紫色红曲菌comp52324_c4基因过表达菌株的构建方法及其应用
文献发布时间:2023-06-19 11:59:12
技术领域
本发明涉及一种紫色红曲菌comp52324_c4基因过表达菌株的构建方法,属于生物基因工程领域。
背景技术
红曲菌是一种嗜酸性丝状腐生真菌,在许多亚洲国家特别是东亚地区作为传统食品加工的微生物。它的次级代谢产物主要包括MonacolinK、红曲色素、桔霉素、麦角固醇、γ-氨基丁酸等。Monacolin K是红曲菌产生的一种聚酮类次级代谢产物,具有降血压的功效,可以治疗心血管疾病且疗效显著。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种紫色红曲菌comp52324_c4基因过表达菌株的构建方法。
本发明通过研究发现,紫色红曲菌中comp52324_c4基因可以抑制和降低紫色红曲菌的 monacolin K产量。为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案是:
利用基因过表达技术对comp52324_c4基因进行过表达,通过电击转化方式将重组质粒导入红曲菌原生质体,并成功筛选出重组菌株。
comp52324_c4基因序列如下:
GAGTCGCTGGAGGGGTAATTTCCATCGGAGGACGAGGCAGTTGACCAGGGCTGCCTGTACTCGGAGTAAGTAGAGA TAAGTGAATCGGTGGCTGTCTCACAGCCATGACTCGGGAGCGCACGCAGAGGTGCGGTTCTTGCAGCAGGAATGAGAATT CTTGATTCTTGAGAGCAGTAGGGTATTCGCAAAAAAGACGGGATCGTAGACTCTTTTCAGGTCGAGAAGCGCAGCGATAA GGACTTTTGCCACGCGAAGGTTCTTCTAAGAGGTACCGGAAATGGTCAGAATTCAGCCAATCGAGGCTGGAGAAGCATAG TAGTCAATGCTGTATATATGACGACACGAAGGAGCGTTGGAAATAGAAGTATCATCGACTAGAGAACCGTGGTCGAAGAG AAACGAATGTTGCGGAAGTCTGGATGAAAAATCACAGCAGAGGGACAGAGATAGATAGAAGACGTGCGGGACGATAAAAG CAGCAGCGTCGAAGACATGGCGAAGGGAAGATAGATGAACAGCGTCGGATAAAGCACAGAAGAAAGAGAAGAAGCTGAAG GAAGGCGAAAAAGAAACGGCGACGCGAGGAAAAGGAAAAGCAACCGGCGATGACTTCATCCTGCATCCGTTTTTGGCAAT GCAGCAACTCTAACCAACTCCTTCTCTTGCCTTCTCTTTCTCTTCTCCTCCTCTTTCTCTATCTTCGTCTCTTCGCACTG ATTGACTTCACAATGGCAGCTGCAACGGGCATTTCCTCTCATTTTCCCCTTCCTCCTCCCCTTCAGCCCTTCTCTTCTTC CTCTTCCTCCGCTTCATCTTGACTCGCCGGTCTTTCGTTTGATTATTCGCTCGTTATTTTGATCAGCCCATTCGTTTGGC CCTTCAGGCGCTGTCTTATCCTTGTATGCCATATTTCAGCAATCCTACATACCCGTATCCT
本发明还提供一种紫色红曲菌comp52324_c4基因过表达菌株的构建方法,包括下列步骤:
(1)菌株培养
由北京工商大学食品添加剂工程技术中心保存的紫色红曲菌M1(菌种号:CGMCC.30568),将M1菌株在固体培养基(g/L)上活化2代,取菌液接种到种子培养基(g/L)中,30℃、200r/min 培养2d,按10%的接种量将种子液接种到发酵养基(g/L)中,30℃、150r/min培养2d,再25℃、150r/min培养13d。
(2)comp52324_c4基因过表达菌株的构建
设计引物序列如下:
C4-F:GAGTCGCTGGAGGGGTAATTTC;
C4-R:AGGATACGGGTATGTAGGATTG。
利用上述引物进行comp52324_c4目的基因扩增,
以pBARGPE-Hygro(武汉淼灵生物公司)为过表达载体,通过DNAman软件选出该载体上的两个单一酶切位点,通过双酶切将扩增出的comp52324_c4目的基因进行连接,构建过表达 pBARGPE-Hygro-c4重组质粒。将重组质粒转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中,并进行重组质粒的提取和验证。
(3)过表达质粒转化
将红曲霉M1接种于PDA培养基平板上,在30℃恒温培养箱中培养4d。在每个培养皿中加入10ml灭菌水,用接种环轻轻刮擦细菌表面以释放孢子,制备孢子悬浮液。将孢子悬液(200μL)涂在置于PDA板上的灭菌玻璃纸盘上,涂布至干燥,在30℃下培养30-40h。将生长在玻璃纸盘上的淡粉色菌丝体用接种环刮除,置于单层mira布上,过滤并用50ml硫酸镁溶液洗涤。过滤灭菌后的菌丝体转移到50ml的溶解酶溶液中,在30℃和60rpm下消化2.5-3 h,然后通过单层mira布再次过滤。滤液在4℃下以7000转/分离心5分钟,并丢弃上清液。然后用1.2mol L-1山梨醇溶液过滤样品两次(随后离心,并去除上清液)。原生质体在山梨醇溶液中重新悬浮,并保存在冰上以备将来使用。将红曲霉M1活性细胞悬液(100μL)涂在 PDA平板上。采用电击转化法,将成功构建的高表达质粒导入红曲原生质体中,根据潮霉素B 浓度筛选结果筛选转化子。
(4)过表达菌株的筛选和验证
将在潮霉素B抗性平板上筛选得到的阳性红曲菌转化子连续传5代,旨在筛选稳定遗传的转化子。对红曲菌阳性转化子中的Monacolin K产量进行检测,初步证明过表达菌株构建成功。利用阳性转化子的RNA,将其反转录为cDNA为模板,用Hygro-F、Hygro-R引物来扩增潮霉素基因。如果目的菌株能扩增出潮霉素基因,而对照菌株未能扩增出潮霉素基因,则证明过表达质粒在红曲菌中表达,进而证明过表达菌株构建成功。
Hygro-F、Hygro-R引物如下:
Hygro-F:ATGAAAAAGCCTGAACTC;
Hygro-R:TCTTTGCCCTCGGACG。
在申请人前期的研究中,实验室前期利用高通量测序技术对紫色红曲菌M1的转录组进行分析,发现comp52324_c4基因对降低红曲菌Monacolin K产量具有明显作用。
本发明的有益效果:
本发明成功克隆出紫色红曲菌M1菌株中的comp52324_c4基因,验证其存在,并成功构建了过表达质粒pBARGPE-Hygro-c4,导入红曲菌M1菌株中,成功构建了过表达工程菌株。结果显示,与野生型M1相比,过表达comp52324_c4菌株第15天monacolin K产量降低了36.66%。
附图说明
图1是过表达comp52324_c4菌株和野生型M1的monacolin K产量比较。
图2是重组质粒电泳图谱。
图3.潮霉素B对紫色红曲菌M1耐受浓度的筛选。
图4过表达菌株Monacolin K及其生物量的检测。
图5过表达菌株和M1菌株产色素检测。
图6过表达菌株和M1菌株在不同放大倍数下的扫描电镜照片。
图7-图15分别是mok A,mok B,mok C,mok D,mok E,mok F,mok G,mok H,mok I基因表达量变化。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供一种紫色红曲菌comp52324_c4基因过表达菌株,该菌株可以显著降低红曲 monacolin K产量。结果见图1,与野生型M1相比,过表达comp52324_c4菌株第15天monacolin K产量降低了36.66%。
实施例2
本实施例具体提供一种紫色红曲菌comp52324_c4基因过表达菌株的构建方法,并按照下列实验方法进行。
具体过程和步骤如下:
2.1 菌株及培养条件
由北京工商大学食品添加剂工程技术中心保存的紫色红曲菌M1(菌种号:CGMCC.3.0568),将M1菌株在固体培养基(g/L)(葡萄糖20g,蛋白胨3g,酵母浸粉4g,麦芽浸粉20g,琼脂20g,KH
2.2 comp52338基因过表达菌株的构建
根据已获得的红曲菌中comp52324_c4的基因序列设计引物,利用Primer Premier5.0 软件,设计引物(表1)。
本实验以pBARGPE-Hygro(武汉淼灵生物公司)为过表达载体,通过DNAman软件选出该载体上的两个单一酶切位点,通过双酶切将扩增出的comp52324_c4目的基因进行连接,构建过表达pBARGPE-Hygro-c4重组质粒。将重组质粒转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中,并进行重组质粒的提取和验证。
2.3 过表达质粒转化
将红曲霉M1接种于PDA培养基平板上,在30℃恒温培养箱中培养4d。在每个培养皿中加入10ml灭菌水,用接种环轻轻刮擦细菌表面以释放孢子,制备孢子悬浮液。将孢子悬液(200μL)涂在置于PDA板上的灭菌玻璃纸盘上,涂布至干燥,在30℃下培养30-40h。将生长在玻璃纸盘上的淡粉色菌丝体用接种环刮除,置于单层mira布上,过滤并用50ml硫酸镁溶液洗涤。过滤灭菌后的菌丝体转移到50ml的溶解酶溶液中,在30℃和60rpm下消化2.5-3 h,然后通过单层mira布再次过滤。滤液在4℃下以7000转/分离心5分钟,并丢弃上清液。然后用1.2mol L-1山梨醇溶液过滤样品两次(随后离心,并去除上清液)。原生质体在山梨醇溶液中重新悬浮,并保存在冰上以备将来使用。将红曲霉M1活性细胞悬液(100μL)涂在 PDA平板上。采用电击转化法,将成功构建的高表达质粒导入红曲原生质体中,根据潮霉素B 浓度筛选结果筛选转化子。
2.4 过表达菌株的筛选和验证
将在潮霉素B抗性平板上筛选得到的阳性红曲菌转化子连续传5代,旨在筛选稳定遗传的转化子。对红曲菌阳性转化子中的Monacolin K产量进行检测,初步证明过表达菌株构建成功。利用阳性转化子的RNA,将其反转录为cDNA为模板,用Hygro-F、Hygro-R引物来扩增潮霉素基因。如果目的菌株能扩增出潮霉素基因,而对照菌株未能扩增出潮霉素基因,则证明过表达质粒在红曲菌中表达,进而证明过表达菌株构建成功。
2.5 色价检测
发酵液的预处理:取发酵液5mL,加入15mL 70%的乙醇溶液,于恒温水浴锅60℃浸提1h,静置。用分光光度计测定410、448、505nm处吸光值。利用公式:红曲色素色价(U/mL)=吸光值×稀释倍数,计算得出。
2.6 干重测定
采用干重法测菌丝体生物量。取5mL发酵液用3层纱布过滤,再用蒸馏水洗涤2-3次,拧干水分,在60℃烘箱中烘干至恒重,即为菌丝体干重。
2.7 扫描电镜处理
培养8d的红曲菌菌体,12000r/min离心5min收集菌体细胞,将细胞重悬(用枪头吹打,吹打时注意不要将细胞吸入枪头造成细胞损失)于2.5%戊二醛溶液(PBS缓冲溶液稀释)固定12h。用0.1M磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.2)漂洗细胞两次(两次重悬离心)弃去上清液。依次用不同浓度的乙醇溶液(30%,50%,70%,80%,90%,100%)对细胞进行脱水,每种浓度静置10min,12000r/min离心5min(每种浓度重复两次),弃去上清液。先把菌体重悬于醋酸异戊酯与乙醇(v:v=1:1)中,再重悬与醋酸异戊酯溶液中,以对细胞进行乙醇置换。将细胞重悬于每种溶剂中静置10min,12000r/min离心5min,弃去上清液。加入溶剂六甲基二硅胺(Hexamethyl Disilazane,HMDS),用量没过样品即可,用脱脂棉将离心管口塞上,置于60℃烘箱干燥直至样品成粉末状,留待观察。
2.8 Monacolin K合成相关基因的转录量分析
1.菌体的收集及处理
分别取不同培养天数的红曲菌发酵液置于2mL离心管中,用无菌水洗涤离心直至上清液不再呈红色,吸除离心管中残余水分。首先进行红曲菌RNA的提取,再将其反转录成cDNA以用于荧光定量分析。
2.引物的设计与合成
用Olige7.37软件,根据NCBI网站公开的红曲菌合成Monacolin K关键基因组序列,选取 mok A、mok B、mok C、mok D、mok E、mok F、mok G、mok H、mok I九段基因组、内参基因 GAPDH以及c3基因序列,表1为设计得到的RT-qPCR的引物序列,由华大基因科技有限公司制备合成。
表1关键基因的引物序列
1.荧光定量分析
根据天根生化科技(北京)有限公司的SuperReal荧光定量预混试剂增强版(SYBRGreen) 试剂盒说明书设计反应体系并进行扩增。操作方法如下:
(1)RT-qPCR反应体系:
本研究反应体系如下表2所示。
表2荧光定量PCR反应体系
(2)RT-qPCR反应条件:
1)95℃ for 15min;
2)95℃ for 10sec;
3)52℃ for 20sec;
4)72℃ for 30sec;
5)GOTO2,40more times;
6)Melt Curve 65℃ to 95℃:Increment 0.5℃ 5sec;
(3)提前设置好反应程序,荧光定量PCR仪中放入样品,开始反应。
3结果
3.1 重组质粒的验证
为了验证重组质粒是否构建成功,首先进行双酶切验证,并以原质粒做对照。对重组质粒 pBARGPE1-Hygro-c4进行双酶切后,得到两段大小分别在6000bp左右和900bp左右的清晰条带,与目标条带大小一致。(图2b)再对重组质粒pBARGPE1-Hygro-c4进行电泳验证,发现长度在6900bp左右,均符合目的基因片段与原质粒长度之和。(图2d)
3.2 过表达菌株潮霉素基因的PCR验证
通过HPLC初步筛选出高产Monacolin K的转化子后,对c4-9菌株进行潮霉素基因的PCR 验证。分别提取红曲菌M1菌株和c4-9菌株的RNA,再将其反转录成cDNA。以cDNA为模板, Hygro-F和Hygro-R为引物进行扩增潮霉素基因。结果显示,对照菌株红曲菌M1菌株未能扩增出明显条带,而c4-9菌株能扩增出1000bp左右条带,与预期结果一致。证明c4-9过表达菌株构建成功。(图2f)
3.3 重组质粒转化子的筛选
选取100μL红曲菌孢子悬液分别涂布于不同浓度梯度的潮霉素B抗性平板上。潮霉素浓度增长的同时,M1菌株的菌落数减少,最终选择潮霉素B的最佳筛选抑制浓度为10 μg/mL。在随后的过表达质粒的转化子的筛选过程中,实验发现当潮霉素B浓度为10μg/mL 时,加入质粒的红曲菌菌株有菌落生长,而未加入质粒的红曲菌M1菌株则无菌落生长。因此,挑取潮霉素B浓度为10μg/mL抗性板上的菌落,从而成功获得具有潮霉素B抗性的转化子。 (图3)将分别获得的11株转化子在具有潮霉素B抗性的平板上传5代,再进行发酵培养。将c4的11株转化子与M1进行发酵培养后,取菌液处理,利用HPLC测定monacolin K产量。结果发现在c4的11株菌株中,第9株(编号为c4-9)产量最低,达到51mg/L(图4b)。因此实验选择c4-9分别作为目标菌株。
3.4 生物量
通过比较c4-9和M1菌株在不同发酵天数下菌丝干重的差异,研究了comp52324_c4基因过表达对红曲霉菌丝生长的影响。结果显示c4-9和M1菌株的菌丝体生长趋势相似,差异不显著。
(图4d)
3.5 过表达菌株红曲色素产量检测
通过紫外分光光度计分别检测2,5,8,12,15d的c4-9菌株和M1菌株的红曲红色素、红曲橙色素和红曲黄色素。
三种色素的产量变化总体呈现上升趋势,在第15d时产量达到最高。c4-9和M1菌株对比,三种色素在第15d时产量达到最高,在第15d时,c4-9菌株三种色素产量与M1相比分别提高了16%,19.76%,23.05%。(图5)
3.6 过表达菌株微观菌体形态的检测
扫描电镜观察c4-9和M1菌株菌丝体的形态差异。对比相同倍数下的C4-9菌株和M1菌株的菌丝体,发现在凹陷程度和颗粒数上没有显著变化,但c4-9菌株的褶皱程度比M1菌株更多(图6b)
3.7 Monacolin K生物合成基因转录水平检测
利用RT-qPCR技术检测过表达菌株c4-9和野生型菌株中Monacolin K生物合成基因簇上mok A-mok I九段基因的表达量。结果如图7-15所示,mok A基因的表达量在发酵第12天较 M1菌株下降了71.24%,在第15天下降了94.14%。在发酵第12天,c4-9菌株的大多数基因的表达量较M1菌株下调,包括mok A,mok B,mok C,mok D,mok E,mok F,mok G,mokH, mok I基因等,其中mok C基因表达量下降了86.26%。
序列表
<110> 北京工商大学
<120> 紫色红曲菌comp52324_c4基因过表达菌株的构建方法及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagtcgctgg aggggtaatt tc 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aggatacggg tatgtaggat tg 22
- 紫色红曲菌comp52324_c4基因过表达菌株的构建方法及其应用
- 紫色红曲菌comp52338_c2基因过表达菌株的构建方法及其应用