一种硝化细菌的干法保藏方法

技术领域

本发明属于污水处理领域，具体涉及一种硝化细菌的干法保藏方法。

背景技术

菌种保藏是指保持微生物菌株的生活力和遗传性状的技术。目的在于使其存活、不丢失、不污染杂菌、不发生或少发生变异，保持菌种原有的各种特征和生理活性。基本原理是使微生物的生命活动处于半永久性的休眠状态，也就是使微生物的新陈代谢作用限制在最低范围内。常用的方法有冻干保藏法、深低温保藏法、液氮保藏法、矿油封藏法、固体曲保藏法、砂土管保藏法、琼脂穿刺保藏法等。日常工作中，常选用4℃冰箱进行短时间的菌种保藏。

目前的硝化菌剂或者菌株大都是以液体形式保藏，如常温液体或者超低温冷冻保藏，常温液体保藏的菌体保藏周期短，超低温冷冻保藏的菌体额外增加了菌剂的成本，而且保藏后的菌体不方便运输。

CN106554921A公开了一种硝化细菌的保藏方法，是在硝化细菌培养过程中投加生长促进剂，培养至进入生长稳定期后，收集菌体，与保藏营养液混合，控制含水率为40%-80%，添加保藏剂，低温冷冻保藏。该发明采用低温冷冻保藏，温度较低，导致保藏成本较高，而且保藏后的菌体不方便运输。

CN106635803A公开了一种厌氧氨氧化菌干粉菌剂制备与保藏方法，主要运用海藻酸钠作为保护剂，抽真空在60℃条件下干燥获得厌氧氨氧化干粉菌剂，并在4℃下保存30天后活性恢复至41%。该专利以干粉形式保藏厌氧氨氧化菌，一方面活性恢复率较低，保藏周期较短，另一方面该方法在用于自养硝化细菌干粉菌剂的制备时，效果不太理想。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种硝化细菌的干法保藏方法。本发明采用真空烘干制得硝化细菌干粉并进行保藏，实现了在室温下硝化细菌的长期保藏，保藏后菌体活性恢复率较高。

本发明提供的硝化细菌的干法保藏方法，主要包括以下步骤：

（1）将硝化细菌悬液脱水至含水率高于80%，制备成硝化细菌浓缩液A，添加海藻酸钠，曝气条件下进行反应；

（2）将步骤（1）混合物脱水至含水率低于50%，制备成硝化细菌浓缩液B，并添加透明质酸或/和透明质酸钠，真空干燥得到硝化细菌干粉；

（3）将发酵产糖酯的微生物进行发酵培养，获得发酵液，分离出菌体细胞并制成休止细胞，与步骤（2）硝化细菌干粉混合；

（4）将步骤（3）混合物真空包装，室温保存。

本发明中，步骤（1）所述硝化细菌悬液可以是本领域常规方法培养获得的新鲜培养液，其基质为氨氮。优选将硝化细菌悬液脱水至含水率为85%-95%，制备成硝化细菌浓缩液A。

本发明中，步骤（1）优选添加质量分数为0.1%-1%的海藻酸钠溶液。海藻酸钠与硝化细菌浓缩液A的质量比为1:1000-10000。

本发明中，步骤（1）曝气条件是通入空气，曝气时间6-24h。

本发明中，步骤（2）得到的混合物脱水至含水率为30%-50%。

本发明中，步骤（2）优选添加质量分数为0.1%-1%的透明质酸溶液或/和透明质酸钠溶液。透明质酸或/和透明质酸钠与硝化细菌浓缩液B的质量比为1:1000-10000。

本发明中，步骤（2）真空干燥在压力为1-2kPa、温度为40-60℃条件下进行。

本发明中，步骤（3）所述发酵产糖酯的微生物为经发酵后可以生产鼠李糖酯、海藻糖脂、槐糖脂和蔗糖酯等中至少一种糖酯的微生物，可以是本领域公知的产糖酯的细菌、真菌和霉菌等，如产鼠李糖酯的铜绿假单胞菌、产海藻糖脂的绿脓假单胞菌等中的至少一种。

本发明中，步骤（3）将发酵产糖酯的微生物进行发酵培养，获得含菌体细胞和糖酯类物质的发酵液，离心分离出菌体细胞。所述休止细胞的制备可以是本领域公知的方法。具体可以是：将发酵液离心分离出菌体细胞，用生理盐水清洗掉各种营养物质和生长因子，然后在生理盐水中培养一段时间，至细胞处于饥饿状态，制成休止细胞。

本发明中，步骤（3）休止细胞的用量与硝化细菌干粉的质量比为(0.1-1)：100。

本发明中，所述的脱水采用重力沉降、离心或过滤等方式。

本发明中，所述的含水率是指硝化细菌浓缩液所含水分重量占浓缩液总重量的百分比。

本发明的有益效果如下：

硝化细菌在制备成干粉过程中，菌体的活性会降低甚至消失，特别是在长期室温保藏中也会随着时间延长菌体活性降低甚至丧失。本发明发明人经过研究发现在真空干燥前，在不同含水率条件下分别添加海藻酸钠、透明质酸（钠），可以提升菌体细胞在真空烘干过程中的耐受能力，对细胞形成由内而外的完整保护，避免了真空、温度等对细胞壁、酶、蛋白和水分的破坏，所制备干粉菌剂在室温就能够得到长期保藏。

本发明将发酵产糖酯的微生物制备成休止细胞用于硝化细菌干粉的常温保藏，提高了硝化细菌干粉长期保藏后细胞存活率，保藏时间长，活性恢复率较高。

本发明干法保藏方法可以降低成本，在室温保藏时间长，保藏后的菌体活性恢复率高还方便运输使用。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明方法和效果作进一步详细说明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均可从生化试剂商店购买得到。

本发明实施例中，氨氮浓度采用GB7478-87《水质铵的测定-蒸镏和滴定法》测定；细胞存活率=（细胞总数-死亡细胞数）÷细胞总数×100%，采用贝克曼的流式细胞仪CytoFLEX测试。

实施例1

（1）将硝化细菌悬液经重力沉降后弃上清液，获得含水率84%的硝化细菌浓缩液A，然后添加质量分数为0.5%的海藻酸钠溶液，海藻酸钠与硝化细菌浓缩液A的质量比为1:5000，通入空气曝气8h。

（2）将步骤（1）混合物采用过滤方式脱水至含水率40%，制备成硝化细菌浓缩液B，添加质量分数为0.1%的透明质酸溶液，透明质酸与硝化细菌浓缩液B的质量比为1:5000，在压力为1-2kPa、温度为45℃条件下进行真空干燥，得到硝化细菌干粉。

（3）将产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌(CGMCC No. 9376，购买得到)发酵培养后的发酵液离心分离出菌体细胞，用生理盐水清洗掉各种营养物质和生长因子，然后在生理盐水中培养一段时间，至细胞处于饥饿状态，制备成休止细胞。将制备的休止细胞与步骤（2）硝化细菌干粉按照质量比0.5:100混合，真空包装，室温保存。将获得的硝化细菌干粉与步骤（1）等量硝化细菌悬液相比，微生物数量相当，细胞存活率为76%。

将上述干粉室温保藏12个月后取出用缓冲溶液洗净后加入到250mL反应器中进行曝气活化，18天后氨氮去除率由开始的9%提高到90%以上，说明本发明方法制备的硝化细菌干粉制剂活性恢复快。

实施例2

（1）将硝化细菌悬液经重力沉降后弃上清液，获得含水率82%的硝化细菌浓缩液A，然后添加质量分数为0.1%的海藻酸钠溶液，海藻酸钠与硝化细菌浓缩液A的质量比为1:5000，通入空气曝气24h。

（2）将步骤（1）混合物采用离心方式脱水至含水率50%，制备成硝化细菌浓缩液B，添加质量分数为1%的透明质酸溶液，透明质酸与硝化细菌浓缩液B的质量比为1:5000，在压力为2kPa、温度为55℃条件下进行真空干燥，得到硝化细菌干粉菌剂。

（3）将产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌(CGMCC No. 9376，购买)发酵培养后的发酵液离心分离出菌体细胞，用生理盐水清洗掉各种营养物质和生长因子，然后在生理盐水中培养一段时间，至细胞处于饥饿状态，制备成休止细胞。将制备的休止细胞与步骤（2）硝化细菌干粉按照质量比1:100混合，真空包装，室温保存。将获得的硝化细菌干粉与步骤（1）等量硝化细菌悬液相比，微生物数量相当，细胞存活率为75%。

将上述干粉菌剂真空包装后置于室温保藏，室温保藏12个月后取出用缓冲溶液洗净后加入到250mL反应器中进行曝气活化，20天后氨氮去除率由开始的8%提高到90%以上，说明本发明方法制备的硝化细菌干粉制剂活性恢复快。

实施例3

制备方法和过程同实施例1，不同在于步骤（3）所用的发酵微生物为产海藻糖脂的绿脓假单胞菌（CMCC(B)10104）。

将获得的硝化细菌干粉与步骤（1）等量硝化细菌悬液相比，微生物数量相当，细胞存活率为76%。将上述干粉室温保藏12个月后取出用缓冲溶液洗净后加入到250mL反应器中进行曝气活化，18天后氨氮去除率由开始的9%提高到91%以上，说明本发明方法制备的硝化细菌干粉制剂活性恢复快。

实施例4

制备方法和过程同实施例2，不同在于采用透明质酸钠代替透明质酸。将上述干粉菌剂真空包装后置于室温保藏，室温保藏12个月后取出用缓冲溶液洗净后加入到250mL反应器中进行曝气活化，20天后氨氮去除率由开始的8%提高到90%以上，说明本发明方法制备的硝化细菌干粉制剂活性恢复快。

比较例1

制备方法和过程同实施例1，不同在于在步骤（1）和步骤（2）中均使用海藻酸钠。将获得的硝化细菌干粉与制备干粉前等量硝化细菌悬液相比，细胞存活率只有29%。室温保藏6个月后取出用缓冲溶液洗净后加入到250mL反应器中进行曝气活化，18天后氨氮去除率由开始的4%只提高到29%。由此可见，硝化细菌干粉菌剂制备过程中，只添加海藻酸钠效果不理想。

比较例2

制备方法和过程同实施例1，不同的是在步骤（1）和步骤（2）中均使用透明质酸。将获得的硝化细菌干粉与制备干粉前等量的硝化细菌悬液相比，细胞存活率只有39%。室温保藏6个月后取出用缓冲溶液洗净后加入到250mL反应器中进行曝气活化，18天后氨氮去除率由开始的 4%只提高到35%。由此可见，硝化细菌干粉菌剂制备过程中，只添加透明质酸，效果不理想。

比较例3

制备方法和过程同实施例1，所不同的是步骤（1）、（2）脱水率均为84%。将获得的硝化细菌干粉与制备干粉前等量的硝化细菌悬液相比，细胞存活率只有56%。室温保藏1年后取出用缓冲溶液洗净后加入到250mL反应器中进行曝气活化，18天后氨氮去除率由开始的6%只提高到54%。

比较例4

制备方法和过程同实施例1，所不同的是每个步骤脱水率均为40%。将获得的硝化细菌干粉与制备干粉前等量的硝化细菌悬液相比，细胞存活率只有50%。室温保藏1年后取出用缓冲溶液洗净后加入到250mL反应器中进行曝气活化，18天后氨氮去除率由开始的6%只提高到48%。

比较例5

制备方法和过程同实施例1，所不同的是步骤（3）没有添加产鼠李糖脂铜绿假单胞菌的休止细胞。将获得的硝化细菌干粉与制备干粉前等量的硝化细菌悬液相比，细胞存活率只有65%。将保藏6个月的硝化细菌干粉与实施例1保藏12个月的干粉相比，细胞存活率降低了40%。