与溶酶体贮积症的测试相关的化合物和方法

本申请是分案申请，原申请的申请日为2014年3月17日，申请号为201480027876.3，发明名称为“与溶酶体贮积症的测试相关的化合物和方法”。

本申请取决于2013年3月15如提交的美国临时申请第61/789,985号且要求所述申请的优先权，所述申请的内容以全文引用的方式并入本文中。

技术领域

本说明书涉及检测酶活性以检测溶酶体酶活性的分析型试剂。

背景技术

溶酶体贮积症为一组遗传性病症，其特征为身体中缺乏特定酶，导致身体不能分解代谢物质。举例来说，法布立病(Fabry disease)为每40,000人中见于一人的溶酶体贮积症。其由酶α-半乳糖苷酶的缺乏造成，所述缺乏导致身体不能分解称作神经酰胺三己糖苷(globotriaosylceramide)的特定脂肪物质。第二实例为戈谢病(Gaucher disease)，由不能分解称作葡糖神经酰胺(也被称为葡糖脑苷脂)的脂肪物质或脂质造成的溶酶体贮积症。患有戈谢病的个体不制造葡糖脑苷脂酶，分解这些脂肪物质所需的酶。这些脂肪物质随后积聚在肝、脾和骨髓细胞中。第三实例为蓬佩病(Pompe disease)，由缺乏分解某些称作肝糖的糖所需的酶酸性α-葡糖苷酶造成的溶酶体贮积症。当酶酸性α-葡糖苷酶缺失时，肝糖积聚在身体中的各种组织和器官中。

溶酶体贮积症主要为儿童病症，尽管一些显现在成人期。在大部分所述病症中，患者在出生时正常且在一些时间以后开始具有进展性神经恶化。临床表现型取决于生化缺陷的类型和严重程度。这些溶酶体病症中的一些，如蓬佩病和克拉培病主要显现于婴儿期。已持续努力开发在临床症状发作之前检测此类病症以使得可以起始治疗性干预的方法。

在过去的十年里，测试代谢病症的实验室已将串联质谱引入到其新生儿筛选程序中。串联质谱持续在诊所中受到欢迎，因为此技术允许在单一样品中检定多种代谢物。举例来说，此技术已实施为使用干燥血点样品检测新生儿中的遗传代谢病症的常规临床实践。尽管溶酶体酶活性可以使用串联质谱定量，但由于可溶性问题和并入外标的需要，公布的检定方法已略微难以适应临床配置。

因此，仍需要用于检测溶酶体病症的改进的方法和组合物。

发明内容

提供以下发明概述以促进对本发明特有的创新性特征中的一些的理解且不打算为完整描述。本发明的各种方面的完整理解可以通过将整个说明书、权利要求书、附图和摘要作为整体来获得。

提供使用如质谱的检测系统检测酶促反应的改进的组合物和方法。这些组合物提供在水性溶剂系统中的提高的可溶性和/或与目标酶的提高的反应性，进而提高检定效率、再现性和精确性。

本发明提供适用于评估样品中的溶酶体酶活性水平的化合物。测试溶酶体酶活性例如在新生儿中筛选代谢病症时以及在评估具有影响酶活性的医学病况的个体或经历如替代疗法、基因疗法或骨髓移植的医学治疗的个体时适用。本文所述的化合物包括用于目标酶的底物和适用作酶检定中的对照物或标准物的相关分子。

本发明的一个目标为提供适合于检测酶，说明性地由于缺乏而导致溶酶体贮积症的酶的活性的底物。提供具有以下通式的底物：

其中A为单糖或二糖；B1为：C

还提供通式II的化合物，

其类似地适用作检测溶酶体贮积症的底物。根据式II，A为醛己糖或酮己糖；R

还提供适合于检测溶酶体贮积症存在或不存在或仅检测包括式III结构的酶存在或不存在的底物：

其中A为单糖或二糖；B1为：C

R

应了解，在以上或另外包括本发明的底物的各者中的任一个中，A任选地为醛己糖或酮己糖，任选地通过和α或β糖苷键连接到分子的其余部分。任选地，A为D-葡萄糖或D-半乳糖。

在一些实施例中，根据式III的底物包括：

还提供包括以下的底物：

本发明的底物中的任一个任选地包括元素或其它标签的稳定次普遍同位素。在一些实施例中，稳定次普遍同位素在每次出现时选自由以下组成的群组：

本发明的另一目标为提供可以具有酶功能的抑制剂、用于检测酶活性的方法的内标或治疗剂形式使用的分子。此类分子任选地包括式V结构：

其中B1选自由以下组成的群组：C

本发明的分子中的任一个任选地包括元素或其它标签的稳定次普遍同位素。在一些实施例中，稳定次普遍同位素在每次出现时选自由以下组成的群组：

还提供检测酶的存在、不存在或含量以检测受试者中存在或不存在酶缺乏的方法。酶任选地为所述酶的缺乏导致溶酶体贮积症的酶。在检测酶的存在、不存在或含量的方法中使用式I-VI的组合物允许来自水性溶剂系统中的酶的提高的可溶性的检定结果的提高的可信度。检测酶活性的方法包括在其中目标酶能够作用于底物以产生酶促产物的条件下接触含有目标酶的样品与任一本文所述的底物或其等效物；和检测酶促产物。任选地，所述目标酶为酸性β-葡糖脑苷脂酶且所述底物具有式I，其中所述B2为C

任选地，用于检测酶活性的方法中的底物为以下中的任何一个或多个的底物：化合物1至80，任选地1或7，或其任何组合。任选地，方法包括在接触步骤期间或之后添加内标到反应溶液中。此类内标任选地为任何组合物81-86的标准物。

检测步骤任选地通过质谱，任选地通过多反应监测，如在MS/MS中。检测步骤任选地通过免疫检定、HPLC、质谱或其它用于检测具有小于1000道尔顿(Dalton)的分子量的分子的合适的方法。

附图说明

图1A说明根据一个实施例的底物的NMR分析；

图1B说明根据一个实施例的第二底物的NMR分析；

图2为突出显示结构部分的示例性底物结构；

图3为突出显示结构部分的示例性底物结构；

图4说明示例性底物结构和对应示例性内标结构；

图5为使用示例性底物的一般酶促反应流程；且

图6为在检测溶酶体贮积症的分析型程序中比较本发明的底物的性能(散列的)与现有技术底物的性能(格子花纹的)的实验结果的图示。

具体实施方式

特定实施例的以下描述在本质上仅为示例性的且决不打算限制当然可以变化的本发明的范围、其应用或用途。组合物或方法关于本文中包括的非限制性定义和术语进行描述。这些定义和术语不设计成作为对本发明的范围或实践的限制，而是呈现为仅用于说明性和描述性目的。尽管方法或组合物描述为个别步骤或使用特定材料的顺序，应了解，步骤或材料可以是可互换的，使得本发明的描述可以包括以所属领域的技术人员易于理解的多种方式安排的多个部分或步骤。因此，应了解，以下组合物的各种元素任选地彼此经取代，如任何A元素可与任何其它A元素互换，任何B1元素可经任何其它B1元素取代，任何B2元素可经任何其它B2元素取代；任何B3元素可经任何其它B3元素取代，任何R

本文中所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，且并不意欲是限制性的。如本文所用，除非内容另外清楚地指出，否则单数形式“一(a/an)”和“所述”意图包括复数形式，包括“至少一”。“或”意指“和/或”。如本文所用，术语“和/或”包括相关联所列项目中的一个或多个的任何以及所有组合。将进一步理解，术语“包含(comprises/comprising)”或“包括(includes/including)”在用于本说明书中时指定所述特征、区域、整数、步骤、操作、元件和/或组件的存在，但是并不排除一个或多个其它特征、区域、整数、步骤、操作、元件、组件和/或其群组的存在或添加。术语“或其组合”意指包括前述要素中的至少一个的组合。

除非另外定义，否则本文中所用的所有术语(包括技术和科技术语)具有与本发明所属领域的技术人员的通常所理解相同的含义。应进一步理解，术语(例如在常用词典中所定义的那些术语)应被解释为具有与其在相关技术以及本发明的上下文中的含义一致的含义，并且不应以理想化或过度形式化意义进行解释，除非本文中明确地这样定义。

提供的组合物适用作检测水解酶酶活性，如与溶酶体贮积症相关的溶酶体酶活性的分析型试剂。通过应用酶底物和比先前鉴别的组合物容易得多地可溶解于适用于如质谱、HPLC和免疫检定的分析型方法的溶液中的适用作实验对照物或标准物的相关化合物，检测与溶酶体贮积症相关的酶活性更实用且较不繁琐。

与为溶酶体酶的目标的底物有关的组合物任选地包括：酸性β-葡糖脑苷脂酶(ABG)、半乳糖脑苷脂β-半乳糖苷酶(GALC)。这些酶对底物的作用用于测量样品中的对应酶活性，且因此这些底物可以用于检测以下溶酶体贮积症：戈谢(Gaucher)(ABG)；和克拉培(Krabbe)(GALC)。

一种底物具有以下通式：

其中A为单糖或二糖；B1为：C

底物对特定溶酶体酶的特异性部分由糖部分A，如为单糖或二糖的A的结构变异提供，且在一些实施例中由采用的特定糖部分提供。示例性糖部分包括用于检测戈谢病的β-D-葡萄糖，和用于检测克拉培病的β-D-半乳糖。单糖任选地藉由α或β糖苷键连接到分子的其余部分。其它示例性糖部分包括(但不限于)阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖、果糖、阿洛酮糖、山梨糖和塔格糖，各自呈D或L构型。

B

B

在一些实施例中，B

组合物的一个特征为其不需要携有用于特定检测程序，如质谱中的季铵基团。B

底物在质谱分析期间的特异性也可以由B

底物在结构上通过B

在一些实施例中，底物具有以下结构：

其中A为单糖或二糖且经由糖苷键连接到分子的其余部分；R

在一些实施例中，底物具有以下结构：

其中A为单糖或二糖；B1为：C

还提供检测酶活性的方法。特定酶的活性可以通过其作用于同源底物以产生酶促产物的能力或速率评估。在式I-III的底物的情况下，目标酶的作用导致产生两种产物：A(和/或A-H，由于如图5中所示，糖基通常以第一碳上的-OH基团留下)和HO-脂肪酸部分(B)，由于如图5中所示，B部分也通常以羟基化形式留下。通过确定样品中的酶促产物的量，可以确定目标酶的活性。对于需要酶促产物的定量评估的应用，如在下文中更详细地描述且任选地经标记的对应于式I-III的非A部分的已知量的内标可以包括于样品中。

个体的血液中的某些溶酶体酶的活性可以用于测试个体是否具有溶酶体贮积症。因此，提供底物以检测医学病况，尤其是溶酶体贮积症，如戈谢病和克拉培病。对于检测戈谢病，示例性糖部分为β-D-葡萄糖且示例性脂肪酸部分(例如B

底物可以关于鉴定多种酶，确切地说与疾病病况或先天缺陷相关的酶，或另外适用于医学目的的酶进行调适。此类调试为可能的，因为多种单糖和二糖基团可以存在于通式I的A处。即使对于新鉴别的目标酶，一旦使用常规方法确定其对于单糖和/或二糖基团的特异性，底物可以使用本文提供的指导容易地制备。可以使用如本文所述的底物检定的酶的非限制性实例包括酸性β-葡糖脑苷脂酶、半乳糖脑苷脂α-半乳糖苷酶和酸性神经磷脂酶。

如所预想，可以用不同糖合成底物，所述糖各自对特定溶酶体酶具有特异性，且各自具有子基团B

本发明提供充当适用于评估样品或样品容器中的酶促产物的量的实验对照物或标准物的化合物。为了用于质谱方法中，对应于特定底物的内标在结构上与其酶促产物(即脂肪酸部分)相同，除了内标在质荷比(m/z)中不同。因此，如所提供的内标包括酶促产品的经修饰形式，例如酶促产品的稳定同位素标记类似物，其中一个或多个原子经对应原子同位素置换以与对应酶促产物产生可差异地检测的质量差异。当内标和酶促产物通过质谱进行分析时，所得谱展现内标和酶促产物的空间分离，所述内标和酶促产物各自由其自身的波峰表示。内标的已知量由其已知m/z比处的峰量值反映。酶促产物的量可以通过其已知m/z处的峰量值相对于内标的峰量值的比较评估。产生内标的同位素标记的实例为用

在一些实施例中，底物标记有可检测标签或重原子标签。可能发现可检测标签与B

底物可以多种物理形式，例如在溶液中以及连接或固定到固体载体来使用。固体载体可以包含天然或合成材料、有机或无机材料，如聚合物、树脂、金属或玻璃和其组合。合适的固体载体可以具有多种物理形式，其可以包括例如膜；柱；中空体、固体、半固体、含孔隙或空腔粒子，如珠粒；凝胶；纤维，包括光纤材料；基质和样品容器。样品容器的非限制性实例包括样品孔、管、毛细管、小瓶和任何其它能够容纳样品的容器、凹槽或凹痕。样品容器可以包含于多样品平台上，如微量板、载玻片、微流体装置等。许多合适的粒子为所述领域中已知的且说明性地包括

当检定形式需要使用固体载体时，示例性胺封端的B

本文中所描述的方法和提供的组合物可以多重形式进行以同时检定多个样品。说明性多重形式涉及使用物理和/或化学编码的粒子。以多重形式使用编码粒子已例如描述于US 6,649,414和US 6,939,720中。由于编码允许粒子彼此区分，多个相异的粒子可以存在于单一反应混合物中，允许同时分析多个不同样品或不同酶。取决于使用者的实验目标，粒子上的编码可以例如对应于样品来源、待检定的特定酶、存在的特定底物等。

适用于提供的方法中的样品含有或疑似含有一种或多种目标酶。目标酶可以包含于获自个体的样品中，以及来自实验室材料，如细胞系，和合成蛋白源。示例性样品来源说明性地包括：组织匀浆；细胞培养溶解物；和生物流体，包括尿液、液体或无水形式的血液、泪液、唾液和脑脊髓液。样品可以另外在必要时分馏为含有特定细胞类型的馏份。举例来说，血液样品可以分馏为血清或馏份，其含有特定类型的血细胞，如红细胞或白细胞(白血球)。必要时，样品可以是来自受试者的样品的组合，如组织和流体样品等的组合。在一个特定实施例中，样品为血液，其可以例如是全血或其血液馏份，或复水自干燥血液样品。

获得保留样品中的分子的活性或完整性的样品的方法为所属领域的技术人员众所周知。此类方法包括使用适当缓冲剂和/或抑制剂，包括核酸酶、蛋白酶和磷酸酶抑制剂，其保留样品中的分子变化或使其最小化。此类抑制剂包括例如螯合剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇双(P-氨乙基醚)N,N,N1,Nl-四乙酸(EGTA)，蛋白酶抑制剂，如苯基甲基磺酰氟(PMSF)、抑肽酶、抗纤维蛋白溶酶肽、抗蛋白酶等，和磷酸酶抑制剂，如磷酸酯、氟化钠、钒酸盐等。分离分子的适当缓冲剂和条件为所属领域的技术人员众所周知且可以取决于例如待表征的样品中的分子类型而变化(参见例如奥斯贝(Ausubel)等人最新分子生物学实验方法汇编(Current Protocols in Molecular Biology)(第47增刊),纽约约翰·威利父子公司(John Wiley&Sons,New York)(1999)；哈洛(Harlow)和兰尼(Lane),抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)(冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press)(1988)；哈洛和兰尼,使用抗体：实验室手册(Using Antibodies:ALaboratory Manual),冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)(1999)；蒂茨临床化学教科书(Tietz Textbook of Clinical Chemistry),第3版伯蒂斯(Burtis)和阿什伍德(Ashwood)编费城W.B.桑德斯出版社(W.B.Saunders,Philadelphia),(1999))。样品也可以经处理以消除干扰物质的存在或使其最小化。

当从新生儿和儿童患者筛选血液时，通常使用呈干燥血点形式的样品。为了制备这些样品，血液收集且保持于滤纸上。为了进行分析，干血从滤纸洗脱为水溶液，其总体上含有缓冲液，如磷酸盐缓冲盐水和蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂条件的特定实例包括例如以下中的一个或多个：50到400μg/ml的最终浓度的AEBSF盐酸盐，0.2到25mg/ml的最终浓度的EDTA二钠脱水物，0.5到1μg/ml的最终浓度的抗纤维蛋白溶酶肽半硫酸盐，和0.5到1μg/ml的最终浓度的胃酶抑素A。可使用已知通常用于所属领域中的蛋白酶抑制剂混合液。使用通用检定溶液提取单一干燥血液样品，或其它类型的样品以后续分布到多个检定反应中可以用于自动和高通量筛选。干燥样品的单一提取避免从相同样品获得若干样品部分，或收集其它样品来源的等分试样的需要且因此降低由滤纸上的血液的不均匀分布和样品转移中的差错造成的变化。当使用干燥样品时，提取效率可能随着分析的不同酶而变化。在这些和其它类型的样品中，目标酶在包含于不同检定溶液中时可以具有不同活性水平。任选地选择通用检定溶液的组合物以使得待测试的每一酶为活性的。

在一些实施例中，在通过一种或多种检测方法检测之前，干血点或衍生自其的穿孔直接放置到包括一种或多种底物和任选的内标的检定缓冲液中且允许持续足以允许存在于样品中的酶将底物转化为产物的时间培育。

提供的底物和产物可以多种检定形式使用。底物可以在需要在酶检定期间观测底物消耗时在检定中检测，而产物可以在需要在酶检定期间观测其形成时在检定中检测。底物和产物两者可以在需要从两个视角观测酶促反应，例如以证实产生的产物的量与消耗的底物的量相关时检测。

举例来说，底物或产物的量可以使用确立的串联质谱程序检测。采用质谱的示例性酶检定可以如下进行。持续允许形成酶促产物的时段用底物培育样品。在培育期期间，底物通过存在于血液样品中的目标酶裂解以形成对应的产物。反应随后通过添加沉淀蛋白质组分的试剂淬灭。示例性试剂包括醇、乙腈和稀三氟乙酸。一部分培育混合物随后转移到新检定容器。任选地，可以添加稀释试剂，如甲醇、乙腈、水-甲醇混合物或水-乙腈以稀释转移部分。如此稀释的样品减小内源性竞争材料的量以相对增加串联质谱分析的灵敏度。其它类型的试剂由所属领域的技术人员选择以与许多种类的通过质谱的分析相容。

在一些实施例中，稀释样品手动或借助于自动采样器和移液器自动地直接注射到串联质谱仪中。必要时，样品可以在分析之前衍生。试剂选择为不对MS/MS系统敌对。举例来说，合适的溶剂不具有清洁剂和腐蚀剂，如氯仿。纯乙醇和纯甲醇仅由于其在机械干燥方法时易于气化而通常使用。

串联质谱仪可以设定为同时检测添加的底物、对应所得酶促产物和对应内标。此类检测借助于母离子扫描、前体离子扫描或多反应监测扫描实现。

在酶检定期间消耗的底物或形成的产物的量也可以使用抗体和其它目标特异性结合分子检测。对于免疫检定，抗体可以用于检测底物、产物或两者。适用于此类方法的抗体可以是特异性的，使得其识别个别底物，或非特异性的，使得其识别许多或所有底物。底物或产物任选地包括标签，如生物素或抗生物素蛋白以允许特异性检测。

抗体说明性地产生于动物，包括小鼠、大鼠、家兔、马、驴或其它用于生产抗体的合适的动物中。在一些应用中，其适用于用可检测标签，如荧光标签标记抗体。当使用未标记抗体时，检测可以通过使用对一级抗体的物质IgG具有特异性的二级抗体进行，所述抗体说明性地用荧光标记，如若丹明进行标记。应理解，在所属领域中，其它抗体检测系统类似地可操作于本发明中，如辣根过氧化酶标记抗体，或碱性磷酸酶标记抗体。

当通过提供多个酶特异性底物在单一样品中测试多个酶时，识别和区分底物或其产物的抗体且使用。结合到酶特异性底物或其产物的抗体的复合物可以使用多种方法彼此区分。在一种情境下，含有目标酶的样品与连接到粒子的底物在检定溶液中接触。在此实例中，每一粒子连接到特定底物，且存在表示每一底物的多个粒子。目标酶作用于底物以产生产物(A)和含有分子的一部分的脂肪酸(B)。产物保持结合到粒子，而A产物释放到溶液中。识别特异性产物的抗体随后与检定溶液接触。抗体将结合到产物(如果在酶检定期间产生)以产生具有结合抗体的粒子。为了区分粒子上含有的不同产物，具有不同产物特异性的抗体可以具有不同可检测部分，如不同荧光标签。作为检测酶促产物的一个替代方案，识别底物的抗体可以用于检测在与酶一起培育之后在珠粒上剩余的底物。在此情况下，如果发生酶促反应，那么任一产物将保持附接到珠粒。在任一情况下，选定的底物特异性抗体将不与附接到珠粒的产物显著地交叉反应。

在另一情境下，含有目标酶的样品与连接到编码粒子的底物在检定溶液中接触。编码粒子具有特征，如条形码或光学轮廓，其允许所述粒子彼此区分。举例来说，编码粒子可以具有对应于不同目标酶底物的不同条形码。在检定中，目标酶作用于底物以产生产物。脂肪酸产物将保持结合到粒子，而A产物将释放到溶液中，或反之亦然。识别特异性产物的抗体随后与检定溶液接触。由于粒子的编码指示哪一底物附接到粒子，抗体不必对特定产物具有特异性，且因此一种类型的抗体可以用于检测衍生自多个不同底物的产物。此类非特异性抗体将结合到产物(如果在酶检定期间产生)以产生具有结合抗体的粒子。具有结合抗体的粒子随后与不具有抗体的例子区分，例如通过检测抗体上的标签或粒子的物理特性。抗体结合粒子上含有的不同产物可以基于每一粒子的编码确定。

作为免疫检定形式的另一实例，产生针对于特定底物的抗体。在酶促反应淬灭后，反应溶液转移到高结合微量滴定板，借此反应性B

在替代免疫检定形式中，对脂肪酸子基团具有特异性的抗体任选地用作标准夹心ELISA检定中的微量滴定板的表面上的捕捉抗体。具有产物上的独特抗原决定基的一级抗体，如针对于脂肪酸部分(或脂肪酸部分经特异性结合对成员，如生物素修饰)的抗体用于检测。如所属领域中所公认，标记的二级抗体任选地用于如上文所述的检测。

在另一免疫检定形式中，示例性抗体与结合到B

抗体说明性地未标记且生产于动物，包括小鼠、大鼠、家兔、马、驴或其它用于生产抗体的合适的动物中。对一级抗体的物质IgG具有特异性的二级抗体说明性地用荧光标记，如若丹明进行标记且随后用于检测剩余的底物。应理解，在所属领域中，其它抗体检测系统类似地可操作于本发明中，如辣根过氧化酶标记抗体，或碱性磷酸酶标记抗体。

在合适的免疫检定形式的另一实例中，对结合到B

在一些实施例中，目标酶的检定通过首先获得样品进行，所述样品说明性地包括血清、血浆、全血、尿液、唾液、其它生物流体或组织溶解物、溶液中的重组或天然纯化酶或生物流体或液体介质中的化学或功能上修饰的酶。随后切离一部分滤纸样品且沉积于非结合检定试管或微量滴定板孔中，向其中添加检定溶液。检定溶液包含水性缓冲剂、底物、标准物以及蛋白酶抑制剂。样品混合物随后在介于30到41℃范围内的特定温度下培育在30分钟到20小时范围内的确定时段。一旦培育完成，酶促反应通过添加终止液终止。终止液说明性地为以6×反应体积添加的0.4M甘氨酸/NaOH pH 10.4。伦纳德R(Leonard R)等人,生物化学杂志(J.Biol.Chem.),2006；281:4867-75；布特,RG(Boot,RG)等人,生物化学杂志,2006；282:1305-12。产物形成的量通过转移已知体积的样品到高结合检定试管或微量滴定板且培育5分钟到2小时测定。非结合材料通过洗涤去除。检测完整底物或产物说明性地使用偶联过氧化酶方法进行。

在另一情形下，释放的葡萄糖或半乳糖产物的水平通过偶联酶方法实时测量。非限制性实例涉及在诊断戈谢病中从对β-葡糖脑苷脂酶具有特异性的底物释放葡萄糖。在此分析方法中，葡萄糖与生产葡萄糖酸内酯且释放过氧化氢的葡萄糖氧化酶反应。释放的过氧化氢通过与过氧化酶反应以产生在标准荧光计上测量的荧光分子来检测。合适的过氧化酶的实例为辣根过氧化酶或所属领域中已知的任何其它过氧化酶。葡萄糖氧化酶释放的过氧化氢与检测器底物分子相互作用。过氧化酶催化此底物转化为荧光产物的转化。适合与底物一起使用的检测器分子包括经氧化以产生荧光产物试卤灵(resorufin)的安普莱克司红(Amplex Red)。检测游离葡萄糖的安普莱克司红和试剂盒购自茵维特罗根公司(Invitrogen Corp)。红色荧光产物的增加在激发波长设定于571nm且发射波长设定于585nm且带通设定于5nm的荧光计上检测。糖苷酶活性的量越大，红色荧光产物的产生速度越快。

在一些实施例中，不同溶酶体酶的多种底物以独特脂肪酸结构产生。此预防一种酶的产物抑制，这在一种酶对于一种底物的催化活性比另一种酶对于其对应底物的催化活性大的多的情况下尤其重要。这另外在单一突变糖苷酶在用于6种或更多种溶酶体酶的一组底物中筛选的条件下重要。由其它溶酶体酶形成的产物可以抑制较低活性酶的功能，使得其活性没有精确地测量。因此，将底物和产物对于每一酶的特异性理解为任选地相异的。

当通过组合针对于对应酶的多个底物同时检测一种以上酶时，底物可能不仅在赋予酶特异性的糖部分的类型中，而且在脂肪酸部分的任何组分的长度中不同。这在使用MS/MS作为检测工具的情况下尤其重要，因为分化的底物分子具有对应于检查的各种酶的对应分化的质量指数。

关于使用描述的底物和标准化合物检定酶描述的方法可以扩展到在单一反应中同时检定多种酶，无需多个检定以帮助证实医学病症的诊断。当评估通过特定生物化学路径的化学通量速率或监测生物化学信号传导路径时，所述方法也可以用于同时测量若干酶。由于使用本文所述的化合物可采用的质谱检测的高灵敏度，每检定可能仅需要亚微克量的底物试剂，在低克规模上合成数百底物试剂变得实际且经济。

在各种实施例中，通过使用提供的底物同时测量二、三、四、五、六种或更多种溶酶体酶的活性。

作为适用于提供的底物的另一示例性形式，底物可以标记有相同荧光团，但具有彼此区分的显著质量或电荷特征。在酶促裂解反应之后产生的产物的量通过反相高效液相色谱(HPLC)检测。反应通过添加醇、乙腈或稀三氟乙酸淬灭。一部分培育混合物转移到新检定容器，向其中添加纯溶液，如甲醇、乙腈、水-甲醇混合物或水-乙腈。反应产物和未反应的底物在5μm粒度C

应理解，在所属领域中，用于多种酶的多种底物任选地通过色谱方法同时检测。如果使用具有充分不同的质量或滞留特征的底物，那么每一产物可例如在HPLC柱上解析且可在单一检定中定量。或者，每一底物标记有具有不同或相同激发或发射特性的不同荧光团。检测可以通过可以同时彼此地定量个别产物和其对应标记底物的一类荧光检测器。其它检测方法同样合适且为所属领域中已知的。

图2描绘检测溶酶体贮积症的示例性底物结构。结构包含呈葡萄糖或半乳糖形式的糖(A)，其中说明的是半乳糖，和脂族基B。基团B包括呈亚甲基形式的连接臂(B1)、C

图3描绘检测溶酶体贮积症的示例性底物结构。结构包含呈葡萄糖或半乳糖形式的糖(A)，其中说明的是半乳糖，和脂族基B。基团B包括呈亚甲基形式的连接臂(B1)、C

图5展示使用示例性底物的一般酶促反应。在特异性亲和力结合和酶促反应后，底物裂解为两个基团，糖部分A和脂族基B。基团B任选地包含酰胺和长链烷基或烯基部分。两个基团均任选地随后通过MS/MS进行分析。内标也同时经受MS/MS分析。内标任选地为以氘置换分子的甲基或其它部分上的氢原子的B的同位素标记类似物。

还提供一种适用作检测酶活性的内标或对照物的化合物，其具有下式：

其中B1为：C

在一些实施例中，结构B

其中R

根据本发明的内标的特定所说明的实施例包括(但不限于)：

其中x为2与4之间的值，且其中R

另外应理解，式V或VI的化合物也用作拮抗剂、分析型对照物或用于临床治疗疾病，如甲状腺功能低下、糖尿病和HIV。

在替代实施例中，式I-III的底物任选地用A与B

包括底物、酶促产物和内标的所有试剂可以任选地通过反相HPLC纯化且通过ESI-MS来表征，其于在线HPLC-MS检定中或通过收集适当洗脱份离线地进行。

本发明的各种方面通过以下非限制性实例说明。所述实例为达成说明的目的且不限制本发明的任何实践。应理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以作出各种变化和修改。本文中说明的试剂为可商购的或易于通过众所周知的方法从易于可商购的前体合成，且所属领域的技术人员易于理解可以从何处获得此类试剂。

实例

实例1：制备底物：

制备化合物1实质上如流程I中所描绘地实现：

简单来说，α-D-葡萄糖修饰的神经鞘胺醇(A)(D-葡糖基-β1-1'-D-赤-神经鞘胺醇,阿万蒂极性脂质(Avanti Polar Lipids),阿拉巴马州阿拉巴斯特(Alabaster,AL))溶解于1mL无水DMF(奥德里奇(Aldrich))中。添加1.5当量戊酰基-NHS酯(B)(自DMF中的50mg/mL储备溶液，储存于-20℃下)。如通过TLC测量，反应在2分钟内完成。反应产物在不加热的情况下在真空离心蒸发浓缩器Speed-Vac中经受离心过夜。残余物溶解于1-1.4mL DMF中且以6-7份注射到HPLC柱(在6mL/min下运行的Vydac C18柱(218TP1022，22×250mm))上。所述柱使用含25％甲醇的水的溶剂A和含20％甲醇的乙腈的溶剂B，以经30分钟的35％-100％B，随后持续30分钟保持在100％B处的梯度运行。产物通过UV在213nm处检测。从所有HPLC运行收集产物洗脱份，且在离心浓缩器(Speed-Vac，油泵真空，室温)中去除溶剂，得到接近定量产率的化合物1的所需产物

所得化合物1通过NMR分析以证实身份。结果展示于图1A中。所得化合物的观测分子量为545.3948。以上方法类似地用于通过以具有改变烷基链长度的戊酰基-NHS酯取代戊酰基-NHS酯合成其它化合物。

根据式II合成的其它化合物呈现于表1中：

表1：

通过将R

作为另一实例，实质上如流程II中所描绘地合成化合物9：

化合物9

简单来说，100mg半乳糖基-神经鞘胺醇(阿万蒂极性脂质公司,阿拉巴马州阿拉巴斯特)溶解于3.3mL THF+0.56mL水中。向此溶液中添加1.5当量庚酰基-NHS酯。用二异丙基乙胺将混合物的pH调节到8.5-9.0(在水浸湿的pH纸上点样)。如通过TLC测量，反应几乎在2小时内完成。为了迫使反应完成，再添加0.75当量的庚酰基-NHS酯，如上地调节pH，且在室温下搅拌混合物总共3-4小时。反应产物在不加热的情况下在真空离心蒸发浓缩器Speed-Vac中经受离心过夜。干燥的滞留物溶解于1.4mL DMF中且将0.2mL部分注射到如上的HPLC柱上。从所有HPLC运行收集产物洗脱份，且在离心浓缩器(Speed-Vac，油泵真空，室温)中去除溶剂，得到81％产率的所需产物。化合物合成通过如图1B中所示的NMR确认。

实例2：制备内标

内标通过与实例1的方法类似的方法制得，但从不结合到糖部分的神经鞘胺醇开始，实质上如流程III中所示。

流程III

简单来说，可商购的神经鞘胺醇(阿万蒂极性脂质,阿拉巴马州阿拉巴斯特)和适当的脂肪酸的NHS酯如同实例1中地反应。使用的示例性NHS酯为：戊酰基-NHS酯、庚酰基-NHS酯、戊酰基-NHS酯(各自具有或不具有H到D取代)。内标通过HPLC如上地纯化且以20％-90％的产率获得。

所得示例性化合物81通过NMR进行分析以证实所得分子量为424的合成。流程II的方法类似地用于合成在神经鞘胺醇或NHS酯前体中包括H到D取代的其它标记内标。根据式V合成的其它示例性化合物呈现于表2中。

表2：

*表示NHS脂肪酸包括H到D取代。

**表示神经鞘胺醇包括末端H到D取代。

实例3：检测样品中的酶活性.

化合物1和9的底物分别用于检测酸性β-葡糖脑苷脂酶(ABG)和半乳糖脑苷脂-β-半乳糖苷酶(GALC)的存在。通过从同意的成年人静脉穿刺且在滤纸上涂抹获得血液。对于每一样品，3mm直径的盘从干血区域冲压到96孔微量滴定板的孔中。血盘随后直接用含有500μmol/L的最终浓度的底物和10μmol/L的最终浓度的对应内标的检定溶液培育。也向检定溶液中添加具有牛磺胆酸钠的0.5mol/L的最终浓度的乙酸钠缓冲液。含有血盘的分析混合物在37℃下在回旋式震荡(150rpm)的情况下在恒温空气震荡器中培育15到24小时。在培育期之后，纯甲醇的等分试样添加到每一试管或孔中以终止酶促反应。在进入质谱仪之前，培育的反应混合物用纯甲醇稀释。对于质谱分析，电喷雾源以正离子模式操作，且离子以母离子扫描模式检测。酶促产物的量计算自产物与内标的离子丰度比减去空白的所述比。

图6说明使用化合物1作为ABG底物相对于先前使用的底物出乎意料地提高的结果，其说明相比于C

实例4：同时检测样品中的多种酶活性.

同时使用化合物1和7的底物以分别检测酸性β-葡糖脑苷脂酶(ABG)和半乳糖脑苷脂-β-半乳糖苷酶(GALC)的存在。通过从同意的成年人静脉穿刺且在滤纸上涂抹获得血液。对于每一样品，3mm直径的盘从干血区域冲压到96孔微量滴定板的孔中。血盘随后直接用含有100μmol/L的最终浓度的底物和1μmol/L的最终浓度的对应内标的检定溶液培育。也向检定溶液中添加具有牛磺胆酸钠的0.5mol/L的最终浓度的乙酸钠缓冲液(30μl最终检定体积)。含有血盘的分析混合物在37℃下在回旋式震荡(150rpm)的情况下在恒温空气震荡器中培育15到24小时。在培育期之后，100μl等分试样的50:50甲醇/乙酸乙酯添加到每一套管或孔以终止酶促反应。反应物随后补充有400μl HPLC级乙酸乙酯和200μl水。反应物经离心且所得液体顶层转移到新检定板且在氮气下蒸发。具有0.1％甲酸的83％乙腈/17％水的分析缓冲液添加到检定板且样品通过MS/MS经受分析以检测酶促产物和内标。对于质谱分析，电喷雾源以正离子模式操作，且离子以母离子扫描模式检测。酶促产物的量计算自产物与内标的离子丰度比减去空白的所述比。实现ABG和GALC两者的检测。

实例5：在替代实施例中，与式I的底物的反应产物通过免疫检定定量。点样于滤纸上的血液在缓冲液中复水以释放活性组分。一个或一阵列底物添加到反应室且使反应进行过夜(约14小时)。通过添加6×体积甘氨酸/NaOH pH 10.4使反应淬灭。每一反应的样品添加到高结合照射微量滴定板的孔中且培育过夜以允许反应产物与板的孔的充分结合。类似缓冲液/样品中的产物的标准曲线也添加到板以充当定量基础。在完全结合到板表面之后，通过使用喷射瓶、板洗涤器或任何其它自动化或非自动化板洗涤系统用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤孔两次。蛋白质结合的任何其它位点随后通过添加阻断剂阻断，所述阻断剂说明性地包括含3％牛血清白蛋白的PBS或所属领域中已知的任何其它合成或天然阻断剂。阻断剂在室温下培育两小时。孔用PBS洗涤3×。一级抗体随后添加到孔以识别和结合剩余的底物，或产物。抗体在孔中培育至少2小时。板洗涤四次以去除非结合抗体。如果一级抗体经标记，那么板用于检测。任选地，经标记的二级抗体置于板孔中且允许再培育2小时，接着洗涤4次且通过适当方法检测，如通过荧光或光学读板仪。

实例6：在替代实施例中，与式III的底物的反应产物通过免疫检定定量。点样于滤纸上的血液在缓冲液中复水以释放活性组分。一种或一阵列固定到编码粒子的底物添加到反应室，优选地微量板孔，且使反应进行过夜(约14小时)。也添加类似缓冲液/样品中的酶的标准曲线以分离编码粒子组以充当定量基础。通过添加6×体积甘氨酸/NaOHpH 10.4使反应淬灭。一级抗体随后添加到孔中以识别和结合剩余的底物，或产物。抗体培育至少30分钟。如果一级抗体经标记，那么检定准备好用于检测。任选地，经标记的二级抗体置于板孔中且允许再培育30分钟。检测通过流式细胞仪实现。

实例7：式I的示例性实施例的B

标记的底物用于反应中以检测葡糖脑苷脂酶活性和检测戈谢病。对于每一患者或对照样品，3mm直径的盘从滤纸上的干血区域冲压到微量离心管或96孔微量滴定板的孔中。血盘随后直接用含有5μmol/L的最终浓度的标记底物和0.1μmol/L的最终浓度的对应内标的检定溶液培育。含有血盘的分析混合物在37℃下在回旋式震荡(150rpm)的情况下在恒温空气震荡器中培育15到24小时。在培育期之后，纯甲醇的等分试样添加到每一试管或孔中以终止酶促反应。反应的样品添加到含有HPLC移动相(甲醇:水:乙酸，82:18:0.1vol/vol/vol)的第二试管。淬灭反应溶液的20μl等分试样使用甲醇:水:乙酸，82:18:0.1vol/vol/vol作为移动相以1.3ml/min的速率等度分离于4.6×250mm对称性C

本说明书中提及的任何专利或公开案表明本发明所属领域的技术人员的水准。这些专利和公开案以引用方式并入，其程度如同每一个别公开案专门且单独指定为以引用方式完全并入。

所属领域的技术人员将易于理解本发明非常适合于实施所述目标和获得提到的目的和优势，以及其中固有的那些。本文所述的本发明实例连同方法、程序、处理、分子和特定化合物当前代表特定实施例、为示例性的且不打算作为对本发明的范围的限制。将显而易见的是存在其它实施例且其包含在如由权利要求书的范围界定的本发明的精神内。