一种非洲猪瘟PCR检测方法
文献发布时间:2023-06-19 12:04:09
技术领域
本发明属于生物检测技术领域,具体涉及一种非洲猪瘟PCR检测方法。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(African swinefever virus,ASFV)感染引起的急性、热性、烈性、接触性传染病,猪感染后,主要临床症状表现为高热、食欲废绝、皮肤发绀,剖检后会发现淋巴结、肾、胃肠黏膜等出血,毒力强的毒株感染猪后,造成的病死率可高达100%,其传染性强、发病快、致死率高,对生猪养殖危害巨大,是需要高度防范的传染病,是世界动物卫生组织要求法定报告的动物疫病,同时也是《中华人民共和国动物防疫法》规定的一类疫病。
非洲猪瘟病毒是具有囊膜的双链DNA病毒,病毒基因组长度在170-190kb之间,编码大概150-200种蛋白质,ASFV的p30蛋白是一种很重要的结构蛋白,由CP204L基因编码,有很强的免疫原性,能诱导机体产生中和抗体,为病毒的早期蛋白,在感染后4h胞浆内即可检测到。
2018年之前,中国没有非洲猪瘟,此次非洲猪瘟爆发,在我国已形成较大污染面,受其影响,我国生猪、能繁母猪存栏量快速下降,猪肉价格全国普涨,对我国居民的生活质量造成很大影响,PCR检测具有检测特异性高、灵敏度强、操作简单、可大批量检测等特点,ASFV的p30序列保守,针对p30序列设计出具有高度保守引物序列的PCR检测方法,可以更好应对非洲猪瘟变异。
发明内容
本发明的目的在于提供一种非洲猪瘟PCR检测方法,该方法针对ASFV p30保守序列,可以检测多种变异非洲猪瘟病毒。
为达到上述目的,本发明通过以下技术方案实现:
1.从NCBI上获得非洲猪瘟p30序列,利用NCBI引物设计功能,设计高度保守的引物序列,设计的引物序列为:Primer F:5’-TGCAGGGCAAGGGTATACTG-3’(Seq ID No.1),R:5’-CCTCTGATGAGGGCTCTTGC-3’(Seq ID No.2),长度185bp;
2.一种非洲猪瘟病毒PCR检测方法,包括以下步骤:
1)从样品中提取病毒DNA;
2)以提取的DNA为模板,用设计好的引物对进行PCR扩增;
进一步的,扩增体系如下:10×Ex Taq Buffer 2.0μl、1U/μl Ex Taq Hot-startDNA聚合酶0.3μl、10μM引物1μl、2.5mM dNTPs 2.0μl、20mM MgCl
进一步的,PCR扩增程序为:95℃5min、(95℃30s、55℃30s、72℃30s)35个循环,72℃10min、4℃∞;
3)对扩增产物进行分析,如果扩增产物出现185bp大小的条带,说明待测样品中含有非洲猪瘟病毒。
本发明的有益效果是:
本发明基于ASFV p30基因的高度保守区域设计引物,该序列具有灵敏度高、特异性好、适用度高的优点。
附图说明
图1特异性检验结果图
图2敏感性检验结果图
图3不同来源非洲猪瘟病毒检测
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步详细说明,实施例仅用来说明本发明,并不限制本发明的范围。
实施例1
1.主要试剂
Ex Taq Buffer、Ex Taq Hot-start DNA聚合酶、MgCl
2.主要仪器
Sigma 3K-15高速冷冻离心机、SW-CJ-IBU超净工作台、PTC-200型PCR扩增仪、TAZ-C型恒温摇床、DYY-6D核酸电泳仪、UV2450紫外凝胶成像系统;
3.从NCBI上获得非洲猪瘟p30序列,利用NCBI引物设计功能,设计高度保守的引物序列,设计的引物序列为:Primer F:5’-TGCAGGGCAAGGGTATACTG-3’(Seq ID No.1),R:5’-CCTCTGATGAGGGCTCTTGC-3(Seq ID No.2),长度185bp,序列保守对比见序列表;
4.样品DNA
ASFV p30 DNA序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,连接于pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α,扩大培养,抽提质粒DNA;
5.PCR扩增
以ASFV DNA为模板,PCR体系为:10×Ex Taq Buffer 2.0μl、1U/μl Ex Taq Hot-start DNA聚合酶0.3μl、10μM引物1μl、2.5mM dNTPs 2.0μl、20mM MgCl
6.对扩增产物进行分析,如果扩增产物出现185bp大小的条带,说明待测样品中含有非洲猪瘟病毒。
实验一特异性检验
1.主要病毒株
猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV,疫苗株)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪细小病毒(PPV)DNA样品由广东省动物疫病预防控制中心提取;
2.以上述DNA为模板,用设计的引物PCR扩增,观察结果,结果见图1。
由实验结果可以看出,以PRV、CSFV、PCV2、PRRSV、JEV、PPV DNA为模板,不能扩增出特异条带,本试剂盒有很好的特异性。
实验二:敏感性检验
将初始浓度为300ng/μl的ASFV DNA分别按1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100稀释,从每个稀释度各取3μl用本方法进行检验,观察结果,实验结果见图2。
结果显示1%稀释的ASFV DNA模板也能用本方法检测出来。
实验三:不同来源非洲猪瘟病毒检测能力
1.ASFV 97/Ot/2012、72407/Ss/2005、26/Ss/2004、56/Ca/1978、OURT 88/3、Benin97/1DNA、47/Ss/200、NHV、CMR/yde76c/2012、CMR/kssri60b/2010、CMR/yde54c/2013、CMR/gra18b/2010序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,连接于pUC57载体;
2.以上述ASFV DNA为模板,用本发明方法扩增,实验结果见图3。
1泳道为97/Ot/2012、2泳道为72407/Ss/2005、3泳道为26/Ss/2004、4泳道为56/Ca/1978、5泳道为OURT 88/3、6泳道为Benin 97/1、7泳道为47/Ss/200、8泳道为NHV、9泳道为CMR/yde76c/2012、10泳道为CMR/kssri60b/2010、11泳道为CMR/yde54c/2013、12泳道为CMR/gra18b/2010,以上模板均扩增出了目的条带,说明本发明方法具有非常好的检测不同毒株非洲猪瘟病毒的能力,具有很好的适用性。
序列表
<110> 广州博识生物科技有限公司
<120> 一种非洲猪瘟PCR检测方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgcagggcaa gggtatactg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cctctgatga gggctcttgc 20
- 一种猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光PCR检测试剂、试剂盒和检测方法
- 一种非洲猪瘟PCR检测方法