芽孢杆菌属益生菌菌株和突变

技术领域

本发明涉及使得芽孢杆菌属(Bacillus)或其他细菌菌株(例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)菌株)能够过量产生酸的突变基因。这些基因可以通过诱变来再生，或者插入到合适的菌株中，并且所得的突变菌株可以用作益生菌，优选用于动物健康中。

背景技术

枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株作为益生菌成分在饲料行业中的使用是本领域中众所周知的。益生菌(也称为“直接饲喂微生物”或“DFM”)的功能是通过支持有益细菌的生长和/或抑制病原菌的生长以积极的方式影响肠道微生物菌群。理想地，通过使用益生菌，抗生素生长促进剂(AGP)的使用变得多余。还期望益生菌完成其他功能，例如帮助消化特定的饲料成分。因此，需要以积极的方式影响肠道微生物菌群并实现其他功能的益生菌。

具体实施方式

根据本发明，已经发现可在枯草芽孢杆菌细菌中诱导的某些突变是有益的，因为可以过量产生各种酸，例如乙酸盐。此外，已经对这些突变进行了表征，并且可以将各种基因的突变部分插入到新的细菌中，或者可以在另一种芽孢杆菌属(例如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌)中诱导突变，以改进现有菌株或者以创建具有这种有益特性的新益生菌菌株。

本发明的一个实施方式涉及一种新芽孢杆菌属细菌菌株，所述新芽孢杆菌属细菌菌株有效抑制产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)(家禽的主要商业相关病原体之一)的生长，优选为枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。它拥有促进乙酸盐过量产生的有益突变。

在另一个实施方式中，本发明涉及一种枯草芽孢杆菌菌株和含有该菌株或来源于该菌株的制备物。具体地，本发明涉及以下组中的一组或多组：

本发明的芽孢杆菌属，优选枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌菌株，表现出了以下特征序列中的至少一种特征序列：

a)16S rDNA序列，所述序列与被命名为BMS7 16S的根据SEQ ID NO:15的多核苷酸序列具有至少95％，优选100％的序列同一性；

b)alsS序列，所述alsS序列与被命名为alsS(5.1)的根据SEQ ID NO:2的多核苷酸序列具有至少95％，优选100％的序列同一性，或与被命名为alsS(5.2)的根据SEQ ID NO:3的多核苷酸序列具有至少95％，优选100％的序列同一性；

c)adhA序列，所述序列与被命名为adhA(5.1)的根据SEQ ID NO:9的多核苷酸序列具有至少95％，优选100％的序列同一性；

d)bdhA序列，所述序列与被命名为bdhA(5.1)的根据SEQ ID NO:7的多核苷酸序列具有至少95％，优选100％的序列同一性；

e)dhbA序列，所述序列与被命名为dhbA(1.6)的根据SEQ ID NO:13的多核苷酸序列具有至少95％，优选100％的序列同一性；

f)pta序列，所述序列与被命名为pta(5.1)的根据SEQ ID NO:5的多核苷酸序列具有至少95％，优选100％的序列同一性。

另一个实施方式是一种芽孢杆菌属菌株，所述芽孢杆菌属菌株包含以下特征序列中的至少一种特征序列：

a)16S rDNA序列，所述序列与被命名为BMS7 16S的根据SEQ ID NO:15的多核苷酸序列具有至少95％，优选100％的序列同一性；

b)adhA序列，所述序列与被命名为adhA(5.1)的根据SEQ ID NO:9的多核苷酸序列具有至少95％，优选100％的序列同一性；

c)bdhA序列，所述序列与被命名为bdhA(5.1)的根据SEQ ID NO:7的多核苷酸序列具有至少95％，优选100％的序列同一性；

d)dhbA序列，所述序列与被命名为dhbA(1.6)的根据SEQ ID NO:13的多核苷酸序列具有至少95％，优选100％的序列同一性；

e)pta序列，所述序列与被命名为pta(5.1)的根据SEQ ID NO:5的多核苷酸序列具有至少95％，优选100％的序列同一性。

另一实施方式是一种芽孢杆菌属菌株，所述芽孢杆菌属菌株包含alsS序列，所述alsS序列与被命名为alsS(5.1)的根据SEQ ID NO:2的多核苷酸序列具有至少95％，优选100％的序列同一性，或与被命名为alsS(5.2)的根据SEQ ID NO:3的多核苷酸序列具有至少95％，优选100％的序列同一性；以及至少第二序列，所述第二序列选自由以下项组成的组：

a)16S rDNA序列，所述序列与被命名为BMS7 16S的根据SEQ ID NO:15的多核苷酸序列具有至少95％，优选100％的序列同一性；

b)alsS序列，所述alsS序列与被命名为alsS(5.1)的根据SEQ ID NO:2的多核苷酸序列具有至少95％，优选100％的序列同一性，或与被命名为alsS(5.2)的根据SEQ ID NO:3的多核苷酸序列具有至少95％，优选100％的序列同一性；

c)adhA序列，所述序列与被命名为adhA(5.1)的根据SEQ ID NO:9的多核苷酸序列具有至少95％，优选100％的序列同一性；

d)bdhA序列，所述序列与被命名为bdhA(5.1)的根据SEQ ID NO:7的多核苷酸序列具有至少95％，优选100％的序列同一性；

e)dhbA序列，所述序列与被命名为dhbA(1.6)的根据SEQ ID NO:13的多核苷酸序列具有至少95％，优选100％的序列同一性；

f)pta序列，所述序列与被命名为pta(5.1)的根据SEQ ID NO:5的多核苷酸序列具有至少95％，优选100％的序列同一性。

又一实施方式是一种芽孢杆菌属菌株，所述芽孢杆菌属菌株包含alsS序列，所述alsS序列与被命名为alsS(5.1)的根据SEQ ID NO:2的多核苷酸序列具有至少95％，优选100％的序列同一性，或与被命名为alsS(5.2)的根据SEQ ID NO:3的多核苷酸序列具有至少95％，优选100％的序列同一性；并且还包含所有序列a至f。

上述序列可插入所需的芽孢杆菌属菌株中，或在芽孢杆菌属菌株，优选枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌，更优选枯草芽孢杆菌中诱导，以创建具有有益益生菌活性的新菌株。在一个特别优选的实施方式中，上述所有序列具有与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:5至少95％，优选100％的序列同一性，并且SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中的一者存在于同一细菌中。这种细菌的一个此类示例被命名为BMS 7。

在本发明的一个实施方式中，芽孢杆菌属菌株的特征还在于能够过量产生乙酸或乙酸盐。在一个实施方式中，所述菌株是枯草芽孢杆菌菌株，其中所述菌株与所述野生型菌株BMS5相比能够过量产生至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的乙酸或乙酸盐。一个优选实施方式是BMS7。

本发明的另一实施方式是一种组合物，所述组合物包含本发明的芽孢杆菌属菌株或从本发明的芽孢杆菌属获得的化合物。所述组合物可以是饲料原料，并且还包含至少一种另外的饲料或食物成分，所述至少一种另外的饲料或食物成分选自由以下项组成的组：蛋白质、碳水化合物、脂肪、另外的益生菌、益生元、酶、维生素、免疫调节剂、代乳品、矿物质、氨基酸、抗球虫药、基于酸的产品、药物，以及它们的组合。

不希望受任何理论束缚，认为根据本发明的芽孢杆菌属菌株通过多方面的作用模式增强动物健康，所述多方面的作用模式包括产生具有选择性功效的抗菌代谢产物，以及通过更好地消耗可用的营养物来与病原菌竞争，从而抑制病原菌在肠道中的有效建立。

益生菌被认为比抗生素更有利，因为它们不会任意地破坏细菌，并且它们不会形成病原菌的抗生素抗性菌株。通常，益生菌细菌通过产生具有特定功效的抗微生物物质来选择性地与病原菌竞争，并且理想地能够同时增强有益肠道微生物菌群的生长和活力。此外，它们优选能够在被治疗的动物中刺激系统性免疫应答。

本发明的突变菌株优选是现有菌株的突变体。通篇使用的术语“突变菌株”是指通过有意使用诱变剂(例如本领域中已知的那些)，优选EMS而源自野生型芽孢杆菌属(例如BMS5，其基因组在SEQ ID NO:1中给出)的突变体。此类突变体可通过经典方法获得，所述经典方法为例如使枯草芽孢杆菌菌株在紫外光存在下或在易影响亲本的某种抗生素存在下生长，以及测试任何抗性突变体的提高的生物活性或提高的增强动物健康指标中的一种或多种动物健康指标的能力。用于鉴定突变体的其他方法是本领域的普通技术人员已知的。但是除了这些优选的突变体之外，所有其他种类的突变体，例如通过基因工程获得的突变体，也是本发明的一部分。

本发明的另一个实施方式是菌株BMS5的芽孢杆菌属突变体，所述突变体在自然界中不存在并且具有上述特征。

在本发明的优选实施方式中，将本发明的菌株和制备物口服施用给动物。

本发明的另一主题还有枯草芽孢杆菌菌株和/或地衣芽孢杆菌在本发明的制备物中作为饲料产品中的益生菌成分(DFM)的用途。本发明的枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌菌株和含有它们的组合物，当施用给动物时优选增强此类动物的健康，和/或改善此类动物的总体身体状况，和/或提高此类动物的饲料转化率，和/或降低此类动物的死亡率，和/或提高此类动物的存活率，和/或提高此类动物的增重，和/或提高此类动物的生产率，和/或提高此类动物的抗病性，和/或提高此类动物的免疫应答，和/或建立或维持此类动物中的健康肠道微生物菌群，和/或减少病原体通过此类动物粪便的流出。具体地，本发明的菌株和组合物可用于在出于治疗目的施用抗生素之后帮助重建肠道微生物菌群的健康平衡。在一些优选实施方式中，所述动物是家禽。

因此，本发明的另一主题是一种增强动物健康，和/或改善动物的总体身体状况，和/或提高动物的饲料转化率，和/或降低动物的死亡率，和/或提高动物的存活率，和/或提高动物的增重，和/或提高动物的生产率，和/或提高动物的抗病性，和/或提高动物的免疫应答，和/或在动物中建立或维持健康肠道微生物菌群，和/或减少病原体通过动物粪便的流出的方法，其中将本发明的菌株和/或制备物或本发明的包含此类菌株的组合物施用给动物。在一些优选实施方式中，所述动物是家禽。

因此，本发明的另一主题还有本发明的菌株和/或制备物和/或组合物用于增强动物健康，和/或改善动物的总体身体状况，和/或提高动物的饲料转化率，和/或降低动物的死亡率，和/或提高动物的存活率，和/或提高动物的增重，和/或提高动物的生产率，和/或提高动物的抗病性，和/或提高动物的免疫应答，和/或在动物中建立或维持健康肠道微生物菌群，和/或减少病原体通过动物粪便的流出的用途，其中将本发明的菌株和/或制备物或本发明的包含此类菌株的组合物施用给动物。在一些优选实施方式中，所述动物是家禽。

因此，本发明的另一主题还有如先前提及的本发明的菌株和制备物和本发明的含有这些菌株的组合物用于增强动物健康，和/或改善动物的总体身体状况，和/或提高动物的饲料转化率，和/或降低动物的死亡率，和/或提高动物的存活率，和/或提高动物的增重，和/或提高动物的生产率，和/或提高动物的抗病性，和/或提高动物的免疫应答，和/或在动物中建立或维持健康肠道微生物菌群，和/或减少病原体通过动物粪便的流出的用途。在一些优选实施方式中，所述动物是家禽。

用于产生本发明的细菌菌株的一般工序汇总如下。使用甲磺酸乙酯(EMS)对细菌菌株进行诱变。测试暴露于不同浓度的化学物质和暴露于化学物质达不同时间，以确保突变率为约20/细胞。为了成功实现生化途径(如我们作为目标的用于有机酸生产的生化途径)，重要的是要具有多于一个突变，但不能有过多突变，因为这会不利于细胞活力。在暴露于诱变剂后，测试细胞活力(所谓的杀伤率)和氨基酸营养缺陷。过多的突变不利于此类生理过程如孢子形成(用于ANH的益生菌是产孢菌并且作为孢子出售)、原养(对发酵很重要)以及可能的肠道中的益生菌行为。所有这些技术、它们的参数和问题是本领域技术人员已知的。由于我们寻找的表型诱导酸的产生/分泌，所以使用pH指示剂(溴酚蓝)可以在丰富培养基平板上筛选诱变的枯草芽孢杆菌BMS5细菌细胞库。我们使用的指示剂使产生酸的细胞变黄。基于黄色的强度和黄色出现的时序，收集大量在表型上为黄色的菌落。将阳性的黄色菌落在相同的培养基上重新划线分离。然后在此时在液体培养基中培养黄色突变体，通过HPLC测试所述液体培养基中所述突变体产生的有机酸。在液相色谱上评估约30个菌落的乳酸、丁酸、乙酸和丙酸产量。两种菌落被鉴定为强乙酸生产者。它们被命名为BMS5-1和BMS-2。然后对这两种分离株的产孢能力进行评估，产孢能力是过程(发酵)的关键参数。观察到所述菌株中的一种菌株(BMS5-2)不像另一种菌株那样有效地形成孢子。中断所述菌株(BMS5-2)的使用，因为它需要以高得多的体积生产才能产生相同数量的孢子。

然后培养BMS5-1(现命名为BMS7)，以提取染色体DNA进行基因组测序。使用Illumina技术执行基因组测序。然后鉴定在BMS7与其亲本菌株BMS5之间的基因组突变。实施例中列出了具有与乙酸产生途径相关的突变的基因。

然后评定BMS7和BMS5(亲本菌株)对抗生素的抗性，以确保没有突变增加芽孢杆菌属菌株对由EFSA列出的10种抗生素的抗性。

给出了以下非限制性实施例来进一步说明本发明。

实施例

细菌生长条件

使芽孢杆菌属菌株在基本培养基(MM；1X Spizizen盐、0.04％谷氨酸钠和0.5％葡萄糖)或小牛肉浸出液-酵母提取物完全培养基(VY)上生长或在由胰蛋白胨血琼脂基质(TBAB，Difco,Maryland)组成的琼脂平板上生长。在37℃下进行生长。

EMS诱导的产酸突变体的分离

制备并筛选甲磺酸乙酯(EMS；d＝1.21g/ml溶液)库。将对数期BMS5细胞用460mMEMS处理60分钟，并将等分试样在-80℃下冷冻在10％甘油中。通过以下方式确定杀伤率：在TBAB平板上铺板用EMS处理过的细胞的连续稀释液和未经处理但经受相同工序的细胞的连续稀释液，并比较它们的CFU。将来自冷冻储备物的细胞在VY培养基中以1:5稀释，在37℃下孵育60分钟，并铺板至含有2％葡萄糖和作为pH指示剂的溴甲酚紫的TBAB培养基上。该pH指示剂在高于pH 6.8时为紫色，并且在低于pH 5.2时为黄色(pK

有机酸谱的表征

对乳酸、丙酸、丁酸和乙酸进行定量。酸定量方法使用具有UV(紫外线)和RI(折射率)检测的HPLC(高压液相色谱)系统。除非检测到共洗脱，否则大多数定量都是使用RI执行的，其中将使用210nm下的UV。柱是BioRad Aminex HPX-87H 300×7.8mm，其带有HPX-87H保护柱。溶剂为0.05％三氟乙酸在100％经过滤的去离子水中的溶液；等度流率为0.5ml/min。柱温为50℃，RI温度为35℃。注射量为10ul。

基因组突变的鉴定

使细菌细胞在37℃下在小牛肉浸出液-酵母液体培养基中生长过夜，以用于由MasterPure全DNA纯化试剂盒进行基因组DNA制备。在Illumina Mi-Seq技术平台上执行测序。使用MIRA平台进行基因组组装。通过与亲本菌株的基因组序列进行比较来鉴定单碱基突变。

实施例2

序列

参考以下序列：

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