环肽及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种环肽的制备方法及由此方法所制备的环肽，尤其涉及一种通过催化剂合成环肽的制备方法。

背景技术

肽已被广泛应用于各种领域，例如局部或化妆品皮肤护理。在已知的肽中，发现具有精氨酸(R)-甘氨酸(G)-天门冬氨酸(D)构型(arginine(R)-glycine(G)-aspartate(D)motif)的肽作为细胞辨识中常见的单元。

已知包含RGD构型(motif)的肽可以结合于整合素(intergrin)RGD结合位，且可通过模拟体内条件而涂布于组织工程中的合成支架以来增强细胞的附着。

在制备含有RGD构型的肽的常规方法中，须使用耦合剂来催化肽的合成，且通常需使用大量的耦合剂(例如1-5当量)进行反应。然而，因耦合剂的成本不低，导致肽的生产成本高，且所获得的肽并非全部可以使用。

因此，目前亟需提供一种新颖且包含RGD构型的环肽的制备方法，以利应用于各种领域。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种环肽的制备方法及由此方法所制备的环肽。其中，该方法利用催化剂来催化环肽的合成，以降低生产成本。此外，由此所制备的环肽利于保存。

本发明提供一种环肽的制备方法，包含以下步骤(A)至(C)。

在步骤(A)中，由商业来源或通过我们的方法制备，提供由下列式(I-1)与(I-2)所表示的化合物：

其中，R

R

G为H或O-t-Bu；以及

R

在步骤(B)中，进行式(I-1)与(I-2)的化合物之间的反应，以获得由下列式(I-3)所表示的化合物：

在步骤(C)中，将式(I-3)的化合物与式(II)的催化剂进行环化反应和去保护基，以获得一由下列式(III)所表示的化合物：

M(O)

其中，G’为H或OH；

Q为卤素、OC(O)CF

M为一金属，选自由IVB、VB、VIB和锕系族所组成的群组；

L

m和y为大于或等于1的整数；以及

z为大于或等于0的整数。

本发明还提供另一种环肽的制备方法，包含以下步骤(a)至(d)。

在步骤(a)中，由商业来源或通过我们的方法制备，提供由下列式(I-1)与(I-4)所表示的化合物：

其中，R

R

G为H或O-t-Bu；以及

R

在步骤(b)中，进行式(I-1)与(I-4)的化合物之间的反应，以获得由下列式(I-5)所表示的化合物：

在步骤(c)中，进行式(I-5)的化合物与由下列式(I-6)所表示的化合物之间的反应，以获得下列式(I-7)所表示的化合物：

其中，R

在步骤(d)中，将式(I-7)的化合物与式(II)的催化剂进行环化反应和去保护基，以获得一由下列式(III)所表示的化合物：

M(O)

其中，G’为H或OH；

Q为卤素、OC(O)CF

M为一金属，选自由IVB、VB、VIB和锕系族所组成的群组；

L

m和y为大于或等于1的整数；以及

z为大于或等于0的整数。

在本发明中，R

在本发明的制备方法中，在进行式(I-1)与(I-2)的化合物的反应间，或式(I-1)与(I-4)的化合物的反应间，或(I-5)与(I-6)的化合物的反应间，可以使用式(II)的催化剂或耦合剂进行。

用来制备环肽的常规方法中，使用3-5当量的耦合剂，例如羟基苯并三唑(hydroxybenzotriazole，HOBt)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(1-hydroxy-7-azabenzotriazole，HOAt)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐(2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1，1，3，3-tetramethyluronium hexafluorophosphate，HBTU)和苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷六氟磷酸盐(benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate，PyBOP)。因为这些耦合剂很贵，所获得的环肽不容易商业化并应用于各种领域。

在本发明用于制备该环肽的方法中，式(II)的催化剂为水溶性的且用于促进反应进行。因此，本发明的方法不需使用昂贵的耦合剂，因此，可以以更便宜的方式生产环肽，且所获得的环肽可以应用于各种领域。

在本发明的制备方法中，当以式(II)的催化剂进行步骤(B)至(C)或步骤(b)至(d)的反应时，步骤(B)至(C)或步骤(b)至(d)中使用的催化剂可以相同或不相同。

在式(II)的催化剂中，L

其次，在式(II)的催化剂中，M可以为一金属，其优选为选自由IVB、VB、VIB和锕系族所组成的群组。在本发明的一实施例中，M为IVB族过渡元素，m为1且y为2；其中M可以是Ti、Zr或Hf。在本发明的另一实施例中，M为VB族的过渡元素，m为1且y为2或3；其中M可以是V或Nb。在本发明的另一实施例中，M为VIB族的过渡元素，m为1且y为4；其中M可以是Mo、W或Cr。在本发明的另一实施例中，M为VIB族的过渡元素，m为2且y为2；其中M可以是Mo、W或Cr。在本发明的另一实施例中，M为选自锕系族，m为2且y为2；其中M可以是U。

在本发明中，式(II)的催化剂的具体例子为MoO

另外，在式(II)的催化剂中，z可以是大于或等于0的整数；且优选地z为0。

在此，由本发明的制备方法所合成的环肽，具有下列式(III)所表示的结构：

其中，G’为H或OH；

R

Q为卤素、OC(O)CF

在本发明的式(III)所表示的环肽中，X优选为O、CH

想本发明的式(III)所表示的环肽中，R

在本发明的式(III)所表示的环肽中，G’优选为H；Q优选为Cl、OC(O)CF

在本发明的一优选实施例中，本发明的环肽由下列式(III-1)至(III-5)任一者所表示：

其中，R

本发明的环肽包含精氨酸(R)-甘氨酸(G)-天门冬氨酸(D)的氨基酸，其可以结合于整合素(intergrin)RGD结合位。当本发明的环肽结合于皮肤的整合素RGD结合位时，可以恢复真皮层和表皮层之间的传递过程，且可以刺激基底膜(basement membrane)重要蛋白质的产生。因此，可以达到改善疤痕、伤口、发炎过程、老化、以及/或皱纹形成的目的。因此，本发明的环肽可以应用于局部或化妆品皮肤护理组成物。

在本发明中，除非另有说明，化合物中存在的烷基、环烷基、芳基和杂芳基都包含取代和未取代基团。烷基、环烷基、芳基和杂芳基上可能的取代基包含但不限于烷基、烯基、卤素、烷氧基、酮、醇、硫醚、胺甲酸酯(carbamate)、胺基、杂环基或芳基；但烷基不能被烷基取代。

在本发明中，术语“卤素”包含F、Cl、Br和I，且优选为Cl或Br。术语“烷基”是指直链或支链的烷基；优选为包含直链和支链C

从以下结合附图的详细描述中，本发明的其他目的、优点和新颖特征将变得更明显。

附图说明

图1为环肽(III-3)的抑制率对浓度的关系图；

图2为环肽(III-1)的抑制率对浓度的关系图。

具体实施方式

本发明已经以示例性方式描述，且应当理解，所使用的术语是在描述性质而不是限制性质。鉴于上述教导，本发明的许多修饰和变化是可能的。因此，应当理解在所附的权利要求范围内，本发明可以以不同于具体描述的方式实施。

本发明的一优选实施例的环肽可以由以下方法制备。

[流程I-1]

在室温在氮气气氛下，取Fmoc-Gly-OH(5.866g，20mmol，1.0当量)溶于乙腈(200mL)，加入催化剂ZrOCl

[流程I-2]

于氩气下，在干燥的微波小瓶(microwave vial)中加入Fmoc-Pip(Boc)-OH(2.33g，5mmol，1.0当量)、H-Arg(Mtr)-OMe(2.2g，5.5mmol，1.0当量)、催化剂ZrOCl

[流程I-3]

取Fmoc-Pip(Boc)-Arg(Mtr)-OMe(2.24g，2.64mmol，1.0当量)溶于甲醇溶液(100mL)并搅拌。加入20当量的哌啶，并将反应混合物搅拌至Fmoc-Pip(Boc)-Arg(Mtr)-OMe完全消耗，通过TLC(1h)确认，接着，将反应混合物在室温下减压蒸发至干燥。以己烷洗涤二苯并富烯(dibenzofulvene)的哌啶加成物(piperidine adduct)。将所得的H-Pip(Boc)-Arg(Mtr)-OMe真空干燥，并直接用于下一步骤。在氩气下，在干燥的微波小瓶中加入Fmoc-D-Phe-OH(1.123g，2.9mmol，1.1当量)、H-Pip(Boc)-Arg(Mtr)-OMe(1.0当量)、催化剂ZrOCl

[流程I-4]

取Fmoc-D-Phe-Pip(Boc)-Arg(Mtr)-OMe(996mg，1.0mmol，1.0当量)溶于甲醇溶液(10mL)并搅拌。加入20当量的哌啶，并将反应混合物搅拌至Fmoc-Gly-Asp(O

[流程I-5]

取Fmoc-Gly-Asp(O

[流程I-6]

在环境温度下，以三氟乙酸(TFA)(80％)、苯酚(5％)、水(2.5％)、苯基甲基硫醚(thioanisole)(5％)、三异丙基硅烷(triisopropylsilane)(2.5％)和1，2-乙二硫醇(5％)的溶液(2mL)处理被保护的环肽cyclo-Gly-Asp(O

本发明的一优选实施例的环肽也可以由以下方法制备。

[流程II-1]

取C5P-1(740mg，0.76mmol，1.0当量)溶于二氯甲烷或四氢呋喃(3.5mL)下搅拌，加入10-15当量的哌啶(8.4mmol)，将反应混合物搅拌至C5P-1完全消耗并通过TLC(0.5-1h)确认。接着将反应混合物在60℃减压下用甲苯蒸发至干。以己烷洗涤二苯并富烯(dibenzofulvene)的哌啶加成物(piperidine adduct)，并将生成的C5P-2(LC-MS：t

[流程II-2]

于乙酸乙酯/甲醇(25/25mL)的溶液中放入C5P-3(685mg，0.6mmol，1当量)和Pd/C(10％wt，70mg)。在环境温度下进行氢解反应(hydrogenolysis)18小时。将反应混合物过滤并浓缩，以得到粗化合物C5P-4(645mg，转换产率71.6％；LC-MS：t

[流程II-3]

取CP5-5(834mg，0.76mmol，1.0当量)溶于二氯甲烷或四氢呋喃(3.5mL)下搅拌，加入10-15当量的哌啶(8.14mmol)。将反应混合物搅拌至C5P-5完全消耗，并以TLC(0.5-1h)确认。接着，在环境温度下将反应混合物于减压下蒸发至干。以己烷洗涤二苯并富烯(dibenzofulvene)的哌啶加成物(piperidine adduct)。将生成的C5P-6(LC-MS：t

[流程II-4]

取C5P-7(300mg，0.34mmol，1当量)溶于四氢呋喃(15mL)，于环境温度下搅拌18-19小时。将反应混合物浓缩以得到粗化合物C5P(～200mg，转换产率94.4％；LC-MS：t

抗老评估

I型胶原蛋白是皮肤真皮的主要成分。细胞外胶原蛋白的数量和质量都主要与皮肤老化有关。因此，本实验使用前胶原I型C-肽(Procollagen Type IC-Peptide(PIP))的EIA试剂盒，检测Hs68人类成纤维细胞(human fibroblasts)对前胶原分泌和细胞毒性的诱导作用，结果如下表1所示。

[表11

a：使用(III-5)进行测试，其中，Q为Cl

b：细胞存活率(％)＝(样品组/控制组)x100％

由实验结果可发现，各个测试浓度的环肽皆会促进细胞分泌前胶原I型(Procollagen Type I)，且当环肽浓度为0.0008μM时，约可促进细胞分泌2.5倍的前胶原I型，推测其可改善皮肤老化等相关问题。此外，细胞存活率皆维持80％以上，显示其不具有毒性。

NMP-1抑制测试

基质金属蛋白酶-1(Matrix Metalloproteinase-1，NMP-1)为胶原酶(collagenases)的一，并参与细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的降解。更详细地，纤维母细胞(fibroblast)暴露于紫外线辐射后，会导致MMP-1过度表达，因此ECM会接着被MMP-1降解。

为了检测本发明的环肽的效果，因此进行了MMP-1抑制测试。

基质金属蛋白酶(MMPs)参与皮肤生理功能，例如伤口愈合、老化(aging)和发炎反应。MMPs在维持皮肤的正常生理功能或病理现象中扮演重要角色。此外，皮肤老化会导致对皮肤的各种影响，包括皱纹、干燥、皮肤松弛(anetoderma)、抑制胶原蛋白生成和促进MMP，从而加速细胞外基质(ECM)的降解。因而造成失去皮肤弹性以及皮肤的保水(water-holding)能力结果。

在此试验中，将待测化合物与人类纤维母细胞(human fibroblasts)共同培养，并接着将细胞因子(cytokine)TNF-α(肿瘤坏死因子，(Tumor Necrosis Factor-α)加入作为诱导剂，以诱导细胞大量表达MMP-1。然后，评估测试化合物是否可减少由TNF-α所诱导的MMP-1的量。

材料及方法

测试化合物：本发明的环肽(III-3)，其中，Q为Cl

细胞株：皮肤纤维母细胞(Skin fibroblast)Hs68

首先，将皮肤纤维母细胞Hs68在培养皿中接种过夜，并将不同浓度(0.05μM、0.25μM、1.25μM、2.5μM及5μM)的环肽(III-3)加入至皮肤纤维母细胞中6小时，接着在与TNF-α(20ng/mL)培育42小时。之后，通过ELISA量测每组MMP-1的浓度，结果显示于表2。

[表2]

c：未添加TNF-α、环肽及视网酸(retinoic acid，RA)的组别作为控制组

d：RA为已知的MMP-1抑制剂，将添加RA的组别作为正控制组

由上述结果可知，相对于3.3mM的RA而言(设为100％)，0.05μM的环肽(III-3)约可抑制60％的MMP-1，0.25μM的环肽(III-3)约可抑制80％的MMP-1；1.25μM的环肽(III-3)几乎可抑制87％的MMP-1；2.5μM的环肽(III-3)几乎可抑制91％的MMP-1。

此外，经由检测环肽(III-3)的抑制浓度，可得到如图1所示的结果，并可计算出环肽(III-3)的IC

相似地，改以不同浓度(0.05μM、0.25μM、1.25μM、2.5μM及5μM)的环肽(III-1)(Q为Cl)进行上述MMP-1的抑制实验，结果如下表3所示。由表3可知，0.05μM的环肽(III-1)约可抑制12％的MMP-1，0.25μM的环肽(III-1)约可抑制38％的MMP-1；而1.25μM的环肽(III-1)约可抑制90％的MMP-1。

[表3]

c：未添加TNF-α、环肽及视网酸(retinoic acid，RA)的组别作为控制组

d：RA为已知的MMP-1抑制剂，将添加RA的组别作为正控制组

此外，经由检测环肽(III-1)的抑制浓度，可得到如图2所示的结果，并可计算出环肽(III-1)的IC

虽然已经以优选实施例说明了本发明，但应当理解的是，可以在不脱离如下文所要求保护的本发明的精神及范围下，进行其他可能的修饰或改变。