兼养-自养联合培养光合微生物的方法和系统以及生产生物质和生物能源的方法

技术领域

本发明涉及微藻培养领域，具体涉及兼养-自养联合培养光合微生物的方法和系统以及生产生物质和生物能源的方法。

背景技术

微藻是一类在水中生长的种类繁多且分布极其广泛的低等植物，其包括自养培养、异养培养和兼养培养三种培养方法。其中，自养培养主要是通过微藻细胞高效的光合作用，吸收CO

成本是微藻养殖的核心问题，微藻异养或兼养养殖过程中需要条件有机碳源，有机碳源是微藻异养或兼养养殖成本中较大的一部分费用。为了降低微藻的生长成本，国外学者研究了葡萄糖、醋酸、乳酸、甘油、甘氨酸等对微茫藻、三角褐指藻、蛋白核小球藻、螺旋藻等生长的影响及生物活性物质的积累，研究结果表明，适当浓度的可溶性有机物有利于微藻的生长和活性物质的积累。2013年时Kirrolia et al(Renewable and SustainableEnergy Reviews 20：642–656)对开放式跑道池、光生物反应器和传统的发酵罐三种不同养殖模式下微藻的成本进行了对比，对比结果表明，三种养殖模式下生产单位质量的油脂的成本分别是7.64美元、24.6美元和1.54美元，生产单位质量的微藻生物质的成本分别是1.54美元、7.32美元和1.02美元。虽然微藻在发酵罐中养殖需要添加有机碳源，但生产成本并未提高，这可能是由于，微藻在发酵罐中高效率生长，缩短了微藻生产周期，减小了生产单位质量微藻的人工费、设备折旧费、占地费等其它费用，从而降低了微藻生产成本。

自养与兼养各有优势，也存在着各自的问题。兼养利用化学能和光能培养，积累生物质的速度快，但也带来生物质品质下降的不足。尽管兼养对有机碳源的综合利用率比异养更高，但仍会释放出大量的CO

前述背景技术部分公开的信息仅用于加强对本发明的背景理解并说明现有技术的不足，其可以包括不属于现有技术的信息。

发明内容

本发明的目的之一是通过强化光合微生物的自养过程，提高光合微生物的生产效率，减少光合微生物兼养过程的碳排放。本发明的目的之二是实施高浓度光合微生物的自养培养，改善兼养所得光合微生物的生物质品质。为此，本发明提供了一种兼养-自养联合培养光合微生物的方法和系统以及生产生物质和生物能源的方法。

本发明一方面提供一种兼养-自养联合培养光合微生物的方法，该方法包括：将光合微生物送至第一反应器中在第一光照和第一通气下进行兼养培养；同时，将光合微生物送至第二反应器中在第二光照和第二通气下进行自养培养；两培养阶段的光合微生物相同或不同；将所述第一反应器排放的气体作为部分或者全部的第二通气的气源；所述第二反应器为开放式或封闭式的光生物反应器。

本发明第二方面提供一种兼养-自养联合培养光合微生物的系统，该系统包括：用于光合微生物兼养培养的第一反应器和用于光合微生物自养培养的第二反应器，其中，第一反应器包括第一光照装置和第一通气装置，所述第二反应器包括第二光照装置和第二通气装置，所述第二反应器为开放式或封闭式的光生物反应器；所述第一反应器的排气口与所述第二反应器的第二通气装置连通，以使得所述第一反应器排放的气体作为第二通气装置的气源。

本发明第三方面提供了一种生产生物质的方法，包括采用上述方法培养光合微生物，并从所得的光合微生物中提取生物质。

本发明第四方面提供了一种生产生物能源的方法，包括采用上述方法培养光合微生物。

本发明提供的方法利用兼养培养来强化自养培养过程，有利于大规模、低成本、高效率的培养光合微生物。在本发明的一种实施方式中，可以利用兼养培养实施高浓度光合微生物的自养培养，进而提高兼养所得的光合微生物的品质。具体地，本发明能够获得如下优势：

(1)本发明通过收集、利用兼养过程的排气为自养过程提供气源，可以强化自养培养过程，提高自养培养的生产效率；利用阳光进行自养培养可以降低生产光合微生物的成本。

(2)已发现通过兼养本身改善光合微生物的品质效果有限，本发明通过收集、利用兼养过程的排气为自养过程提供气源，从而可以实施高浓度或较高浓度下光合微生物的自养培养，显著提高了兼养所得光合微生物的生物质品质，从整体上提高了光合微生物的生产效率，有利于大规模、低成本、高效率的生产光合微生物。

(3)兼养对有机碳源的综合利用率比异养更高，但仍会释放出大量的CO

附图说明

图1是本发明的例子中发酵罐的小球藻生长曲线。

图2是本发明的例子中管式反应器的小球藻生长曲线。

图3是本发明的例子中发酵罐的小球藻随时间的叶绿素a/干重值变化曲线。

图4是本发明的例子中管式反应器的小球藻随时间的叶绿素a/干重值变化曲线。

图5是本发明的例子中发酵罐的小球藻随时间的pH值变化曲线。

图6是本发明的例子中管式反应器的小球藻随时间的pH值变化曲线。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明一方面提供一种兼养-自养联合培养光合微生物的方法，该方法包括：将光合微生物送至第一反应器中在第一光照和第一通气下进行兼养培养；同时，将光合微生物送至第二反应器中在第二光照和第二通气下进行自养培养；两培养阶段的光合微生物相同或不同；将所述第一反应器排放的气体作为部分或者全部的第二通气的气源；所述第二反应器为开放式或封闭式的光生物反应器。

本发明第二方面提供一种兼养-自养联合培养光合微生物的系统，该系统包括：用于光合微生物兼养培养的第一反应器和用于光合微生物自养培养的第二反应器，其中，第一反应器包括第一光照装置和第一通气装置，所述第二反应器包括第二光照装置和第二通气装置，所述第二反应器为开放式或封闭式的光生物反应器；所述第一反应器的排气口与所述第二反应器的第二通气装置连通，以使得所述第一反应器排放的气体作为第二通气装置的气源。

以下将对本发明的上述方法和系统同时进行描述，但是应当理解的是，本发明的方法和系统可以配套使用，也可以分别独立地作为本发明的保护主题。

在本发明中，应当理解的是，本发明的兼养-自养联合培养方式是在自养培养同时，兼养培养也在同时进行。自养的光合微生物与兼养的光合微生物可以相同，也可以不同。优选情况下，自养的光合微生物就来自于兼养所得的微生物，当兼养培养结束后，将兼养培养的培养液部分送至自养培养的第二反应器中，在稀释或未稀释的状态下培养，然后剩余部分的第一培养液可以继续在第一反应器中进行兼养培养(通过额外补充营养液)，由此，第一反应器中进行兼养培养时，第二反应器同时也在进行自养培养，那么便可实现将第一反应器排放的气体作为所述第二通气的气源，同时达到强化自养培养过程和降低兼养二氧化碳排放的目的。优选地，将部分所述第一培养液在未经稀释下送至第二反应器中；同时，将剩余部分的第一培养液继续在第一反应器中进行新一轮的兼养培养，如此循环；同时达到提高兼养所得光合微生物品质和降低兼养二氧化碳排放的目的。本发明中，将所述第一反应器排放的气体作为部分或全部的所述第二通气的气源。该所述第一反应器排放的气体可以与常规供气的气体混合后作为第二通气的气源，也可以不与其他气体混合直接作为全部的第二通气的气源。

在自养的光合微生物就来自于兼养所得的微生物情况下，本发明的系统优选包括：所述第一反应器的培养液出口与第二反应器的藻液入口连通，以使得光合微生物在第一反应器中进行兼养培养后，直接进入到第二反应器中进行自养培养。

其中，送至第二反应器中的部分第一培养液占总的第一培养液的70-90体积％。

本发明的系统中，所述第一反应器的排气口与第二反应器的第二通气装置连通，以使得所述第一反应器排放的气体作为第二通气装置的气源。

其中，所述第一反应器为封闭式反应器，优选发酵罐结构；对所述第二反应器没有特别的限制，现有任何适合于自养的光生物反应器都可以为本发明所用，其可以是开放式的，也可以是封闭式的，优选为跑道池、管式、板式或柱式光生物反应器结构。

应该理解到，兼养培养是需要提供光照的，因此所述的第一反应器可设置现有任何适合兼养的人工光源和/或第一反应器的部分或全部采用透明材质，从而可以阳光为光源。

根据本发明，所述第一反应器和第二反应器之间通过培养液输送管道连通，在该管道上可以设置输送泵，也可以使第一反应器的位置高于第二反应器并有足够的高度差，以助于将培养液从第一反应器输送至第二反应器中。

根据本发明，所述第一光照和第二光照应当分别采用适用于所述兼养培养和自养培养的光照强度，为了更适用于本发明的培养方法，获得品质更高的光合微生物，优选地，所述第一光照的光照强度为5000-50000lux，优选为10000-20000lux。优选地，所述第二光照的光照强度为5000-100000lux，优选为10000-30000lux。

本发明中，所述的第一光照、第二光照既可以采用阳光，也可以采用人工光。所述第一光照优选采用人工光源。

根据本发明，在对稀释的第一培养液或者非来自于第一培养液的微藻进行自养培养时，所述第二光照优选以阳光为光源。根据本发明，在对未稀释的第一培养液进行自养培养时，所述的第二光照优选采用人工光源。

根据本发明，采用人工光源时，光照波长可以在较宽范围内变动，可以是部分波长光，也可以是全波长光，为了更利于光合微生物在本发明的生长，优选地，第一光照和第二光照的波长均为380-780nm，更优选光照波长为490-460nm和/或620-760nm，在该光照波长下，光合微生物细胞能够更好地利用光能，降低光合微生物养殖能耗。

上述光照所采用的人工光源可以是LED光源，特别是蓝光和红光LED光源。为了隔绝水汽，可以将光源采用透明材料进行封闭。

根据本发明，为了能够使得微生物能够更好地利用光能，对于本发明的人工光源设置来说，优选地，人工光源在光线方向上的间距为2-300mm，优选为60-200mm；也可以将人工光源封闭后直接插入培养液中。

根据本发明，为了适合第一反应器中进行兼养培养，所述第一通气将采用含氧气体作为第一通气的气源，这样的含氧气体可以是空气，或者氧含量大于空气的富氧气体(如富氧空气)。所述第一通气的通气量优选为0.1-10L/(L·min)，优选为0.2-5L/(L·min)，以使得光合微生物能够在本发明的第一反应器中更好地兼养生长。

根据本发明，所述第二通气采用的气源为第一反应器排放的气体或者为第一反应器排放的气体与现有用于自养培养的气体的混合物(比如空气)，这样的气体由于掺杂有兼养培养过程产生的二氧化碳，其二氧化碳的含量将高于空气，更有利于自养培养。其中，所述第二通气的通气量优选为0.1-10L/(L·min)，更优选为0.2-5L/(L·min)。

根据本发明，对于本发明的系统来说，所述第一通气和第二通气采用的通气装置可以为本领域常规采用的通气装置结构，只要能够用于进行本发明的第一通气和第二通气即可。

根据本发明，所述兼养培养可以在搅拌下进行，其中，搅拌转速优选为200-500r/min。为此，本发明的系统的第一反应器中可以增设有搅拌结构。

根据本发明，优选情况下，所述兼养培养的温度为20-35℃。其培养时间可以在较宽范围内变动，例如为3-10天。这里的兼养培养的时间可以理解为从开始培养到采收光合微生物的时间，也可以理解为每次开始培养到再次送至自养培养的第二反应器之间的时间。

根据本发明，优选情况下，所述自养培养的温度为20-35℃。其培养时间可以在较宽范围内变动，例如时间可以为3-20天。这里的自养培养时间既可以理解为每一批次的光合微生物的培养时间，又可以理解为光合微生物在自养培养的第二反应器中的停留时间。也即，自养培养的培养液可以连续地以一定的流量排放出第二反应器。

根据本发明，优选地，所述光合微生物为微藻，优选为绿藻，更优选为小球藻。

根据本发明，本发明的第一反应器采用的是密闭的设置，以此可以进行无菌的兼养培养，而所述兼养培养需要补入有机碳源。优选地，所述有机碳源为糖类和/或醋酸盐。其中，所述糖类例如可以为葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等中的一种或多种。所述例如可以为醋酸钠。更优选地，所述有机碳源为葡萄糖。

其中，所述有机碳源的添加量可以在较宽范围内变动，优选地，培养体系中，所述有机碳源的添加量为5-15g/L。

根据本发明，所述光合微生物的兼养培养体系中还可以添加本领域常规采用的其他试剂，例如可以为磷酸盐(例如为K

根据本发明，为了实现兼养培养保持一定的无菌环境，通气采用的气体可以为无菌的，另外，可以在兼养培养体系中添加抗生素来防止细菌生长。这样的抗生素可以为本领域常规采用的控制微生物无菌培养采用的抗生素，例如可以为卡那霉素、氯霉素、链霉素、庆大霉素、万古霉素、阿奇霉素等中的一种或多种。其用量可以在较宽范围内变动，例如为10-65mg/L。

根据本发明，所述光合微生物的培养体系采用的培养基优选为以下组成：K

其中，微量元素A5的组成优选为：H

本发明第三方面提供了一种生产生物质的方法，包括采用上述方法培养光合微生物，并从所得的光合微生物中提取生物质。

所述生物质可以为本领域常规的多种生物质，例如可以为油脂、蛋白质、碳水化合物、核酸、色素、维生素、生长因子之一或其任意组合。

本发明第四方面提供了一种生产生物能源的方法，包括采用上述方法培养光合微生物。

本发明的方法适用于光合微生物的养殖，能够在更低的能耗下，更高产量地获得高品质的光合微生物发酵液。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

以下例子中：

小球藻干重测定：取适量藻液，6000r/min，离心5min，去上清液，藻泥冷冻干燥72h后称重。

小球藻藻种来自中国科学院水生生物研究所。藻种准备阶段，在三角瓶中加入600mL左右的BG11培养基和5g/L葡萄糖，然后在120℃下消毒灭菌30min，待冷却后加入适量藻种和50mg/L的卡那霉素，然后在光强为6000lux、温度为28℃的条件下通入无菌空气培养3d左右，获得诱导藻种。

BG11培养基的组成：K

微量元素A5的组成：H

培养系统：该培养系统包括依次串联的第一反应器和第二反应器，第一反应器为5L容积的封闭式发酵罐，第二反应器为容积为10L的开放式管式光生物反应器；其中，封闭式发酵罐的底部藻液排出口连接有藻液输送管，藻液输送管连接至输送泵，输送泵排出口通过另一藻液输送管连接至开放式管式光生物反应器上部的藻液入口；封闭式发酵罐的顶部排气口通过气体输送管连接至开放式管式光生物反应器内的通气装置的进气口。

实施例1

本实施例用于说明本发明的光合微生物的培养方法。

在上述培养系统的封闭式发酵罐中加入3L BG11培养基和15g/L葡萄糖，然后在120℃下进行消毒灭菌30min，待冷却后备用，接种时加入经过葡萄糖诱导的小球藻藻种和50mg/L的卡那霉素，通入0.5L/(L·min)的无菌空气，温度为28℃，转速为250r/min，光强10000lux，光照波长为380-780nm，光暗周期12h：12h。每天补充15g/L葡萄糖，其他营养盐根据消耗量补充，兼养培养至藻细胞生长缓慢。

将来自封闭式发酵罐80体积％的藻液不经稀释下直接移至开放式的管式光生物反应器中进行自养培养，养殖温度28℃，光照强度20000lux，光照波长为380-780nm。同时在封闭式发酵罐中继续加入灭菌的2.4L BG11培养基、10g/L葡萄糖、50mg/L的卡那霉素，每天补充营养，以剩余部分的藻液作为藻种继续在封闭式发酵罐中进行兼养培养。

其中，将封闭式发酵罐的排气口排出的气体引入到开放式的管式光生物反应器的底部进气口，对管式光生物反应器进行通气，保持通气的流量为1L/(L·min)；同时，将管式光生物反应器的排气口排出的气体直接排出，封闭式发酵罐采用纯压缩空气进行通气，保持通气的流量为1L/(L·min)。

在兼养培养和自养培养同时进行下，在指定时间测量发酵罐和管式光生物反应器中小球藻干重、绿素a/干重(重量比)和pH值分别见表1、表2和表3所示。

实施例2

本实施例用于说明本发明的光合微生物的培养方法。

在上述培养系统的封闭式发酵罐中加入3L BG11培养基和15g/L葡萄糖，然后在120℃下进行消毒灭菌30min，待冷却后备用，接种时加入经过葡萄糖诱导的小球藻藻种和10mg/L的氯霉素，通入0.8L/(L·min)的无菌空气，温度为28℃，转速为250r/min，光强8000lux，光照波长为380-780nm，每天补充营养，以剩余部分的藻液作为藻种继续在封闭式发酵罐中进行兼养培养。将来自封闭式发酵罐80体积％的藻液不经稀释下直接移至开放式的管式光生物反应器中进行自养培养，养殖温度28℃，光照强度15000lux，光照波长为380-780nm。同时在封闭式发酵罐中继续加入灭菌的3L BG11培养基、15g/L葡萄糖、10mg/L的氯霉素，光暗周期12h：12h。每天补充15g/L葡萄糖，其他营养盐根据消耗量补充，兼养培养至藻细胞生长缓慢。

其中，将封闭式发酵罐的排气口排出的气体引入到开放式的管式光生物反应器的底部进气口，对管式光生物反应器进行通气，保持通气的流量为0.8L/(L·min)；同时，将管式光生物反应器的排气口排出的气体直接排出，封闭式发酵罐采用纯压缩空气进行通气，保持通气的流量为0.8L/(L·min)。

在兼养培养和自养培养同时进行下，在指定时间测量发酵罐和管式光生物反应器中小球藻干重、绿素a/干重(重量比)和pH值分别见表1、表2和表3所示。

实施例3

本实施例用于说明本发明的光合微生物的培养方法。

根据实施例1所述的方法，不同的是，兼养培养和自养培养同时进行时，兼养培养的光照强度为5000lux，自养培养的光照强度为8000lux；在兼养培养和自养培养同时进行下，在指定时间测量发酵罐和管式光生物反应器中小球藻干重、绿素a/干重(重量比)和pH值分别见表1、表2和表3所示。

实施例4

本实施例用于说明本发明的光合微生物的培养方法。

根据实施例1所述的方法，不同的是，兼养培养和自养培养同时进行时，自养培养的光照强度为40000lux；在兼养培养和自养培养同时进行下，在指定时间测量发酵罐和管式光生物反应器中小球藻干重、绿素a/干重(重量比)和pH值分别见表1、表2和表3所示。

实施例5

本实施例用于说明本发明的光合微生物的培养方法。

根据实施例1所述的方法，不同的是，兼养培养和自养培养同时进行时，兼养培养和自养培养的光照波长为全波长；在兼养培养和自养培养同时进行下，在指定时间测量发酵罐和管式光生物反应器中小球藻干重、绿素a/干重(重量比)和pH值分别见表1、表2和表3所示。

对比例1

根据实施例1所述的方法，不同的是，兼养培养和自养培养同时进行时，管式光生物反应器中通入的是空气而不是发酵罐排放出来的气体；在兼养培养和自养培养同时进行下，在指定时间测量发酵罐和管式光生物反应器中小球藻干重、绿素a/干重(重量比)和pH值分别见表1、表2和表3所示。

表1

表2

表3

将表1中发酵罐的小球藻随时间的干重变化绘制成图1所示的小球藻生长曲线，将表1中管式反应器的小球藻随时间的干重变化绘制成图2所示的小球藻生长曲线；将表2中发酵罐的小球藻随时间的叶绿素a/干重值绘制成图3所示的曲线，将表2中管式反应器的小球藻随时间的叶绿素a/干重值绘制成图4所示的曲线；将表3中发酵罐的小球藻随时间的pH值绘制成图5所示的曲线，将表3中管式反应器的小球藻随时间的pH值绘制成图6所示的曲线。

通过表和图所示结果可以看出，本发明的方法强化了微藻的自养培养过程，从而可以实现对兼养产生的CO

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。