一种灭活型病毒保存液配方及其制作方法

技术领域

本发明涉及灭活型病毒保存液制作技术领域，具体涉及一种灭活型病毒保存液配方及其制作方法。

背景技术

2019新型冠状病毒（2019-nCoV）是2019年在人体中发现的冠状病毒新毒株，属于β属冠状病毒，人感染了该病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等，在较严重的病例中，感染可导致肺炎性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。最新研究成果揭示2019-nCoV的传播特征是高传染性和高隐蔽性，是否携带2019-nCoV成为判断是否感染的关键临床指标之一，临床也用两次2019-nCoV核酸检测均为阴性作为治愈标准。

《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南》中对于采集咽拭子、痰液和肺泡灌洗液要加入病毒专用保存液（常用Hank’s溶液），检验前样本需做56℃以上孵育30分钟灭活处理。现在普遍用于新冠病毒样本采集的病毒保存液是可保存病毒活性的等渗盐溶液或磷酸盐缓冲液，虽可以保存细胞从而保护病毒活性，但无法抵御细菌真菌生长，容易造成污染，影响长期保存和病毒检测，同时有活性的病毒具有传染性，使运输和检测人员处于被感染风险中，特别是高传染性、高致病性的2019-nCoV；另一方面，2019-nCoV感染在秋冬季达到高峰，现有的病毒保存液在此环境下容易被冻成固体状态，影响临床医务人员采样；由此有必要对现有病毒保存液进行改进，以解决上述几个问题。

发明内容

本发明的目的是解决现在普遍用于新冠病毒样本采集的病毒保存液是可保存病毒活性的等渗盐溶液或磷酸盐缓冲液，虽可以保存细胞从而保护病毒活性，但无法抵御细菌真菌生长，容易造成污染，影响长期保存和病毒检测，同时有活性的病毒具有传染性，使运输和检测人员处于被感染风险中，特别是高传染性、高致病性的2019-nCoV；另一方面，2019-nCoV感染在秋冬季达到高峰，现有的病毒保存液在此环境下容易被冻成固体状态，影响临床医务人员采样的问题；本发明的灭活型病毒保存液配方及其制作方法，实现了保存液安全无毒，可在低温下保持液体状态，方便采样，可灭活病毒并保护RNA酶降解病毒。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种灭活型病毒保存液配方，包括以下组分及各组分的重量数为：

蛋白变性剂：高浓度胍盐，盐酸胍、异硫氰酸胍中的一种或多种组合，5-20g；

RNA酶抑制剂：0.5-2g；

缓冲稳定剂：Tris2-6g；

表面活性剂：十二烷基肌氨酸钠1-4g；

酸碱指示剂：0.001-0.01g；

防冻剂：0.2-1g。

前述的灭活型病毒保存液配方，所述RNA酶抑制剂采用的是EDTA、异硫氰酸胍中的一种或多种组合。

前述的灭活型病毒保存液配方，所述酸碱指示剂采用的是碱性品红、中性品红中的一种。

前述的灭活型病毒保存液配方，所述防冻剂为丙三醇、二甲亚矾和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种组合。

前述的灭活型病毒保存液配方，包括以下组分及各组分的重量数为：

蛋白变性剂15g，其中高浓度胍盐、盐酸胍和异硫氰酸胍按1：1：1的比例组合；

RNA酶抑制剂1.4g，其中EDTA、异硫氰酸胍按5：2的比例组合；

Tris4.5g；

十二烷基肌氨酸钠3.2g；

中性品红0.008g；

防冻剂0.7g，其中丙三醇、二甲亚矾和聚乙烯吡咯烷酮按2:2:3的比例组合。

一种灭活型病毒保存液的制作方法，包括以下步骤：

步骤（A），配置缓冲稳定溶液，将Tris2-6g量取并加入至定量容器内部，再加入生理盐水定容至100ml；

步骤（B），缓冲稳定溶液中加入蛋白变性剂，将蛋白变性剂5-20g量取放置玻璃容器中混合，其中蛋白变性剂采用高浓度胍盐，盐酸胍、异硫氰酸胍中的一种或多种组合，混合后加入至缓冲稳定溶液内部，再搅拌3-5min至均匀，制成混合液A；

步骤（C），混合液A中加入RNA酶抑制剂，将RNA酶抑制剂0.5-2g量取并加入至混合液A内部，其中RNA酶抑制剂采用EDTA、异硫氰酸胍中的一种或多种组合，再搅拌1-2min至均匀，制成混合液B；

步骤（D），混合液B中加入表面活性剂，将十二烷基肌氨酸钠1-4g量取并加入至混合液B中，搅拌3-5min至均匀，制成混合液C；

步骤（E），混合液C中加入防冻剂，将防冻剂0.2-1g量取并加入至混合液C中，其中防冻剂采用丙三醇、二甲亚矾和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种组合，再搅拌1-2min至均匀，制成保存液；

步骤（F），保存液中加入酸碱指示剂，将中性品红0.001-0.01g量取并加入至保存液内部，再搅拌3-5min至均匀。

前述的灭活型病毒保存液制作方法，步骤（F），保存液中加入酸碱指示剂，将中性品红0.001-0.01g量取并加入至保存液内部，再搅拌3-5min至均匀，具体过程为：

（F1），量取中性品红0.001-0.01g至玻璃容器中，并研磨1-2min至均匀；

（F2），将玻璃容器中的中性品红加入至配置好的保存液中，并搅拌3-5min至均匀；

（F3），灭活型病毒保存液的pH值6.0-8.0，搅拌过程中观察保存液的颜色，若为黄色则封装保存液，若为红色则缓慢滴入生理盐水并搅拌，使保存液刚好由红色变为黄色时停止加入生理盐水，再搅拌1min保存液无明显颜色变化后封装保存液。

前述的灭活型病毒保存液制作方法，步骤（A）Tris为4.5g；步骤（B）蛋白变性剂为15g，其中高浓度胍盐、盐酸胍和异硫氰酸胍按1：1：1的比例组合；步骤（C）RNA酶抑制剂为1.4g，其中EDTA、异硫氰酸胍按5：2的比例组合；步骤（D）十二烷基肌氨酸钠为3.2g；步骤（E）防冻剂为0.7g，其中丙三醇、二甲亚矾和聚乙烯吡咯烷酮按2:2:3的比例组合；步骤（F）中性品红为0.008g。

本发明的有益效果是：

本发明的灭活型病毒保存液配方及其制作方法，首先通过蛋白变性剂能与尿素和盐酸胍优先结合，形成变性蛋白质-变性剂复合物，当复合物被除去，从而引起N→D反应平衡向右移动，随着变性剂浓度的增加，天然状态的蛋白质不断转变为复合物，最终导致蛋白质完全变性，这样使得蛋白质具有的酶、激素、毒素、抗原与抗体、血红蛋白的载氧能力等生物活性丧失，且蛋白质变性后理化性质发生改变，如溶解度降低而产生沉淀，因为有些原来在分子内部的疏水基团由于结构松散而暴露出来，分子的不对称性增加，因此粘度增加，扩散系数降低；接着通过缓冲稳定溶液能在一定程度上抵消、减轻外加强酸或强碱对溶液酸碱度的影响，从而保持溶液的pH值相对稳定；随后RNA酶抑制剂通过和RNA酶的活性基因团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性，以及在裂解组织的同时使RNA酶失活，它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用；紧接着表面活性剂是氨基酸类表面活性剂，除具有优良的表面活性外，还具有抗菌杀菌性；然后通过防冻剂可以在低温环境下保持液体和稳定状态；最后通过酸碱指示剂使得保存液可以保持在一定的pH范围内，从而可以保证病毒蛋白的稳定；有效的实现了保存液安全无毒，可在低温下保持液体状态，方便采样，可灭活病毒并保护RNA酶降解病毒，并可以抵御细菌真菌生长，不易造成污染，可以长期保存和病毒检测，使病毒不具有传染性，避免了使运输和检测人员处于被感染风险中，具有广泛的应用前景。

具体实施方式

本发明的灭活型病毒保存液配方，包括以下组分及各组分的重量数为：

蛋白变性剂：高浓度胍盐，盐酸胍、异硫氰酸胍中的一种或多种组合，5-20g；

RNA酶抑制剂：0.5-2g；

缓冲稳定剂：Tris2-6g；

表面活性剂：十二烷基肌氨酸钠1-4g；

酸碱指示剂：0.001-0.01g；

防冻剂：0.2-1g。

其中，蛋白变性剂能导致蛋白质完全变性，缓冲稳定溶液能保持溶液的pH值相对稳定，RNA酶抑制剂既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用，表面活性剂具有抗菌杀菌性，酸碱指示剂使得保存液可以保持在一定的pH范围内，从而可以保证病毒蛋白的稳定。

优选的，所述RNA酶抑制剂采用的是EDTA、异硫氰酸胍中的一种或多种组合；所述酸碱指示剂采用的是碱性品红、中性品红中的一种；所述防冻剂为丙三醇、二甲亚矾和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种组合。

本发明的灭活型病毒保存液配方，一个实施例，包括以下组分及各组分的重量数为：

蛋白变性剂15g，其中高浓度胍盐、盐酸胍和异硫氰酸胍按1：1：1的比例组合；

RNA酶抑制剂1.4g，其中EDTA、异硫氰酸胍按5：2的比例组合；

Tris4.5g；

十二烷基肌氨酸钠3.2g；

中性品红0.008g；

防冻剂0.7g，其中丙三醇、二甲亚矾和聚乙烯吡咯烷酮按2:2:3的比例组合。

该优选的实施例实现了保存液安全无毒，可在低温下保持液体状态，方便采样，可灭活病毒并保护RNA酶降解病毒，并可以抵御细菌真菌生长，不易造成污染，可以长期保存和病毒检测，使病毒不具有传染性，避免了使运输和检测人员处于被感染风险中。

本发明灭活型病毒保存液的制作方法，包括以下步骤，

步骤（A），配置缓冲稳定溶液，将Tris2-6g量取并加入至定量容器内部，再加入生理盐水定容至100ml，

最优的Tris为4.5g；

步骤（B），缓冲稳定溶液中加入蛋白变性剂，将蛋白变性剂5-20g量取放置玻璃容器中混合，其中蛋白变性剂采用高浓度胍盐，盐酸胍、异硫氰酸胍中的一种或多种组合，混合后加入至缓冲稳定溶液内部，再搅拌3-5min至均匀，制成混合液A，

最优的蛋白变性剂为15g，其中高浓度胍盐、盐酸胍和异硫氰酸胍按1：1：1的比例组合；

步骤（C），混合液A中加入RNA酶抑制剂，将RNA酶抑制剂0.5-2g量取并加入至混合液A内部，其中RNA酶抑制剂采用EDTA、异硫氰酸胍中的一种或多种组合，再搅拌1-2min至均匀，制成混合液B，

最优的RNA酶抑制剂为1.4g，其中EDTA、异硫氰酸胍按5：2的比例组合；

步骤（D），混合液B中加入表面活性剂，将十二烷基肌氨酸钠1-4g量取并加入至混合液B中，搅拌3-5min至均匀，制成混合液C，

最优的十二烷基肌氨酸钠为3.2g；

步骤（E），混合液C中加入防冻剂，将防冻剂0.2-1g量取并加入至混合液C中，其中防冻剂采用丙三醇、二甲亚矾和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种组合，再搅拌1-2min至均匀，制成保存液，

最优的防冻剂为0.7g，其中丙三醇、二甲亚矾和聚乙烯吡咯烷酮按2:2:3的比例组合；

步骤（F），保存液中加入酸碱指示剂，将中性品红0.001-0.01g量取并加入至保存液内部，再搅拌3-5min至均匀，

最优的中性品红为0.008g；

具体过程为：

（F1），量取中性品红0.001-0.01g至玻璃容器中，并研磨1-2min至均匀；

（F2），将玻璃容器中的中性品红加入至配置好的保存液中，并搅拌3-5min至均匀；

（F3），灭活型病毒保存液配方的pH值6.0-8.0，搅拌过程中观察保存液的颜色，若为黄色则封装保存液，若为红色则缓慢滴入生理盐水并搅拌，使保存液刚好由红色变为黄色时停止加入生理盐水，再搅拌1min保存液无明显颜色变化后封装保存液。

通过本发明上述制作方法的灭活型病毒保存液，具体效果如下：

（1）实现了保存液安全无毒，可在低温下保持液体状态；（2）方便采样，可灭活病毒并保护RNA酶降解病毒；（3）可以抵御细菌真菌生长，不易造成污染；（4）可以长期保存和病毒检测，使病毒不具有传染性；（5）避免了使运输和检测人员处于被感染风险中。

综上所述，本发明的灭活型病毒保存液配方及其制作方法，通过本发明的灭活型病毒保存液配方及其制作方法，首先通过蛋白变性剂能与尿素和盐酸胍优先结合，形成变性蛋白质-变性剂复合物，当复合物被除去，从而引起N→D反应平衡向右移动，随着变性剂浓度的增加，天然状态的蛋白质不断转变为复合物，最终导致蛋白质完全变性，这样使得蛋白质具有的酶、激素、毒素、抗原与抗体、血红蛋白的载氧能力等生物活性丧失，且蛋白质变性后理化性质发生改变，如溶解度降低而产生沉淀，因为有些原来在分子内部的疏水基团由于结构松散而暴露出来，分子的不对称性增加，因此粘度增加，扩散系数降低；接着通过缓冲稳定溶液能在一定程度上抵消、减轻外加强酸或强碱对溶液酸碱度的影响，从而保持溶液的pH值相对稳定；随后RNA酶抑制剂通过和RNA酶的活性基因团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性，以及在裂解组织的同时使RNA酶失活，它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用；紧接着表面活性剂是氨基酸类表面活性剂，除具有优良的表面活性外，还具有抗菌杀菌性；然后通过防冻剂可以在低温环境下保持液体和稳定状态；最后通过酸碱指示剂使得保存液可以保持在一定的pH范围内，从而可以保证病毒蛋白的稳定。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。