人群；

图2为三组人群肠道中Megamonas funiformis菌种丰度的箱式图；图中，Han1000为平原汉族人群，H4A4为一周内的高原汉族人群，H4LB为两个月以上的高原汉族人群；

图3为三组人群临床指标GLU(血糖)的箱式图；图中，Han1000为平原汉族人群，H4A4为一周内的高原汉族人群，H4LB为两个月以上的高原汉族人群；

图4为三组人群临床指标TESTO(睾酮)的箱式图；图中，Han1000为平原汉族人群，H4A4为一周内的高原汉族人群，H4LB为两个月以上的高原汉族人群；

图5为三组人群临床指标CORT(皮质酮)的箱式图；图中，Han1000为平原汉族人群，H4A4为一周内的高原汉族人群，H4LB为两个月以上的高原汉族人群；

图6为三组人群临床指标TP1NP(总I型胶原氨基端延长肽)的箱式图；图中，Han1000为平原汉族人群，H4A4为一周内的高原汉族人群，H4LB为两个月以上的高原汉族人群；

图7为三组人群临床指标CK(肌酸激酶)的箱式图；图中，Han1000为平原汉族人群，H4A4为一周内的高原汉族人群，H4LB为两个月以上的高原汉族人群；

图8为三组人群临床指标pro_BNP(脑利钠肽前体)的箱式图；图中，Han1000为平原汉族人群，H4A4为一周内的高原汉族人群，H4LB为两个月以上的高原汉族人群。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

本发明中涉及的微生物均为现有菌种，可从市场购得，不涉及微生物保藏。

研究对象：根据STROBE声明设计病例对照研究，纳入某年某月至某年某月在中国某部队的45个在海拔3500米高原以上服役一周以内的汉族男性士兵为实验组1，22个在海拔3500米高原以上服役两个月以上的汉族男性士兵为实验组2，根据实验组士兵年龄匹配96个平原汉族士兵进行对照。严格控制三组人群进行相同的中国部队混合饮食，保持相同的训练环境和训练强度，戒烟、酒，持续3个月。排除有慢性炎性疾病、口服抗生素、急性感染和胃肠道疾病的士兵。

每一个研究对象在纳入后均收到一个马桶粪便收集器，在排出大便后将大便装入粪便收集管，即刻保存在-20℃冰箱，次日将粪便标本转运至-80℃冰箱保存，统一进行检测。

实施例1平原汉族人群和高原汉族人群差异菌群的确定

1.1粪便样品DNA提取

吸取1000μL CTAB裂解液至2.0mL EP管中，加入溶菌酶，将500μL的粪便样品加入裂解液中，65℃水浴20min，期间颠倒混匀数次，以使样品充分裂解。离心取上清，加等体积苯酚(pH8.0)：氯仿：异戊醇(25：24：1体积比)混合液，颠倒混匀，12000rpm离心10min，取上清，加等体积氯仿：异戊醇(24:1体积比)混合液，颠倒混匀，12000rpm离心10min，吸取上清至1.5mL离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，上下摇晃，-20℃沉淀过夜。12000rpm离心10分钟，倒出液体，注意不要倒出沉淀。用1mL 75％乙醇洗涤沉淀2次，超净工作台吹干或者室温晾干。加入ddH

1.2PCR扩增、混样和纯化

以稀释至1ng/μL的基因组DNA为模板，根据测序区域16S V3-V4，选择使用带Barcode的特异引物515F和806R，New England Biolabs公司的

PCR产物使用2％的琼脂糖凝胶进行电泳检测；根据PCR产物浓度进行等量混样,充分混匀后使用1×TAE、2％的琼脂糖凝胶电泳纯化PCR产物，切胶回收目标条带。产物纯化试剂盒使用的是Thermo Scientific公司GeneJET胶回收试剂盒回收产物。

1.3文库构建和上机测序

使用Thermo fisher公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48rxns建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit定量和文库检测合格后，使用Thermofisher的Ion S5TMXL进行上机测序。

1.4数据分析

1.4.1测序数据处理

使用Cutadapt(V1.9.1,http://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/)先对reads进行低质量部分剪切，再根据Barcode从得到的reads中拆分出各样品数据，截去Barcode和引物序列初步质控得到原始数据，经过以上处理后得到的Reads需要进行去除嵌合体序列的处理，Reads序列通过与物种注释数据库进行比对检测嵌合体序列，并最终去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据。

1.4.2OTU聚类和物种注释

利用Uparse软件(Uparse v7.0.1001，http://www.drive5.com/uparse/)对所有样品的全部有效数据进行聚类，默认以97％的一致性将序列聚类成为OTUs(OperationalTaxonomic Units)，同时会选取OTUs的代表性序列，依据其算法原则，筛选的是OTUs中出现频数最高的序列作为OTUs的代表序列。对OTUs序列进行物种注释，用Usearch方法与rdp_16s_sp.udb数据库进行物种注释分析(设定阈值为0.8～1)，获得分类学信息并分别在属水平统计各样本的群落组成。

1.4.3菌属丰度计算和差异比较

用the Chao1估计量表示菌属丰度，绘制箱图对比三组人群中相关菌属/菌种丰度的差异，差异比较因为样本非正态分布采用Kruskal-Wallis检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

1.5测序结果

平原汉族人群和高原汉族人群粪便样本中Veillonella atypica菌种和Megamonas funiformis菌种丰度差异显著。

其中，三组人群中Veillonella atypica菌种的五分位数结果如图1所示，比较中位数发现，平原汉族人群中Veillonella atypica菌种丰度最高，一周内的高原汉族人群的Veillonella atypica菌种丰度最低，两个月后的高原汉族人群的Veillonella atypica菌种丰度有所回升；这说明汉族人群上高原后的适应性变化；Kruskal-Wallis数值显示三组数据有明显差异；

三组人群中Megamonas funiformis菌种的五分位数结果如图2所示，比较中位数发现，平原汉族人群中Megamonas funiformis菌种丰度最高，一周内的高原汉族人群相对平原汉族人群中Megamonas funiformis菌种丰度剧烈降低，两个月后的高原汉族人群的Megamonas funiformis菌种丰度剧烈升高；这显示了汉族人群上高原后的适应性变化；Kruskal-Wallis数值显示三组数据有明显差异。

实施例2平原汉族人群和高原汉族人群临床指标的确定

临床指标是由血液样本测得。血液样本是用EDTA-K2采集晨空腹静脉血(8mL)。血样以4000r/min离心10min，分离血浆，-80℃保存至301医院(北京，海拔约40米)测定。使用血液学分析仪(Roche-cobas6000，美国)测定76项临床试验项目，使用2毫升血浆。此外，1.5mL血浆用于11种酶联免疫吸附试验(ELISA)(Expand Bio,China)。临床数据共涵盖76项指标。

图3-图8显示了临床指标中GLU(血糖)，TESTO(睾酮)，CORT(皮质酮)，TP1NP(总I型胶原氨基端延长肽)，CK(肌酸激酶)和pro_BNP(脑利钠肽前体)的五分位数结果。根据临床研究，GLU(血糖)的降低会造成低血糖并影响人的运动水平；TESTO(睾酮)与人体中氧利用水平有关，这个指标的升高与高原反应有关；CORT(皮质酮)和CK(肌酸激酶)两项指标在激烈运动的人群体内会出现反常；TP1NP(总I型胶原氨基端延长肽)与骨密度有关，也会间接影响人体运动水平；pro_BNP(脑利钠肽前体)与心脏功能有关。Kruskal-Wallis数值显示，GLU(血糖)，TESTO(睾酮)，CORT(皮质酮)，TP1NP(总I型胶原氨基端延长肽)，CK(肌酸激酶)和pro_BNP(脑利钠肽前体)水平在三组人群中均有明显差异。上高原后的汉族人群体内的GLU(血糖)水平会下降，相对平原汉族人体中的血糖水平表现出不稳定；TESTO(睾酮)在上高原的人群中出现异常升高；CORT(皮质酮)和CK(肌酸激酶)都在刚上高原的人群中出现降低，在上高原一段时间后的人群体内出现回升，可能与高原适应有关；TP1NP(总I型胶原氨基端延长肽)水平在上高原的人群体内相对平原人群体内的水平会降低；pro_BNP(脑利钠肽前体)在刚上高原的人群中会反常升高，可能与高原适应性有关，在上高原一段时间的人群体内又剧烈降低。

实施例3菌群与临床指标之间的关系

采用R软件进行spearman关联分析，研究Veillonella atypica菌种和Megamonasfuniformis菌种与临床指标之间的关联关系，研究结果如表1和表2所示。

表1.Veillonella atypica菌种与临床指标的spearman关联分析结果

表2.Megamonas funiformis菌种与临床指标的spearman关联分析结果

以上结果显示，Veillonella atypica菌种和Megamonas_funiformis菌种与人群临床指标之间有较强关联关系。其中，Veillonella atypica菌种与GLU(葡萄糖)、CORT(皮质醇)、TP1NP(总I型胶原氨基端延长肽)和CK(肌酸激酶)呈正相关，与TESTO(睾酮)呈负相关；Megamonas funiformis菌种与Pro BNP(脑利钠肽前体)有正相关关系。

结合实施例2与实施例3的结果表明，补充Veillonella atypica菌种和Megamonasfuniformis菌种有助于稳定人体内微生态环境稳定，并进一步帮助稳定临床指标，保护人体健康，增强高原适应性，并最终提高高原汉族人群的运动潜能。