一种核酸-抗体双重癌症检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体的涉及一种核酸-抗体双重癌症检测试剂盒。

背景技术

在全世界，膀胱癌是泌尿系统中发病率最高的恶性肿瘤，尿路上皮癌是最常见的病理类型。在男性恶性肿瘤，膀胱癌发病率居第4位，死亡率居第9位，男女发病率比例为3:1。每年新确诊膀胱肿瘤患者超过33万例，超过13万人死于膀胱癌。超过2/3的患者确诊时为非肌层浸润性膀胱尿路上皮癌，但术后极易复发且10％～30％的复发患者会进展为肌层浸润性膀胱尿路上皮癌，其中约30％的患者确诊时已发生远处器官转移。所以建立快速、准确的检测膀胱癌的方法，对于膀胱癌患者的临床诊断和及时有效的治疗具有重大的意义。

CXCL1(Chemokine(C-X-C motif)ligand 1)，即趋化因子CXC基序配体1，是属于CXC趋化因子家族的细胞因子，其先前也称GRO1(Human growth-regulated oncogene 1，生长调节致癌基因1)，KC(Keratinocyte chemoattractant，角化细胞趋化物)，NAP-3(Neutrophil-activating protein 3，嗜中性粒细胞活化蛋白3)和MSGA-α(Melanomagrowth stimulating activity alpha，黑素瘤生长刺激素α)。在人类中，该蛋白由cxcl1基因编码，位于人类4号染色体。CXCL1在巨噬细胞、中性粒细胞和上皮细胞中表达，并呈现中性粒细胞趋化活性，CXCR2是CXCL的趋化因子受体，与CXCL1结合后表现出趋化作用。研究表明，CXCL1是在膀胱癌中高表达，并且在分化差、临床分期晚、有复发的病例中，其表达程度明显高于分化好、临床分期早、无复发的病例，因此CXCL1可作为尿路上皮细胞肿瘤标志物，用于膀胱癌的的诊断与提前干预、治疗。“W02007026895”公开了以CXCL1蛋白质作为肿瘤标记物，用于检测尿路上皮癌的用途，W02010/050554公开了CXCL1抗体及其检测试剂盒，但对新的CXCL1检测试剂盒仍然存在很大的需求。因此，开发一种制备简单、成本低廉、使用方便、不需要高精尖仪器的检测方法是目前研究的一个重要方面。

发明内容

基于上述发现，本发明的首要目的在于提供一种新的膀胱癌检测试剂盒。本发明克服现有技术的缺陷，提供了一种制备简单、成本低廉、使用方便、不需要高精尖仪器的检测试剂盒。所述试剂盒通过核酸-抗体双重检测方法对膀胱癌患者进行检测，进一步提高检测的准确性。

本发明提供以下技术方案：

本发明提供一种针对CXCL1的核酸检测试剂，所述核酸检测试剂包含检测引物对和探针，所述上游引物序列如SEQ ID NO:2所示，所述下游引物序列如SEQ ID NO:3所示，所述探针的序列如SEQ ID NO:4所示。

在一些实施例中，本发明的探针在探针中间距5’端36bp的位置处采用dSpacer修饰，dSpacer分子两侧的距5’端34bp和39bp位置的胸腺嘧啶(dT)分别被荧光基团FAM和淬灭基团BHQ1取代，并且在探针的3’末端通过阻塞基团C3Spacer修饰。

一种特异性结合CXCL1的单克隆抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区含有CDR1区、CDR2区和CDR3区，重链CDR1区、CDR2区和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQID NO:7、8和9所示；该轻链可变区含有CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中轻链CDR1区、CDR2区和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:10、11和12所示。

另一方面，本发明提供一种特异性结合CXCL1的单克隆抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:5，轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:6。

在一些实施方案中，本发明所述的抗CXCL1抗体包含两条重链和两条轻链，或由两条重链和两条轻链构成，其中各重链包含上述的重链恒定区序列、重链可变区序列或CDR序列，且各轻链包含上述的轻链恒定区序列、轻链可变区序列或CDR序列。本发明的抗体可以是全长抗体，所述全长抗体包含恒定区，所述全长抗体轻链恒定区进一步包含鼠源κ、λ链序列。所述全长抗体重链恒定区进一步包含鼠源IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA或IgM序列。

在一些实施方式中，本发明的抗CXCL1抗体是由上述的抗CXCL1抗体或抗体片段形成的Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子或多特异性抗体。

在一些实施方式中，本发明所述的抗CXCL1抗体用于在制备膀胱癌诊断试剂盒的应用。

在一些实施方式中，本发明所述的针对CXCL1的核酸检测试剂用于在制备膀胱癌诊断试剂盒的应用。

在一些实施方式中，本发明提供一种核酸-抗体双重检测膀胱癌的试剂盒，所述试剂盒含有特异性检测CXCL1核酸的RPA试剂盒以及特异性检测CXCL1的含有单克隆抗体的ELISA试剂盒；

在一些实施方式中，本发明提供一种核酸-抗体双重检测膀胱癌的试剂盒，所述试剂盒含有特异性检测CXCL1核酸的RPA试剂盒以及特异性检测CXCL1的含有单克隆抗体的ELISA试剂盒；其中，所述RPA试剂盒含有SEQ ID NO：2和3的引物以及SEQ ID NO：4的探针；所述ELISA试剂盒包括抗CXCL1单克隆抗体包被的酶标板和抗CXCL1酶标抗体；所述抗CXCL1单克隆抗体包括重链可变区，其包含SEQ ID NO:7所示的CDR1、SEQ ID NO:8所示的CDR2和SEQ ID NO:9所示的CDR3,以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:10所示的CDR1、SEQ ID NO:11所示的CDR2和SEQ ID NO:12所示的CDR3。

在一些实施方式中，本发明提供一种核酸-抗体双重检测膀胱癌的试剂盒，所述试剂盒含有特异性检测CXCL1核酸的RPA试剂盒以及特异性检测CXCL1的含有单克隆抗体的ELISA试剂盒；其中，所述RPA试剂盒含有SEQ ID NO：2和3的引物以及SEQ ID NO：4的探针；所述ELISA试剂盒包括抗CXCL1单克隆抗体包被的酶标板和抗CXCL1酶标抗体；所述抗CXCL1单克隆抗体包括重链可变区，其包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列,以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

一种检测膀胱癌试剂盒的应用，所述试剂盒通过体外测定来自受试者的生物试样中的CXCL1蛋白质、或编码该蛋白质的基因的表达。

在一些实施方式中，本发明所述的生物试样为血液、血浆、血清、尿、膀胱组织或细胞。

有益效果

本发明通过特异性针对CXCL1的RPA引物和探针，制备CXCL1核酸检测试剂；同时针对CXCL1抗原筛选并获得效果较好的单克隆抗体，将所述单克隆抗体制备成用于检测CXCL1蛋白的试剂盒，将以上两个检测方法进行组合使用，用于膀胱癌患者的诊断，能够进一步提高检测的准确性，并且成本低廉，适于大规模推广使用。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。

图1RPA方法检测细胞中CXCL1 mRNA表达。

图2CL107特异性结合CXCL1。

图3ELISA方法检测CXCL1蛋白。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1.RPA特异性检测引物的设计

将CXCL1的基因序列与其同族序列进行比对，选择较特异性的区域作为引物检测的靶标区，其序列如SEQ ID NO:1所示。

根据RPA引物设计的规则并对引物进行优化，获得了特异性的引物序列，其序列如下所示：

上游引物(SEQ ID NO:2)：

CGAGTGGCACTGCTGCTCCTGCTCCTGGTAGCCG

下游引物(SEQ ID NO:3)：

CTATGGGGGATGCAGGATTGAGGCAAGCTTTCC

探针序列(SEQ ID NO:4)：

GAATTCACCCCAAGAACATCCAAAGTGTGAACGTGAAGTCCCCCGGACCC,在探针中间距5’端36bp的位置处采用dSpacer修饰，dSpacer分子两侧的距5’端34bp和39bp位置的胸腺嘧啶(dT)分别被荧光基团FAM和淬灭基团BHQ1取代，并且在探针的3’末端通过阻塞基团C3Spacer修饰。

实施例2.RPA方法检测CXCL1基因表达

分别培养膀胱癌细胞株T24和正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1。使用Trizol试剂(Thermo公司)并依据说明书提取细胞总RNA。以提取的RNA作为模板，进行RPA试验，采用实施例1设计的引物进行RPA扩增，同时设置超纯水为阴性对照，反应40℃反应时长(即扩增循环数)分别为25min，RPA反应体系为50μl，其中，2μl正反向引物(10μM)，2μl反向引物(10μM)，0.6μl探针，25μl含重组酶、DNA聚合酶、单链结合蛋白、核酸内切酶IV、逆转录酶的缓冲液，1μl模板和17.9μlddH2O，充分振荡混匀并且瞬离，最后加入2.5μl的280mM醋酸镁(MgOAc)，将反应管置于实时荧光PCR仪中40℃恒温反应相应时长；结果如图1所示，CXCL1基因在膀胱癌细胞株T24中高度表达,在人正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1中虽能够检测到CXCL1表达，但膀胱癌细胞株中CXCL1的mRNA水平显著高于人正常膀胱上皮细胞。

实施例3.抗CXCL1抗体制备

将100μg的CXCL1抗原与等体积完全福氏佐剂(CFA)充分混匀形成水状油包后，通过腹腔注射，初次免疫BALB/C小鼠。3周后将100μg的CXCL1与不完全福氏佐剂(IFA)等体积混匀乳化，采用背部多点注射进行加强免疫。此后每隔2周加强免疫一次，每次免疫后第7天取尾血，用ELISA法检测抗体效价。当抗体效价适当时，将100μg的CXCL1抗原与不完全福氏佐剂(IFA)等体积混匀乳化，采用背部多点注射进行末次免疫。于第四天取脾，进行细胞融合。取免疫后的Balb/c小鼠脾细胞，将其与骨髓瘤Sp2/0细胞株融合，将融合后的细胞用含有10％血清的Iscove培养基(0.1mM次黄嘌呤，0.4μM氨基蝶呤和16μM胸苷)稀释，稀释至适宜浓度后，加入96孔板内进行培养。10天后，取细胞上清，高通量ELISA法检测上清中与CXCL1蛋白表现出阳性反应的原代培养物。再将此孔内的杂交瘤细胞进行稀释进行亚克隆，同样以ELISA方法进行筛选，最终获得阳性杂交瘤细胞株并将其命名为CL-107。扩大培养后，冻存杂交瘤细胞。

实施例4.单克隆抗体的纯化

取BALB/c小鼠，在接种杂交瘤细胞前1周，经腹腔注射降植烷，0.5ml/只。1周后，每只小鼠经腹腔接种约1X10

实施例5.抗CXCL1抗体亚型鉴定

根据亚类测定试剂(sigma公司)对间接ELISA筛选出的阳性鼠单克隆细胞株进行亚类测定。试剂盒中提供的酶标板上已经预包被了针对小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM、kappa轻链、lambda轻链的特异性抗体，将实施例4中纯化的抗CXCL1抗体样品加入样品孔中，每孔50μl，无需孵育。将1X羊抗鼠IgA+IgM+IgG-HRP加入样品孔中，每孔50μl，轻轻混匀后，孵育1h。扣去孔中液体加入1XPBST洗孔3次，吸水纸吸干多余水分。加入显色液，每孔100μl，室温避光显色15min。加入100μl终止液，终止显色反应。结果显示，本发明的单克隆抗体为IgG2b型鼠单克隆抗体，命名为CL-107。

实施例6.单克隆抗体序列确定

从液氮中取出CL-107杂交瘤细胞细胞冻存管，于37℃快速融解，1000rpm，5min离心去除冻存液，置于100mm孔板，培养至占培养板约80％，加入1ml Trizol试剂(Thermo公司)，并依据说明书提取杂交瘤细胞总RNA。

取2.5μg上述总RNA，加入DECP水，使体积达到11μl，加入1.0μl oligo(dT)(10μM)，加入1μl dNTPs(10mM)，混合均匀，65℃孵育5分钟后置冰上1分钟，然后加入4μl RT buffer(5×)，1.0μl DTT(100mM)，1μl Ribonuclease Inhibitor及1μl逆转录酶(takara公司)，50℃反应10min。80℃孵育10分钟以终止反应，获得的cDNA保存在-20℃。设计特异性的巢式PCR引物，该扩增反应中所使用的引物序列与抗体可变区第一框架区和恒定区互补，采用常规PCR方法扩增目的基因。其中，引物序列的设计按照文献(Bodo Brocks.Species-Crossreactive scFv Against the Tumor Stroma Marker“Fibroblast ActivationProtein”Selected by Phage Display From an Immunized FAP-

测序结果显示,本发明所述的抗CXCL1抗体CL-107的重链和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；该抗体的重链可变区3个CDR的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9所示；轻链可变区3个CDR的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示。

实施例7.抗体特异性鉴定

采用间接ELISA法，将实施例4纯化的单抗分别与CXCL1的同族蛋白CXCL2、CXCL5、CXCL8包被的酶标板进行交叉反应，分析其特异性。具体的实验过程为分别包被CXCL1、CXCL2、CXCL5、CXCL8,浓度为0.1mg/ml,将实施例3获得的抗体分别加入四种不同的包被抗原中,通过间接ELISA检测交叉反应程度。实验结果如图2所示，抗CXCL1单克隆抗体CL-107仅与CXCL1反应，不与CXCL2、CXCL5、CXCL8交叉反应。

实施例8.抗CXCL1抗体亲和力测定

将抗体捕获抗体(AHC)通过氨基偶联的方式包被在CM5芯片表面，参照氨基偶联试剂盒和抗捕获试剂盒说明书，准备芯片活化缓冲液盐酸N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、AHC和封闭用的乙醇胺，选择Biacore3000系统中的包被程序，将AHC氨基偶联在CM5芯片表面。将实施例4中获得的抗CXCL1抗体CL-107捕获于芯片表面。用HBS-EP+缓冲液将抗体稀释至1μg/mL，设置流速为5μl/min，包被至响应值达300RU。CXCL1抗原设置7个不同浓度梯度，用HBS-EP缓冲液依次进行2倍梯度稀释，浓度从40nM到0nM。设置CXCL1抗原的流速为30μl/min，结合时间为3min。设置HBS-EP+缓冲液流速为30μl/min，解离时间为10min。使用3M MgCl

表一

实施例9.ELISA法检测CXCL1

将实施例4得到的抗CXCL1单克隆抗体CL-107和对照抗体IgG1-14稀释至2μg/ml,分别加入酶标板孔中,每孔100μl；上述酶标板置于4℃环境下包被过夜；每孔分别加入100μl封闭液,置于37℃温箱,30分钟；从温箱取出酶标板后弃去封闭液。将CXCL1蛋白用人工血清进行稀释,稀释后浓度分别是200、100、50、25、10、5、1pg/ml。每孔中加入100μl，在37℃温箱,孵育1h。去上清，后用PBST清洗后。用CXCL1抗原免疫家兔获得抗CXCL1多克隆抗体，将其用辣根过氧化物酶标记后获得酶标抗体。将其加入孔中，每孔中加入100μl，在37℃温箱，孵育30分钟。去上清，每孔中加入200μl PBST洗液，静置2min，扣去洗液，重复洗涤3次。每孔中加入100μl TMB，室温避光孵育15-30min。每孔中加入50μl终止液，终止显色反应。将酶标板放入酶标仪中，检测450nm波长处的吸光值。结果如图3所示，本发明的抗CXCL1单克隆抗体CL-107信号强度高于对照抗体IgG1-14，人CXCL1的检测能力更高。

序列表

<110> 北京保图生物技术有限公司

<120> 一种核酸-抗体双重癌症检测试剂盒

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 229

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgagtggcac tgctgctcct gctcctggta gccgctggcc ggcgcgcagc aggagcgtcc 60

gtggccactg aactgcgctg ccagtgcttg cagaccctgc agggaattca ccccaagaac 120

atccaaagtg tgaacgtgaa gtcccccgga ccccactgcg cccaaaccga agtcatagcc 180

acactcaaga atgggcggaa agcttgcctc aatcctgcat cccccatag 229

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgagtggcac tgctgctcct gctcctggta gccg 34

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctatggggga tgcaggattg aggcaagctt tcc 33

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaattcaccc caagaacatc caaagtgtga acgtgaagtc ccccggaccc 50

<210> 5

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Ala

20 25 30

Glu Pro Asp Trp Val Arg Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ile Ala Gly Pro Thr Asn Lys Glu Tyr Met Thr Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Phe Arg Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Gln Pro Asp Thr Asn Tyr Met Asn Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Ile Phe Thr Val Ser Ser

115

<210> 6

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Asp Val Gln Met Thr Gln Thr Pro Ser Ala Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ala Arg Ile Thr Pro Lys Gly Asp Thr

20 25 30

Cys Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Thr Ala Ile Asp Gly Cys Lys Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gly Ala Pro Ser Ile Asn Leu Cys

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Arg Ala Glu Pro Asp

1 5

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Asn Ile Ala Gly Pro Thr Asn Lys Glu Tyr Met Thr Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Gly Gly Gln Pro Asp Thr Asn Tyr Met Asn

1 5 10

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Ala Arg Ile Thr Pro Lys Gly Asp Thr Cys Ser

1 5 10

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Thr Ala Ile Asp Gly Cys Lys

1 5

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Gly Ala Pro Ser Ile Asn Leu Cys Thr

1 5