一种将癌细胞诱导分化成脂肪细胞的方法

技术领域

本发明涉及癌细胞的诱导转化技术领域，具体提供了一种将癌细胞诱导分化成脂肪细胞的方法。

背景技术

在癌症病情发展过程中，存在一个叫做“上皮-间充质转化”(EMT，epithelial–mesenchymal transitions)的阶段，该阶段内，癌细胞具有类似于“干细胞”的特质，有潜力转化成多种细胞类型。上皮细胞可向间质细胞形态转化，导致细胞极性丧失、黏附能力下降、细胞骨架发生变化，从而增强细胞迁移和运动的能力，利用EMT这些癌细胞会从初始的肿瘤中脱离，向远处发生转移。研究证实EMT是与癌症的侵袭和转移有牵连的关键事件。肿瘤细胞经过血液循环传播后，肿瘤细胞会发生间质上皮转化(MET，mesenchymal–epithelial transitions)，形成继发性的肿瘤转移灶。MET是EMT的逆过程，癌细胞由间质细胞形态变回上皮细胞形态，增殖能力增强，生长更快。

科学家在小鼠身上使用罗格列酮联合MEK抑制剂曲米替尼，让乳腺癌细胞分化成脂肪细胞，降低了肿瘤的侵袭性，抑制了肿瘤转移，其主要采用的方法是：将乳腺癌细胞接种到培养皿中，过夜培养后用200ng/ml的人源重组BMP2蛋白处理3天，然后用200ng/ml的BMP2和2uM的Rosiglitazone(罗格列酮)处理4天，然后再用2μM的罗格列酮处理3天。其采用的培养基为含有10％胎牛血清的DMEM培养基。结果显示，经过罗格列酮+骨形成蛋白-2(BMP-2)的诱导后，EMT后的乳腺癌细胞转化成了脂肪细胞，表达各种脂肪细胞标志物，对异丙肾上腺素和胰岛素的反应也跟脂肪细胞一样；并且在诱导分化9天后之后，研究人员撤去诱导分化培养基，换上普通培养基，观察发现这些分化成的脂肪细胞保持着脂肪细胞的特征，并没有出现恢复成间充质样的癌细胞的情况，证实这种诱导分化是不可逆的。但是这种癌细胞诱导分化方法存在明显的缺陷：该方法只能将EMT之后的癌细胞诱导分化成脂肪细胞，即只能将处于间充质状态的癌细胞诱导分化，而不能将处于上皮状态的癌细胞诱导分化。该方法中BMP2的使用就是为了促进癌细胞EMT转化。因此，该方法对癌细胞的诱导分化条件苛刻，具有很大局限性，只能诱导分化处于间充质状态的癌细胞，不具有普适性。

发明人前期研究中，成功将正常的人皮肤成纤维细胞诱导分化成脂肪细胞(参见申请号为2019108760496的中国专利)，但正常的人皮肤成纤维细胞与癌细胞在生长发育、生理机制等方面存在明显的不同，主要表现在：第一，人皮肤成纤维细胞传代次数有限，不具有无限增殖、转移的能力，不会经历EMT或者MET转化。而癌细胞属于无限增殖细胞，并具有恶性转移的能力，会经历EMT或者MET转化。第二，人皮肤成纤维细胞一般处于静息状态，通常会在创伤修复时大量增殖，并分泌胶原纤维和胞外基质，参与伤口愈合。而癌细胞时刻处于增殖或转移状态，几乎不分泌胶原纤维和胞外基质。第三，人皮肤成纤维细胞由胚胎时期的间充质细胞分化而来，一般存在于皮肤的结缔组织中，处于间充质状态。而癌细胞种类繁多，来源广泛，有的处于上皮状态，有的则处于间充质状态。因此，癌细胞的诱导分化较为复杂、困难，有待于研究更加简便、普适性强的、有效的方法用于癌细胞向脂肪细胞的诱导分化。

发明内容

本发明的目的是提供一种将癌细胞诱导分化成脂肪细胞的方法，包括以下步骤：

(1)将癌细胞于基础培养基中进行培养，待细胞汇合度达80-100％时，进行诱导分化；

(2)将步骤(1)的基础培养基换成诱导分化培养基①，培养4-8天；

(3)将诱导分化培养基①换成诱导分化培养基②，培养1-4天；

(4)换成基础培养基，培养6-12天；

其中，所述基础培养基为含胎牛血清、抗生素的高糖DMEM(Dulbecco’s modifiedEagle medium)培养基；

所述诱导分化培养基①为含有地塞米松、胰岛素、罗格列酮和1-甲基-3-异丁基黄嘌呤的基础培养基；

所述诱导分化培养基②为含胰岛素的基础培养基。

优选地，所述基础培养基为含5％-20％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的高糖DMEM培养基。

优选地，所述诱导分化培养基①为0.5-1μM地塞米松，5-20μg/mL胰岛素，1-2μM罗格列酮，0.2-0.5mM 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤的基础培养基。

更优选地，所述诱导分化培养基①为1μM地塞米松，10μg/mL胰岛素，2μM罗格列酮，0.5mM 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤的基础培养基。

在采用诱导分化培养基①诱导分化癌细胞的过程中，按照常规培养细胞的方法，定期进行换液，本发明实施例选择每两天换液一次。

优选地，所述诱导分化培养基②为含5-20μg/mL胰岛素的基础培养基。

更优选地，所述诱导分化培养基②为含10μg/mL胰岛素的基础培养基。

本发明的上述方法中，诱导分化的环境条件为35℃～37℃，5％CO

本发明一个具体的诱导分化方案为：

将癌细胞传代到铺有盖玻片的35mm的培养皿中，加入3mL基础培养基，放在含有5％CO2的细胞培养箱中，37℃培养；待细胞汇合度达到80-100％后，吸掉基础培养基，加入诱导分化培养基①，连续诱导培养4-8天，每两天换液一次；吸掉诱导分化培养基①，加入诱导分化培养基②，诱导培养1-4天；吸掉诱导分化培养基②，加入基础培养基，继续培养6-12天，每两天换液一次。

上述方法诱导获得的脂肪细胞属于本发明的保护范围。

上述方法在通过将癌细胞诱导分化成脂肪细胞而抑制癌细胞增殖、转移中的应用属于本发明的保护范围。

本发明提供了含有地塞米松、胰岛素、罗格列酮、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤的组合物在制备将癌细胞诱导分化成脂肪细胞的药物或在制备抑制癌细胞增殖、转移的药物中的应用。

上述应用中，先用含地塞米松、胰岛素、罗格列酮、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤的组合物诱导分化癌细胞，再用胰岛素诱导分化癌细胞。

具体地，将含地塞米松、胰岛素、罗格列酮、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤的组合物制成诱导分化培养基①，所述诱导分化培养基①为0.5-1μM地塞米松，5-20μg/mL胰岛素，1-2μM罗格列酮，0.2-0.5mM 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤的上述基础培养基；将胰岛素加入上述基础培养基中使胰岛素终浓度为5-20μg/mL，制成诱导分化培养基②。

本发明方法适用的癌细胞不需经过EMT转化，也不受其状态影响，可以是处于上皮状态的癌细胞，也可以是处于间充质状态的癌细胞。因此，该方法具有普适性。适用的癌细胞包括但不限于HeLa(人宫颈癌细胞)、U2OS(人骨肉瘤细胞)、SW620(人结肠癌细胞)、SW480(人结肠癌细胞)、HCT116(人结肠癌细胞)、HT29(人结肠癌细胞)、A549(人非小细胞肺癌细胞)、MDA-MB-231(人乳腺癌细胞)、HepG2(人肝癌细胞)、T47D(人乳腺癌细胞)细胞系以及分离的原代癌细胞。

本发明通过上述方法成功将多种癌细胞诱导分化成脂肪细胞。以HeLa细胞、U2OS细胞、A549细胞以及SW620细胞为例，采用“4+2+10天”诱导分化模式，癌细胞成功被诱导分化成脂肪细胞，并且发现诱导分化培养基①的处理时间至少为4天，诱导分化培养基②的处理时间至少为1天，不然诱导分化效率低。油红染色结果显示，本发明方法能将癌细胞分化成脂肪细胞的效率为25-70％左右。本发明方法将恶性增殖、转移的癌细胞转变为成熟的脂肪细胞，分化形成的脂肪细胞既含有脂肪滴，又高表达成熟脂肪细胞的标志基因，癌细胞的增殖、转移能力明显下降。本发明方法有效抑制癌细胞的增殖和转移，为临床上的癌症治疗提供新思路、新方法，应用前景良好。

附图说明

图1为实施例1中诱导分化结束后细胞油红染色结果图。

图2为实施例1中诱导分化得到的脂肪细胞的成熟脂肪细胞标志基因检测结果图。

图3为实施例2中诱导分化结束后细胞油红染色结果图。

图4为实施例2中诱导分化得到的脂肪细胞的成熟脂肪细胞标志基因检测结果图。

图5为实施例3中诱导分化结束后细胞油红染色结果图。

图6为实施例3中诱导分化得到的脂肪细胞的成熟脂肪细胞标志基因检测结果图。

图7为实施例4中诱导分化结束后细胞油红染色结果图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，若未特别说明，本发明所用试剂为市售可得。

本发明实施例中，诱导分化结束后，取出培养皿中的盖玻片进行油红染色，检测诱导分化效果；另外，提取培养皿剩余细胞的RNA，进行荧光定量PCR，检测成熟脂肪细胞的标志基因Adiponectin，Fabp4和Leptin的表达，进一步验证诱导分化的结果；

(1)油红染色

油红O是一种很强的脂溶剂和染脂剂，能够与甘油三酯结合，因此经常被用于脂肪染色。本发明对诱导分化后的细胞进行油红染色，来检测成熟脂肪细胞内的脂肪滴。具体操作如下：

①将盖玻片用PBS洗3次，然后用4％多聚甲醛(PFA)固定20分钟；

②用PBS洗3次后，用60％异丙醇平衡5分钟；

③用浓度为3g/L的油红O(溶解在60％异丙醇中)密闭染色10分钟；

④用60％异丙醇洗3次；

⑤用苏木精染色2分钟；

⑥用PBS洗3次，晾干后封片进行成像；

⑦统计油红染色呈阳性的细胞数；

(2)成熟脂肪细胞标志基因检测：Adiponectin，Fabp4和Leptin是成熟脂肪细胞的标志基因，经常被用来衡量脂肪细胞诱导分化的效果。本发明用Trizol从诱导分化后的细胞中提取总RNA，反转录后进行荧光定量PCR，检测Adiponectin，Fabp4和Leptin这三个基因的表达水平。定量PCR检测Adiponectin，Fabp4，Leptin三个成熟脂肪细胞的标志基因的引物分别为：

Adiponectin:5’-GATGGCAGAGATGGCAC-3’

5’-GCTGAGCGGTATACATAGG-3’

Fabp4:5’-ACGAGAGGATGATAAACTGGTGG-3’

5’-GCGAACTTCAGTCCAGGTCAAC-3’

Leptin:5’-CACCAAAACCCTCATCAAGACA-3’

5’-CTTTCTGTTTGGAGGAGACTGACT-3’

本发明实施例中，***表示P<0.001，****P<0.0001，不同处理组之间的差异具有统计学意义。

实施例1将癌细胞诱导分化成脂肪细胞的方法(1)

本实施例以处于上皮状态的HeLa细胞为例，阐述采用本发明的方法诱导分化HeLa细胞为脂肪细胞的结果。

1、诱导过程中涉及到的培养基如下：

基础培养基：高糖Dulbecco’s modified Eagle medium(DMEM)+10％胎牛血清+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素；

诱导分化培养基①：在基础培养基中，加入地塞米松，胰岛素，罗格列酮，1-甲基-3-异丁基黄嘌呤，使它们的终浓度分别为1μM，10μg/mL，2μM，0.5mM；

诱导分化培养基②：在基础培养基中，加入终浓度为10μg/mL的胰岛素。

2、诱导过程：

(1)将HeLa细胞传代到铺有盖玻片的35mm的培养皿中，加入3mL基础培养基，放在含有5％CO2的细胞培养箱中，37℃培养；

(2)待细胞密度达到80-100％后，吸掉基础培养基，加入诱导分化培养基①，连续诱导培养4天，每两天更换一次新鲜培养基；

(3)吸掉诱导分化培养基①，加入诱导分化培养基②，诱导培养2天；

(4)吸掉诱导分化培养基②，加入基础培养基，继续培养10天，每两天更换一次新鲜培养基；

(5)诱导分化结束后，通过油红染色和成熟脂肪细胞标志基因检测来检测诱导分化的结果。油红染色结果见图1，着色部分是染色的脂肪(经油红染色后呈红色)，未诱导的HeLa细胞没有脂肪累积，而诱导分化16天的HeLa细胞有明显的脂肪累积。未诱导的HeLa细胞中油红染色呈阳性的细胞数为0；而诱导分化16天的HeLa细胞分化成脂肪细胞的效率约为70％。

成熟脂肪细胞标志基因检测结果见图2，通过定量PCR(quantitative PCR)，检测了Adiponectin，Fabp4，Leptin三个成熟脂肪细胞的标志基因。在未诱导的HeLa细胞中检测不到这三个基因的表达，而在诱导分化16天的HeLa细胞中可以检测到这三个基因的高水平表达。

本实施例的方法成功将HeLa细胞在体外诱导分化成脂肪细胞。

实施例2将癌细胞诱导分化成脂肪细胞的方法(2)

本实施例以处于间充质状态的U2OS细胞为例，阐述采用本发明的方法诱导分化U2OS细胞为脂肪细胞的结果。

本实施例涉及到的培养基以及具体实验步骤同实施例1，同样采用“4+2+10天”诱导分化模式。不同之处在于，癌细胞为U2OS细胞。

诱导分化结束后，通过油红染色和成熟脂肪细胞标志基因检测来检测诱导分化的结果。结果如下：

(1)油红染色结果如图3所示，着色部分是染色的脂肪(经油红染色后呈红色)，未诱导的U2OS细胞没有脂肪累积，而诱导分化16天的U2OS细胞有明显的脂肪累积。未诱导的U2OS细胞中油红染色呈阳性的细胞数为0；而诱导分化16天的U2OS细胞分化成脂肪细胞的效率约为25％。

(2)成熟脂肪细胞标志基因检测

如图4所示，通过定量PCR(quantitative PCR)，检测了Adiponectin，Fabp4，Leptin三个成熟脂肪细胞的标志基因。在未诱导的U2OS细胞中检测到这三个基因的低水平表达，而在诱导分化16天的U2OS细胞中检测到这三个基因的高水平表达。

实施例3将癌细胞诱导分化成脂肪细胞的方法(3)

本实施例以处于上皮状态的SW620细胞为例，阐述采用本发明的方法诱导分化SW620细胞为脂肪细胞的结果。

本实施例涉及到的培养基以及具体实验步骤同实施例1，同样采用“4+2+10天”诱导分化模式。不同之处在于，癌细胞为SW620细胞。

诱导分化结束后，通过油红染色和成熟脂肪细胞标志基因检测来检测诱导分化的结果。结果如下：

(1)油红染色结果如图5所示，着色部分是染色的脂肪(经油红染色后呈红色)，未诱导的SW620细胞没有脂肪累积，而诱导分化16天的SW620细胞有明显的脂肪累积。未诱导的SW620细胞中油红染色呈阳性的细胞数为0；而诱导分化16天的SW620细胞分化成脂肪细胞的效率约为40％。

(2)成熟脂肪细胞标志基因检测

如图6所示，通过定量PCR(quantitative PCR)，检测了Adiponectin，Fabp4，Leptin三个成熟脂肪细胞的标志基因。在未诱导的SW620细胞中检测到这三个基因的低水平表达，而在诱导分化16天的SW620细胞中检测到这三个基因的高水平表达。

实施例4将癌细胞诱导分化成脂肪细胞的方法(4)

本实施例以处于上皮状态的A549细胞为例，阐述采用本发明的方法诱导分化A549细胞为脂肪细胞的结果。

本实施例涉及到的培养基以及具体实验步骤同实施例1，同样采用“4+2+10天”诱导分化模式。不同之处在于，癌细胞为A549细胞。

诱导分化结束后，通过油红染色来检测诱导分化的结果。结果如下：

如图7所示，着色部分是染色的脂肪(经油红染色后呈红色)，未诱导的A549细胞没有脂肪累积，而诱导分化16天的A549细胞有明显的脂肪累积。未诱导的A549细胞中油红染色呈阳性的细胞数为0；而诱导分化16天的A549细胞分化成脂肪细胞的效率约为38％。

本发明还对MDA-MB-231、HepG2、T47D等多种癌细胞采用本发明的方法进行诱导分化，结果显示，采用本发明的方法均能够对包括MDA-MB-231、HepG2、T47D在内的各种癌细胞实现诱导分化为脂肪细胞，诱导分化率在15％-80％。说明本发明方法能够将恶性增殖、转移的癌细胞转变为成熟的脂肪细胞，分化形成的脂肪细胞既含有脂肪滴，又高表达成熟脂肪细胞的标志基因。本发明方法有效抑制癌细胞的增殖和转移，为临床上的癌症治疗提供新思路、新方法，应用前景良好。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。