一种非洲猪瘟病毒检测方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒检测方法。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus,ASFV)感染引起的，猪感染后，主要临床症状表现为高热、食欲废绝、皮肤发绀，剖检后会发现淋巴结、肾、胃肠黏膜等出血，毒力强的毒株感染猪后，造成的病死率可高达100％，对生猪养殖危害巨大，是需要高度防范的传染病，因此世界动物卫生组织将其列为法定上报的动物疫病，我国也将其列为一类动物疾病。

ASFV二十面体对称，病毒粒子直径200nm，毒株不同，其基因组的长度也不尽相同，大小介于170-190kb，中部为中央保守区(C区)，长度约125kb。

2018年之前，中国没有非洲猪瘟，此次非洲猪瘟爆发，在我国已形成较大污染面，受其影响，我国生猪、能繁母猪存栏量快速下降，猪肉价格全国普涨，华南、东北、华东涨幅最大，猪肉是我国居民的必备菜品，对我国居民的生活质量造成很大影响，对非洲猪瘟进行检测，防止非洲猪瘟入境和扩大非常有必要，PCR检测具有检测特异性高、灵敏度强、操作简单、可大批量检测等特点，VP72是ASFV主要的衣壳蛋白，占病毒粒子蛋白含量的32％，在不同毒株之间高度保守，非洲猪瘟病毒变异快，有必要重新设计PCR检测方法，针对病毒高度保守序列，设计能更好的应对目前流行的非洲猪瘟病毒的检测方法。

发明内容

本发明的目的之一在于提供具有高度保守的引物序列，可以更好应对目前流行的非洲猪瘟病毒的检测；

本发明的目的之二在于提供一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒。

为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现：

1.从NCBI上获得非洲猪瘟VP72序列(AF302818.1，Seq ID No.1)，通过比对序列，获得保守序列，比对结果见图1；

2.使用Primer Premier 6.0针对保守序列设计引物，设计的引物序列为：PrimerF:5’-CACCACGCAGAGATAAGC-3’(Seq ID No.2)，R:5’-GATGCCGATACCACAAGAT-3’(Seq IDNo.3)，长度380bp；

3.本发明所述试剂盒包括：引物、Ex Taq Buffer、Ex Taq Hot-start DNA聚合酶、MgCl

4.本发明所述试剂盒的使用步骤如下：

1)提取待测样品DNA；

2)以待测样品的DNA为模板，进行PCR扩增，PCR体系为：10×Ex Taq Buffer 2.0μl、1U/μl Ex Taq Hot-start DNA聚合酶0.3μl、10μM引物1μl、2.5mM dNTPs 2.0μl、20mMMgCl

3)对扩增产物进行分析，如果扩增产物出现380bp的特异条带，说明待测样品中含有非洲猪瘟病毒。

本发明的有益效果是：

本发明基于ASFV VP72基因的高度保守区域设计引物，该序列具有非常好的特异性、敏感性。

附图说明

图1 NCBI ASFV VP72序列比对及引物位置

图2特异性检验结果图

图3敏感性检验结果图

图4不同来源非洲猪瘟病毒检测

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

实施例1

1.主要试剂

Ex Taq Buffer、Ex Taq Hot-start DNA聚合酶、MgCl

2.DNA样品

猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV，疫苗株)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪细小病毒(PPV)DNA样品由广东省动物疫病预防控制中心提取；ASFV RSA/1/98、IC/2/96、Katanga/63、ZAR85、NAM/1/80、Tolagna99、TAN/17/Morogoro DNA序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，连接于pUC57载体；

3.从NCBI上获得41条ASFV VP72基因序列，通过序列比对(比对结果见图1)获得保守序列；

4.使用Primer Premier 6.0针对保守序列设计引物，设计的引物序列为：PrimerF:5’-CACCACGCAGAGATAAGC-3’(Seq ID No.2)，R:5’-GATGCCGATACCACAAGAT-3’(Seq IDNo.3)，长度380bp；

5.PCR扩增

以步骤二的DNA样品为模板，PCR体系为：10×Ex Taq Buffer 2.0μl、1U/μl ExTaq Hot-start DNA聚合酶0.3μl、10μM引物1μl、2.5mM dNTPs 2.0μl、20mM MgCl

6.对扩增产物进行分析，如果扩增产物出现380bp的特异条带，说明待测样品中含有非洲猪瘟病毒。

实验一试剂盒特异性检验

1.猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV，疫苗株)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪细小病毒(PPV)DNA样品由广东省动物疫病预防控制中心提取,ASFV RSA/1/98DNA序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，连接于pUC57载体；

2.以获得的DNA为模板，用设计的引物PCR扩增，观察结果，结果见图2。

1泳道是非洲猪瘟病毒(ASFV)、2泳道是猪伪狂犬病病毒(PRV)、3泳道是猪瘟病毒(CSFV，疫苗株)、4泳道是猪圆环病毒2型(PCV2)、5泳道是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、6泳道是猪乙型脑炎病毒(JEV)、7泳道是猪细小病毒(PPV)，从实验结果可以看出，本引物具有很好的特异性。

实验二：试剂盒敏感性检验

将初始浓度为500ng/μl的ASFV DNA分别按1：10、1：20、1：30、1：40、1：50、1：60、1：70、1：80、1：90、1：100稀释，从每个稀释度各取2μl模板用PCR试剂盒进行检验，观察结果，实验结果见图3。

结果显示1％稀释的ASFV DNA模板也能用本试剂盒检测出来。

实验三：不同来源非洲猪瘟病毒检测能力

以IC/2/96、Katanga/63、ZAR85、NAM/1/80、Tolagna99、TAN/17/Morogoro来源的ASFV DNA为模板，用本发明PCR试剂盒扩增，实验结果见图4。

以上模板均扩增出了目的条带，说明本发明PCR试剂盒具有非常好的检测不同来源非洲猪瘟病毒的能力，具有广泛适用性。

序列表

<110> 广州博识生物科技有限公司

<120> 一种非洲猪瘟病毒检测方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 415

<212> DNA

<213> African swine fever virus

<400> 1

atgcagccta ctcaccacgc agagataagc tttcaggata gagatacagc tcttccagac 60

gcatgttcat ctatatctga tattagcccc gttacgtatc cgatcacatt acctattatt 120

aaaaacattt ccgtaactgc tcatggtatc aatcttatcg ataaatttcc atcaaagttc 180

tgcagctctt acataccctt ccactacgga ggcagtgcga ttaaaacccc tgacgatcct 240

ggtgcgatga tgattacctt tgctttgaag ccacgggagg aatatcaacc cagtggtcat 300

attaacgtat ccagagcaag agaattttat attagttggg acacggatta tgtggggtct 360

atcaccacgg ctgatcttgt ggtatcggca tctgctatta actttcttct tcttc 415

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caccacgcag agataagc 18

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gatgccgata ccacaagat 19