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精确工程化的隐形信使RNA和其他多核苷酸

文献发布时间：2023-06-19 12:16:29

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于2018年8月9日创建并通过EFS-Web提交给美国专利和商标局的呈ASCII文本文件的序列表(名为Sequence Listing Kernal.txt，6KB)以引用的方式并入本文。

背景技术

信使核糖核酸(mRNA)领域在现代医学中具有多种应用。对于将mRNA用于治疗目的至关重要的是降低其先天免疫原性，否则会导致一系列不期望的影响，从细胞因子分泌到RNA降解和翻译中止。已经在人中鉴定出几种先天免疫受体，它们识别通常通过体外转录(IVT)反应制造的外源mRNA，所述反应可产生单链mRNA和加帽mRNA，以及副产物诸如双链mRNA和/或未加帽mRNA(Sahin等人,2014,Nat Rev Drug Discov,13:759–80)。先天免疫系统的受体包括未加帽RNA、双链RNA(dsRNA)和单链RNA(ssRNA)的传感器(Schlee&Hartmann,2016,Nat Rev Immunol,16:566–580)。在这些受体中，RIG-I结合具有5’三磷酸(5’PPP)或Cap 0结构的平末端dsRNA(Schuberth-Wagner等人,2015,Immunity.43:41–52)，而IFIT1结合具有5’三磷酸(5’PPP)或Cap 0结构的ssRNA(Abbas等人,2013,Nature.494:60–64；Abbas等人,2017,PNAS,114:E2106–E2115)。可通过高效的加帽以获得Cap I结构和/或通过磷酸酶处理IVT mRNA来逃避这些未加帽RNA传感器(Warren等人,2010,Cell Stem Cell.7:618–30；Ramanathan等人,2016,Nucleic Acids Res.44:7511–7526)。感知dsRNA的受体包括TLR3、MDA5、PKR和OAS1(Schlee&Hartmann,2016,Nat Rev Immunol,16:566–580)，这些可通过将mRNA纯化以去除IVT反应的双链RNA产物来逃避(Karikó等人,2011,Nucleic AcidsRes.39:e142；Person等人2014,USPTO专利申请号：US 2014/0328825A1)。

结合ssRNA(单链ORN和siRNA双链体的单独链)的先天免疫受体包括高度同源的TLR7和TLR8(Wang等人,2006,J Biol Chem,281:37427–37434；Matsushima等人,2007,BMCGenomics,10.1186/1471-2164-8-124；Wei等人2009,Protein Sci.,18:1684–1691)。在内体中将双链RNA的两条链分离成单链RNA后，包括siRNA的双链RNA也可被TLR7和TLR8识别(Goodchild等人,2009,BMC Immunology,10:40)。这些受体经刺激后，细胞内的NF-κB和IRF-3信号传导路径被激活，并且这继而导致IFN-α(TLR7)以及TNF-α和IL-12p40(TLR8)的分泌(Gorden等人2005；J Immunol.,174:1259–1268；Forsbach等人,2008,J Immunol.,180:3729–3738)。这些蛋白质的晶体结构最近得到了解决(Tanji等人,2015,Nat StructMol Biol.22:109–115；Zhang等人,2016,Immunity.45:737–748)，并且它们的配体结合位点得到了鉴定(Wei等人,2009,Wei等人2009,Protein Sci.,18:1684–1691；Ohto等人,2014,Microbes Infect.16:273–282)。这些研究揭示了两个独立的配体结合结构域：一个结合单个核苷(对于TLR7为鸟苷并且对于TLR8为尿苷)，并且另一个结合短的寡核糖核苷酸(ORN)。需要两个结构域处的配体结合以二聚化并激活这些受体。结构生物学研究符合对TLR7/8配体的先前研究，这些研究一致表明富含U和GU的ORN序列为TLR7/8的激活剂(Judge等人2005,Nat Biotechnol,23,457–462；Heil等人,2004,Science,(80)303:1526–1529；Hornung等人,2005,Nat Med.,10.1038/nm1191)。几个研究组鉴定出了对TLR7和/或TLR8具有高刺激活性的特定ssRNA序列(Diebold等人,2006,Eur J Immunol.10.1002/eji.200636617；Forsbach等人,2008,J Immunol.,180:3729–3738；Jurk等人,2011,Nucleic Acid Ther.21:201–214,Green等人,2012,J Biol Chem.287:39789–39799)。Jurk等人(2011)测试了这些ssRNA的各种衍生物，并鉴定出了TLR7/8结合的ssRNA序列基序。他们指出对于人TLR7(基于IFN-a分泌)为UCW基序(其中W为U或A)，以及对于人TLR8刺激(基于IL12p40分泌)为KNUNDK基序(其中N为任何核苷酸，K为G或U，并且D为除C之外的任何核苷酸)。

纯化且加帽的IVT mRNA可逃避RIG-I、IFIT、PKR、MDA5、OAS和TLR3，但在人细胞中被TLR7和TLR8识别。这种识别可通过将非规范核苷酸(诸如假尿苷、N1-甲基-假尿苷、甲氧基-尿苷和2-硫代尿苷)掺入mRNA(Kariko,2005,Immunity.23:165–75；Kariko,2008,MolTher.16:1833–40；Kormann等人,2011,Nat Biotechnol.29:154–157；Andries等人,2015,JControl Release.217:337–344)或通过经由改变mRNA的总核苷酸含量对mRNA序列进行非精细/粗工程化来避免。后一种方法可通过增加mRNA的GC含量(Thess等人,2015,MolTher.23:1456–64；Schlake和Thess,2015)或增加A或降低U或GU含量(Kariko&Sahin,2017,WIPO专利申请号：WO 2017/036889A1)来完成。对于编码区，此序列工程化主要通过改变mRNA上密码子的第三个核苷酸来完成。由于遗传密码的冗余性，序列工程化不会改变所编码的蛋白质的氨基酸序列。此方法类似于密码子优化，这是分子与合成生物学中常用的提高转基因蛋白表达产量的技术(Quax等人,2015,Mol Cell.59:149–161)。然而，在IVT mRNA序列工程化的情况下，主要目标为使IVT mRNA在体内对RNA传感器隐形或不可见。

化学修饰(诸如假尿苷)降低、但不能完全消除先天免疫原性，特别是在重复转染后(Liang等人,2017,Mol Ther.25(12):2635-2647)。另外，mRNA可能具有治疗用途，其中刺激某些RNA传感器、但不刺激其他RNA传感器可能是期望的。例如，在IFN-α分泌可诱导或增强抗肿瘤免疫力的一些免疫肿瘤学应用中，仅具有TLR7结合活性的mRNA可能是期望的。化学修饰不允许逃避某些传感器和刺激其他传感器。

人基因组内编码区的GC含量为52％(Merchant等人,2007,Science.318(5848):245-50)，并且低于1％的核苷酸为非规范的(Li等人,2015,Nat Chem Biol,11(8):592-7)。随着mRNA化学或序列的修饰距离天然(细胞)人mRNA越来越远(以降低IVT mRNA的先天免疫原性)，发生意外后果的风险增加。通过总核苷酸含量改变方法进行的化学修饰和序列工程化均为非精细/粗方法，所述方法可能具有破坏性并可能具有并发症；诸如翻译减少(对于5-甲基胞苷、6-甲基腺苷和2-硫代尿苷修饰)(Kariko等人,2015,Mol Ther,16(11):1833-40)或隐性肽形成(Mauro&Chappell,2014,Trends Mol Med.2014年11月；20(11):604-13；Mauro等人,2018,BioDrugs,32:69–81)。此外，在人mRNA“上皮转录组(epitranscriptome)”中，化学修饰的核苷(诸如m6A和假尿苷)分布不均匀(Carlile等人,2014,Nature.515:143–6；Dominissini等人,2016,Nature.530:441–446)。例如，位于哺乳动物终止密码子中的尿苷不含假尿苷化基序(Schwartz等人,2014,Cell.159:148–162)，并且已显示将假尿苷掺入IVT mRNA中导致终止密码子通读(Karijolich&Yu,2011,Nature.474:395–398；Fernandez等人,2013,Nature.500:107–110)。此外，修饰的核苷酸可降低RNA转录酶(T7 RNA聚合酶)以及翻译机制的保真度，并且还可改变蛋白质的翻译后修饰。修饰的核苷酸还使mRNA在人体内对RNA酶产生抗性，并且血清中的RNA积累可导致高凝状态。除了这些生物学风险外，使用非规范核苷酸也可能导致制造成本增加(Hadas等人,2017,Wiley Interdiscip RevSyst Biol Med.9:e1367)。

发明内容

本发明提供了多核苷酸(例如，信使RNA)，所述多核苷酸被序列工程化以去除涉及与人TLR8结合的免疫原性序列基序。

在一个实施方案中，本发明提供了一种用于多核苷酸(例如，mRNA)的精确序列工程化的方法，其中仅去除了免疫原性基序，而其余序列保持完整。

在一个实施方案中，本发明提供了一种从多核苷酸(例如，mRNA)中去除免疫原性RNA序列基序KNUNDK的方法，其显著降低经由人TLR8的先天免疫原性。

在一个实施方案中，本发明提供了一种编码GFP的信使RNA，其中mRNA的编码区内与KNUNDK序列基序匹配的一个或多个免疫原性序列通过序列的DNA模板的密码子工程化得以去除，并且将其转染到HEK细胞中以显示出降低的经由人TLR8的免疫原性和高蛋白表达。

本发明的一个方面是一种方法，所述方法包括使人胚胎肾细胞系(HEK293-TLR8SEAP)与KNUNDK序列基序去除的mRNA重复接触，以实现高水平的蛋白表达，同时降低mRNA的先天免疫原性。

本发明的一个方面是一种方法，所述方法包括使人原代单核细胞源性树突状细胞(MDDC)与KNUNDK基序去除的mRNA接触，以实现高水平的蛋白表达，同时降低mRNA的先天TLR8免疫原性。

本发明的另一方面是一种新的精确隐形mRNA工程化方法，所述方法防止mRNA激活人TLR8，同时允许激活其他RNA传感器，诸如人TLR7和人RIG-I。

本文公开的通过基序去除的精确mRNA工程化方法，在去除免疫原性序列的同时保留了mRNA中的非免疫原性序列。此微创方法允许mRNA在降低其免疫原性的同时，保留高水平的翻译活性。与粗序列工程化方法(诸如基于高GC、低GU或低U的mRNA工程化)不同，此方法不会破坏高效的翻译，因此不需要对许多版本的序列工程化的mRNA进行测试来保持或达到高水平的蛋白表达。由于此方法不涉及使用非规范核苷酸，所以预期不会出现诸如翻译效率降低、翻译后改变或终止密码子通读的问题。最后，精确工程化还可降低mRNA治疗剂的制造成本。

附图说明

图1A至图1B.A.序列工程化的eGFP mRNA设计。在编码区内改变天然(“野生型”)mRNA序列以去除TLR8基序(“低基序”)，降低总G和U含量(“粗”)，或同时去除基序并降低G和U(“低基序+粗”)。图1.B.核苷酸和基序变化的概述。对于每种mRNA设计方法，表中显示了存在的TLR8基序的最终数量和核苷酸改变的总数。精确(低基序)方法高效地去除TLR8结合位点，同时最小化核苷酸改变的数量。(UTR：非翻译区)。

图2.通过Lipofectamine转染到过表达TLR8的人细胞中的工程化的eGFP mRNA的天然免疫原性。通过HPLC来纯化野生型(WT)和序列工程化的mRNA，并通过Lipofectamine2000(Life Technologies)将它们转染到过表达TLR8且携带报告质粒的HEK293细胞中，所述报告质粒导致在TLR8刺激时(通过融合至NF-KB和AP-1结合位点的IFN-B启动子)分泌胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的分泌。mRNA转染后48小时测量分泌的SEAP活性。与野生型(WT)mRNA相比，低基序、粗(低GU)和低基序+粗mRNA显示出显著减少的TLR8刺激(对于所有3个比较，p<0.05)。转染以一式五份(quantiplicate)进行，并且将数据描绘成平均值+/-标准差(SD)。

图3.通过Trans-IT转染到过表达TLR8的人细胞中的工程化eGFP mRNA的天然免疫原性。通过HPLC来纯化野生型(WT)和序列工程化的mRNA，并通过TransIT-mRNA试剂(MirusBio)将它们转染到HEK293-null细胞(无TLR8表达)和过表达TLR8的HEK293-TLR8细胞中。两种细胞系均携带报告质粒，其导致TLR8刺激时(通过融合至NF-KB和AP-1结合位点的IFN-B启动子)碱性磷酸酶(SEAP)的分泌。在mRNA转染后24小时测量分泌的AP活性，并将其归一化为通过实验前SEAP水平定量的细胞数。化学修饰的(“chem.mod.”)mRNA对照含有100％假U和100％5mC。(测量HEK-Null细胞中的AP活性，以确定通过基础TLR3表达驱动的背景免疫信号)。与化学修饰的mRNA类似，低基序mRNA显示的TLR8刺激显著低于野生型(WT)和低GU(“粗”)mRNA。转染以一式五份进行，并且将数据描绘成平均值+/-SD。

图4A至图4B.A.由通过Lipofectamine 2000转染到过表达TLR8的人细胞中的工程化的eGFP mRNA驱动的蛋白表达。通过HPLC来纯化野生型(WT)和序列工程化的mRNA，并通过Lipofectamine 2000将其转染到过表达TLR8的HEK293细胞中。转染后2天，通过Envision读板器获得表达eGFP的细胞的图像。B.图4.A中显示了在过表达TLR8的人细胞中eGFP表达的定量。精确工程化的mRNA(“低基序”)显示出显著高于低GU(“粗”)和化学修饰的(“Chem.mod.”)mRNA的蛋白表达。转染以一式五份进行，并且将数据描绘成平均值+/-SD。

图5A至图5D.由转染到人单核细胞源性树突状细胞(MDDC)中的工程化的eGFPmRNA驱动的蛋白表达。通过HPLC来纯化野生型(WT)和序列工程化的mRNA，并通过Lipofectamine 2000将其转染到MDDC中。在第4天对eGFP表达进行定量。在MDDC中进行单次转染后，低基序mRNA(C)导致蛋白表达显著高于粗mRNA(B)，且表达与WT mRNA(A)类似。(D)一式三份进行的实验结果。将数据描绘成平均值+/-SD。

图6.由通过Lipofectamine 2000重复转染到过表达TLR8的人细胞中的工程化的eGFP mRNA驱动的蛋白表达。野生型(WT)和序列工程化的mRNA通过旋转柱进行收集(“WT-未纯化的”和“低基序-未纯化的”)，或通过HPLC进行纯化(“WT–HPLC”和“低基序–HPLC”)。然后在第2、3和4天通过Lipofectamine 2000将它们连续转染到过表达TLR8的HEK293细胞中(在第0天接种)。在第4、7和11天对eGFP表达进行定量。在重复转染的设置下，低基序纯化的mRNA显示出蛋白表达显著高于WT纯化的mRNA。转染以一式五份进行，并且将数据描绘成平均值+/-SD。

具体实施方式

定义

如本文所用，术语“约”是指在给定值大约±10％以内的变化。

术语“克隆位点”是指通常存在于表达载体中的核苷酸序列，其包括可用于将一个或多个DNA片段克隆到表达载体中的一个或多个限制性酶识别序列。当核苷酸序列含有多个限制性酶识别序列时，核苷酸序列也被称为“多克隆位点”或“多接头”。

术语“表达载体”是指包含影响期望分子表达的序列的核酸，所述序列例如启动子、编码区和转录终止序列。表达载体可为整合载体(即，可整合到宿主基因组中的载体)，或不整合但自我复制的载体，在此情况下，载体包括允许整个载体一旦处于宿主细胞内就可以复制的“复制起点”。

术语“基因表达”是指核酸序列经历成功转录并在大多数情况下翻译以产生蛋白质或肽的过程。为了清楚起见，当提及“基因表达”的测量时，这应当理解为意指测量可以是转录的核酸产物(例如RNA或mRNA)或翻译的氨基酸产物(例如多肽或肽)。测量RNA、mRNA、多肽和肽的量或水平的方法是本领域中众所周知的。

本文中使用的短语“免疫原性基序”包括对涉及RNA与位于细胞内的先天免疫受体(诸如TLR7或TLR8)结合并引起细胞内细胞信号传导路径激活，从而导致基因表达改变和/或细胞因子从细胞释放的任何RNA序列的提及。

术语“质粒”包括细菌中天然存在的质粒和人工构建的环状DNA片段。

如本文所用，术语“多核苷酸”是指长于13个核苷酸的任何RNA或DNA序列。术语多核苷酸包括天然或合成来源的具有天然或合成的(化学修饰的)磷酸骨架、糖和核糖糖的核酸。

如本文所用，术语“信使RNA”和“mRNA”是指能够编码细胞或无细胞蛋白质翻译系统中的多肽或蛋白质的任何RNA序列。

如本文所用，术语“体外转录”是指用于从DNA模板制造mRNA的酶促反应，所述DNA模板可基于质粒或基于PCR产物。在前一种情况下，将质粒DNA用限制性酶线性化并对限制位点之间的IVT模板区进行纯化，以获得更高质量的DNA模板。在后一种情况下，与末端区或侧翼区互补的引物被设计成由质粒扩增模板DNA，然后进行纯化。当这些PCR引物中的一种包含poly-T序列时，它还可使poly-A尾在转录期间掺入mRNA序列中。体外转录(IVT)反应通常使用具有规范或化学修饰的核苷酸底物的T7、T3或SP6 RNA聚合酶。

如本文所用，术语“编码区”是指信使RNA通常位于5’与3’非翻译区之间的部分，并被核糖体主动翻译成蛋白质。

如本文所用，术语“5’UTR”是指信使RNA位于mRNA的5’末端上的部分，并且通常涉及与核糖体的结合和增强mRNA编码区的表达。

如本文所用，术语“3’UTR”是指信使RNA位于mRNA的3’末端上的部分，并且通常涉及增强mRNA的表达和半衰期。

如本文所用，术语“序列工程化”是指由于特定原因而对多核苷酸的核苷酸序列进行的任何改变。此类改变可导致免疫原性降低、表达增强和/或半衰期延长。所述改变可在整个RNA序列中或在RNA序列的特定部分中进行。对于信使RNA，序列工程化可能涉及改变编码序列、5’UTR和/或3’UTR区。

如本文所用，术语“精确序列工程化”是指在寡核苷酸序列中进行的改变，以通过去除免疫原性基序降低寡核苷酸的免疫原性，同时避免寡核苷酸序列的其余部分的不必要改变。在一些实施方案中，“精确序列工程化”涉及去除多核苷酸中的至少1、2、3、4、5个免疫原性基序或所有免疫原性基序。在一些实施方案中，“精确序列工程化”涉及去除至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少99％或100％的在多核苷酸序列中发现的免疫原性基序。

短语“去除免疫原性基序”是指通过改变免疫原性基序中的单个核苷酸或免疫原性基序中的多个核苷酸(例如，给定免疫原性基序中的2、3、4、5、6个或所有核苷酸)来修饰多核苷酸中的免疫原性基序，使得所述基序不再存在(即免疫原性基序被“破坏”)。如本文所用，术语“改变”涵盖对一个核苷酸或多个核苷酸的修饰，包括但不限于核苷酸取代、缺失、插入和化学修饰。例如，“KNUNDK”免疫原性基序包含如表1所示的192个可能的核苷酸序列。导致产生与“KNUNDK”基序不相符(即，落在表1中列出的192个序列之外)的序列的一个或多个核苷酸的任何突变、改变或取代都将“破坏”或“去除”基序。例如，如果起始多核苷酸中的免疫原性基序为“GAUAAG”并且将其突变为“GAAAAG”，则称KNUNDK基序被“去除”。

在一些实施方案中，寡核苷酸为RNA。在一个特定实施方案中，RNA为信使RNA(mRNA)。在mRNA的编码区内，精确序列工程化利用遗传密码的冗余性，并用与天然密码子编码相同氨基酸的替代密码子替换每个靶密码子，从而保留所编码蛋白质的最终序列。换句话说，如果至少一个免疫原性基序在mRNA的氨基酸编码部分中(即在“开放阅读框”或“ORF”中)，则改变(例如，改变至少1、2、3、4、5个或所有核苷酸)的进行不会改变由mRNA编码的氨基酸序列。

如本文所用，术语“密码子优化”是指出于增加多肽或蛋白质表达水平的目的而进行的序列工程化。测量多肽和蛋白质的量或水平的方法是本领域中众所周知的。

如本文所用，术语“低GU mRNA”是指与野生型形式的相同mRNA相比，鸟嘌呤(G)和尿嘧啶(U)含量降低的序列工程化mRNA。

如本文所用，术语“低U mRNA”是指与野生型形式的相同mRNA相比，U含量降低的序列工程化mRNA。

如本文所用，术语“高GC mRNA”是指与野生型形式的相同mRNA相比，G和C含量升高的序列工程化mRNA。

如本文所用，术语“酶促加帽”是指通过酶(通常为牛痘加帽系统)与2-O-甲基转移酶组合添加基于7-甲基鸟苷的帽结构，诸如Cap 0、Cap I、Cap II，所述前种酶添加具有5’-5’磷酸二酯键的7-甲基鸟苷帽(Cap 0)，所述2-O-甲基转移酶使mRNA的5’端的第一个核苷酸2-O-甲基化从而产生Cap I结构，所述添加是在转录反应之后，以增强mRNA的更好翻译。酶促加帽的方法是本领域中众所周知的。

如本文所用，术语“共转录加帽”是指通过在mRNA转录反应中加入此类帽类似物来添加7-甲基鸟苷帽或帽类似物，诸如ARCA或CleanCap，以增强mRNA的更好翻译。共转录加帽的方法是本领域中众所周知的。

如本文所用，术语“化学修饰”是指对mRNA的含氮碱基进行的化学改变。此类改变通常是通过在mRNA转录反应中加入非规范的(化学修饰的)核苷酸类似物作为T7 RNA聚合酶的底物来进行的。这些化学修饰包括但不限于假尿苷(Ψ)、5-甲基胞苷(m5C)、N1-甲基-假尿苷(N1mΨ)、5-甲氧基尿苷(5moU)、N6-甲基腺苷(m6A)、5-甲基尿苷(m5U)或2-硫代尿苷(s2U)。

如本文所用，术语“部分化学修饰”是指mRNA中的一些但不是所有特定核苷酸(通常为尿苷或胞苷)的化学修饰。例如，2-硫代尿苷(s2U)可通过以1比3的摩尔比作为IVT底物被部分包含而以大约25％的比率使用，其中每三个规范尿苷中有一个2-硫代尿苷被掺入mRNA中。

如本文所用，术语“包封”是指将mRNA包装在固体、层状或囊状、基于脂质或聚合物的纳米颗粒内。

如本文所用，术语“递送载体”是指可用于mRNA的包封并使mRNA有效载荷能够有效地稳定、运输和递送到靶细胞或组织中的任何天然或合成材料。

短语“研究用组合物”是指在实验室中用于增加科学知识目的的任何研究材料，并且不旨在用于临床或兽医用途。短语“兽医用组合物”是指用于动物以改善动物健康和福祉的任何材料。

一般描述

本公开涉及通过精确序列工程化去除多核苷酸序列中的免疫原性基序来降低多核苷酸序列中的免疫原性的方法。本公开还涉及工程化的多核苷酸的组合物，其中此类多核苷酸中的一个或多个或所有免疫原性序列基序被去除。

鉴于现有mRNA修饰和工程化方法的局限性，仍然需要一种新的mRNA工程化方法，所述方法仅改变与先天免疫传感器相关的序列。

允许降低mRNA的先天免疫原性的当前可用的mRNA化学修饰和序列工程化方法太粗糙并且均匀地改变或修饰所有序列。

TLR7和TLR8基于某些含有U的序列或序列基序检测ssRNA物种，包括mRNA。这些免疫原性基序的靶向去除可允许更精确的序列工程化方法。由于遗传密码的冗余性(其中几乎所有密码子的第三个位置都具有编码在新生多肽链中的相同氨基酸残基的替代核苷酸)，mRNA序列可被改变以特异性去除序列基序，而所编码的蛋白序列保持相同。

与粗工程化方法诸如高GC mRNA(其中人工改变mRNA序列以增加总G和C含量)或低GU mRNA(其中人工改变mRNA序列以降低总G和U含量)相比，此种精确方法(低基序方法)为微创的，即它不改变与TLR7/8结合无关的任何序列。因此，此种新的方法保持所述mRNA的大多数结构和功能特征。在许多优点中，此种方法允许稳健的翻译效率。本发明首次证明精确mRNA工程化是可行且有利的。

因此，在一个实施方案中，本文所述的基序可从用于表达蛋白质的其他信使RNA中去除，以用于研究目的以及兽医和临床应用，诸如疫苗接种或治疗性基因替代。所述mRNA可编码多种寡肽、多肽或蛋白质中的一种或多种，包括但不限于基因编辑酶(例如Cas9、ZFN和TALEN)、诱导性多能干细胞(IPSC)重编程因子(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc、Nanog、Lin28、Glis1)、转分化因子、代谢酶(例如表面活性剂蛋白B、尿苷5’-二磷酸-葡萄糖醛糖基转移酶、甲基丙二酰辅酶A突变酶、鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、细胞膜蛋白(例如CFTR、OX40L、TLR4、CD40L、CD70、B细胞受体亚基、T细胞受体亚基、嵌合抗原受体)、激素和细胞因子(EPO、VEGF、IL12、IL36γ)、促凋亡蛋白、坏死和坏死性蛋白、病毒抗原(例如HIV gp120和gp41抗原、流感病毒HA和NA抗原)、细菌抗原和毒素、癌抗原和新抗原、预防性或治疗性抗体和抗体片段。

在另一个实施方案中，待序列工程化的mRNA可编码不止一种蛋白质，作为嵌合构建体(产生融合蛋白)或作为由穿插了IRES区的不同编码区或编码自裂解肽的序列编码的单独多肽。

在一些实施方案中，本发明利用KNUNDK作为人TLR8和小鼠TLR7基序，并去除与KNUNDK基序匹配的序列，其中N为任何核苷酸，K为鸟苷(G)或尿苷(U)，并且D为除胞苷(C)以外的任何核苷酸。表1中提供了包含KNUNDK基序的6聚体序列。

在其他实施方案中，通过基序去除的精确序列工程化可基于其他TLR7和TLR8序列基序，包括但不限于UCW、UNU、UWN、USU、KWUNDK、KNUWDK、UNUNDK、KNUNUK(Forsbach等人2008；Jurk等人2011；Green等人2012)及其组合，其中W为腺苷(A)或U，并且S为G或C。

表1：与KNUNDK基序匹配的序列列表

在另一个实施方案中，可在多于54个核苷酸的其他长多核苷酸上进行本基序去除方法，以降低此类多核苷酸的先天免疫原性。在一些实施方案中，长多核苷酸包含至少54个、至少55个、至少56个、至少57个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个、至少95个、至少100个、至少110个、至少120个、至少130个、至少140个或至少150个核苷酸。这些长多核苷酸包括但不限于Crispr-Cas9的引导RNA(gRNA)、长非编码RNA(lncRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)和环状RNA(circRNA)。

在一些实施方案中，起始的未经工程化的多核苷酸包含多个免疫原性基序。在一些实施方案中，多核苷酸中的多个免疫原性基序是单一类型的基序(例如，多核苷酸的每个免疫原性基序是选自由以下组成的组的基序：UCW、UWN、USU、UNU、KWUNDK、KNUWDK、UNUNDK、KNUNDK和KNUNUK，其中W表示腺苷单磷酸或尿苷单磷酸，并且S表示鸟苷单磷酸或胞苷单磷酸)。在一些实施方案中，多肽中的多个免疫原性基序包括不同类型(例如，在多核苷酸序列中存在至少两种不同的基序类型，其选自由以下组成的组：UCW、UWN、USU、UNU、KWUNDK、KNUWDK、UNUNDK、KNUNDK和KNUNUK，其中W表示腺苷单磷酸或尿苷单磷酸，并且S表示鸟苷单磷酸或胞苷单磷酸)。

在一些实施方案中，与没有工程化(靶向去除免疫原性基序)的多核苷酸相比，或与在其他常规方法中改变的多核苷酸相比，精确序列工程化的多核苷酸显示出改善的功能性。在一些实施方案中，短语“改善的功能性”是指显示出较低的免疫原性和对先天免疫系统受体(包括但不限于TLR 7和TLR8)的隐形。在多核苷酸编码蛋白质的实施方案中，短语“改善的功能性”包括对改善的翻译效率的提及，这导致改善的产量和增加的所编码蛋白质的量。在一些实施方案中，短语“改善的功能性”包括对工程化的多核苷酸的增强稳定性的提及。在一个特定实施方案中，精确序列工程化的多核苷酸的增强稳定性是由于对核酸内切酶和/或核酸外切酶的抗性提高或增强。

在另一个实施方案中，所述基序去除方法可与一种或多种常用的mRNA化学修饰组合使用，所述mRNA化学修饰包括但不限于假尿苷(Ψ)、5-甲基胞苷(m5C)、N1-甲基-假尿苷(N1mΨ)、甲氧基尿苷(5moU)、N6-甲基腺苷(m6A)、5-甲基尿苷(m5U)或2-硫代尿苷(s2U)，其中所述修饰替代mRNA中0.1-1％、1-10％或10-25％或25-50％或50-100％的规范核苷酸。

在另一个实施方案中，所述基序去除方法可与其他天然发现的RNA化学修饰中的一种或多种组合使用，所述RNA化学修饰包括但不限于1,2'-O-二甲基腺苷、1,2'-O-二甲基鸟苷、1,2'-O-二甲基肌苷、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿苷、1-甲基腺苷、1-甲基鸟苷、1-甲基肌苷、1-甲基假尿苷、2,8-二甲基腺苷、2-甲硫基亚甲基硫基-N6-异戊烯基腺苷、2-香叶基硫代尿苷、2-赖胞苷、2-甲基腺苷、2-甲硫基环状N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷、2-甲硫基-N6-(顺式羟基异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基腺苷、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷、2-甲硫基-N6-甲基腺苷、2-甲硫基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷、2-硒代尿苷、2-硫代-2'-O-甲基尿苷、2-硫代胞苷、2-硫代尿苷、2'-O-甲基腺苷、2'-O-甲基胞苷、2'-O-甲基鸟苷、2'-O-甲基肌苷、2'-O-甲基假尿苷、2'-O-甲基尿苷、2'-O-甲基尿苷、5-氧基乙酸甲酯、2'-O-核糖基腺苷(磷酸盐)、2'-O-核糖基鸟苷(磷酸盐)、3,2'-O-二甲基尿苷、3-(3-氨基-3-羧丙基)-5,6-二氢尿苷、3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿苷、3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷、3-甲基胞苷、3-甲基假尿苷、3-甲基尿苷、4-去甲基怀俄苷、4-硫代尿苷、5,2'-O-二甲基胞苷、5,2'-O-二甲基尿苷、5-(羧基羟甲基)-2'-O-甲基尿苷甲酯、5-(羧基羟甲基)尿苷甲酯、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代尿苷、5-(异戊烯基氨基甲基)-2'-O-甲基尿苷、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷、5-氨基甲基-2-香叶基硫代尿苷、5-氨基甲基-2-硒代尿苷、5-氨基甲基-2-硫代尿苷、5-氨基甲基尿苷、5-氨基甲酰基羟甲基尿苷、5-氨基甲酰基甲基-2-硫代尿苷、5-氨基甲酰基甲基-2'-O-甲基尿苷、5-氨基甲酰基甲基尿苷、5-羧基羟甲基尿苷、5-羧基甲基-2-硫代尿苷、5-羧基甲基氨甲基-2-香叶基硫代尿苷、5-羧基甲基氨甲基-2-硒代尿苷、5-羧基甲基氨甲基-2-硫代尿苷、5-羧基甲基氨甲基-2'-O-甲基尿苷、5-羧基甲基氨甲基尿苷、5-羧甲基尿苷、5-氰基甲基尿苷、5-甲酰基-2'-O-甲基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羟基胞苷、5-羟甲基胞苷、5-羟基尿苷、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿苷、5-甲氧基羰基甲基-2'-O-甲基尿苷、5-甲氧基羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、5-甲基-2-硫代尿苷、5-甲基氨甲基-2-香叶基硫代尿苷、5-甲基氨甲基-2-硒代尿苷、5-甲基氨甲基-2-硫代尿苷、5-甲基氨甲基尿苷、5-甲基胞苷、5-甲基二氢尿苷、5-甲基尿苷、5-牛磺酰甲基-2-硫代尿苷、5-牛磺酰甲基尿苷、7-氨基羧丙基-去甲基怀俄苷、7-氨基羧丙基怀俄苷、7-氨基羧丙基怀俄苷甲酯、7-氨甲基-7-脱氮鸟苷、7-氰基-7-脱氮鸟苷、7-甲基鸟苷、8-甲基腺苷、N2,2'-O-二甲基鸟苷、N2,7,2'-O-三甲基鸟苷、N2,7-二甲基鸟苷、N2,N2,2'-O-三甲基鸟苷、N2,N2,7-三甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N4,2'-O-二甲基胞苷、N4,N4,2'-O-三甲基胞苷、N4,N4-二甲基胞苷、N4-乙酰基-2'-O-甲基胞苷、N4-乙酰基胞苷、N4-甲基胞苷、N6,2'-O-二甲基腺苷、N6,N6,2'-O-三甲基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、N6-(顺式羟基异戊烯基)腺苷、N6-乙酰基腺苷、N6-甲酰基腺苷、N6-甘氨酰基氨基甲酰基腺苷、N6-羟甲基腺苷、N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-甲基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷、Qbase、胍丁胺胞苷(agmatidine)、古嘌苷(archaeosine)、环状N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷、二氢尿苷、环氧辫苷、半乳糖基-辫苷、谷氨酰基-辫苷、羟基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷、羟基怀丁苷、肌苷、异怀俄苷、甘露糖基-辫苷、甲基化的不完全修饰的羟基怀丁苷、甲基怀俄苷、过氧怀丁苷、假尿苷、辫苷、不完全修饰的羟基怀丁苷、尿苷5-氧基乙酸、尿苷5-氧基乙酸甲酯、怀丁苷和怀俄苷，其中所述天然修饰替代mRNA中0.1-1％、1-10％或10-25％或25-50％或50-100％的规范核苷酸。

信使RNA的免疫原性和翻译活性也受加帽、聚腺苷酸化和杂质(来自IVT反应的dsRNA污染物)的影响。在本发明中，使用Vaccinia加帽系统(其用7mG在5’端加帽以产生Cap0结构，并在mRNA的5'末端处使N1-核苷酸2-O-甲基化以产生Cap I结构)对mRNA进行酶促加帽。在另一个实施方案中，序列工程化的mRNA可使用合成或天然帽类似物(诸如但不限于3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')G(ARCA)或m7G(5')ppp(5')(2'OMeA/G)pG(CleanCap))进行共转录加帽。在另一个实施方案中，mRNA可在具有或不具有5'端去磷酸化(5'ppp)的未加帽情况下使用。

在本发明的一些实施方案中，使用基于模板的方法将mRNA聚腺苷酸化。在此种方法中，模板DNA序列含有编码mRNA上固定长度的polyA尾的末端polyA/T序列。在一个替代实施方案中，可使用Poly(A)聚合酶将序列工程化的mRNA酶促聚腺苷酸化。在另一个实施方案中，mRNA可在未聚腺苷酸化的情况下使用。

在一些实施方案中，mRNA通过反相HPLC、之后通过尺寸排阻色谱法进行纯化。在另一个实施方案中，mRNA通过离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、亲和色谱法或用RNA酶III或dicer处理的dsRNA的酶消化进行纯化。在另一个实施方案中，可使用酶消化和一种或多种色谱法的组合。

在本发明中，使用mRNA的基序去除而不用另外的序列工程化方法。但是，可以将此种精确mRNA工程化方法与其他序列工程化方法组合。在一些实施方案中，用于基序去除的序列工程化与用于密码子优化的序列工程化组合使用。在一些实施方案中，密码子优化基于密码子使用(密码子偏好)、密码子邻居情况、mRNA二级结构、mRNA三级结构或这些参数的组合。通过密码子优化，可显著提高mRNA的蛋白表达产量。此序列工程化方法可与TLR7和/或TLR8序列基序的去除一起使用。

在另一个实施方案中，精确序列工程化方法(基序去除)可与粗序列工程化方法组合，所述粗序列工程化方法为诸如高GC mRNA，其中对mRNA进行序列工程化以最大化所述mRNA的GC含量；低GU，其中进行序列工程化以最小化mRNA的G和U含量；或低U mRNA，其中进行序列工程化以最小化mRNA的U含量。由于这些粗方法通常无法完全消除免疫原性，因此可通过与精确工程化组合以去除剩余的基序来对其进一步改善。在本发明中，在mRNA的编码区内进行序列工程化。在另一个实施方案中，还可对5’和3’非翻译区进行工程化以去除免疫原性基序。在另一个实施方案中，可选择5’和3’非翻译区(来自天然或合成UTR序列的文库)以避免或最小化这些区域中的基序数量。

在本发明的一些实施方案中，序列工程化的mRNA为线性mRNA。在其他实施方案中，序列工程化的mRNA可为通过化学、酶促、核酶介导或自身环化制备的环状mRNA。

在一些实施方案中，本发明采用基于阳离子脂质的递送剂。在其他实施方案中，mRNA可通过其他递送剂递送，所述递送剂包括但不限于聚丙交酯、聚丙交酯-聚乙交酯共聚物、聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸烷酯、聚己内酯、葡聚糖、明胶、藻酸盐、鱼精蛋白、胶原蛋白、白蛋白、壳聚糖、环糊精、聚乙二醇化的鱼精蛋白、聚(L-赖氨酸)(PLL)、聚乙二醇化的PLL、聚乙烯亚胺(PEI)、脂质纳米颗粒、脂质体、纳米脂质体、蛋白脂质体、天然和合成来源的外泌体、天然、合成和半合成的板层体、纳米颗粒物、磷硅酸钙纳米颗粒物、磷酸钙纳米颗粒物、二氧化硅纳米颗粒物、纳米晶体颗粒物、半导体纳米颗粒物、干粉、纳米树状聚合物、基于淀粉的递送系统、胶束、乳剂、溶胶-凝胶、囊泡、质粒、病毒、病毒样颗粒、磷酸钙核苷酸、适体和肽。在其他实施方案中，这些递送剂通过与小分子配体、DNA或RNA适体、寡肽或蛋白质诸如抗体、抗体片段和配体诸如转铁蛋白缀合而被表面官能化。

在本发明中，mRNA在体外被递送至细胞。在另一个实施方案中，mRNA可离体或在体内递送至细胞、组织或有机体。用于体内施用的递送途径是口服或肠胃外的(静脉内、肌内、皮内或皮下)。

在一些实施方案中，编码单个蛋白质的mRNA被单独递送。在另一个实施方案中，编码不同蛋白质的多个mRNA作为混合制剂递送。此制剂中的各个mRNA可为裸露的mRNA，或可被包封在脂质纳米颗粒或允许合理地摄取和翻译mRNA的聚合物载剂中，或可为裸露的和包封的mRNA的组合。在一些实施方案中，通过改变mRNA序列和/或递送剂成分、大小、电荷、电荷比率、表面化学来针对特定应用中的活性进一步优化混合mRNA。在特定实施方案中，混合制剂中的一些mRNA被工程化以最小化TLR7/8结合，而另一些保持未经工程化或部分工程化以允许选择性或部分刺激先天免疫系统。

实施例

以下非限制性实施例形成本说明书的一部分，并且被包括来进一步说明本公开的某些方面。

实施例1.材料和方法

模板DNA生成(IDT)

本公开中使用的所有DNA模板包括T7启动子、5’UTR(非翻译区)序列、编码区和3’UTR序列。通过改变野生型eGFP模板DNA序列来对编码区进行工程化，其中与野生型密码子编码相同的氨基酸残基的替代密码子用于降低G和U含量或在开放阅读框中去除免疫原性序列基序。设计的序列由商业供应商(IDT)合成，并通过TA克隆被克隆到pMini-T载体(PCR克隆试剂盒(PCR Cloning Kit)，NEB)中，并通过Sanger测序验证序列。通过使用具有正向引物(TTGGACCCTCGTACAGAAGCT)(SEQ ID NO:5)和反向引物(TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGGCCAGAAGGCAAGCC)(SEQ ID NO:6)的Q5高保真DNA聚合酶(NEB)进行PCR扩增来从载体获得信使RNA。反向引物包括120个核苷酸长polyA尾的模板序列。PCR反应产物在琼脂糖凝胶上运行，并NucleoSpin凝胶和PCR净化试剂盒(NucleoSp in Gel andPCR Clean-up kit)(Macherey-Nagel)进行纯化。

mRNA的体外转录(IVT)采用制造商的方案，使用HiScribe

mRNA纯化：

根据Kariko等人,2013对加帽和去磷酸化的mRNA进行HPLC纯化。简而言之，使信使RNA在配备有反相PDVB HPLC柱(RNASep柱，Concise Seperations)的Varian Prostar HPLC仪器上运行，所述柱使用0.1M TEAA(流动相A)和含25％乙腈缓冲液的TEAA(流动相B)。将主要的mRNA部分用Amicon Ultra-15离心过滤器(Millipore)浓缩，并在无RNA酶的水中稀释。通过在乙酸钠(3M，pH 5.5；Thermo Fisher)、异丙醇(Thermo Fisher)和糖原(Roche)中沉淀过夜收集RNA。RNA浓度用NanoDrop 2000紫外可见分光光度计(Thermo Fisher)测量。

细胞:

HEK293 TLR8及其亲本系(HEK293 Null)获自Invivogen。将细胞用DMEM(Corning)和10％FBS(Seradigm)传代。实验时的细胞传代数小于15。人原代单核细胞源性树突状细胞(MDDC)获自Astarte Biologics(Donor#345)。使用补充有100ug/ml GM-CSF和IL-4(R&DSystems)的AIM V培养基(Thermo Fisher)来维持MDDC。

mRNA转染：

转染前48小时，将20,000-40,000个HEK293细胞接种在预涂聚L-赖氨酸(Sigma)的96孔板上。对于基于Lipofectamine 2000(Thermo Fisher)的转染，在转染当天，将培养基更换为50μl的Opti-MEM I无血清培养基(Thermo Fisher)。对于每个孔，将400ng mRNA与Opti-MEM混合至最终体积为25μl，并将0.4μl Lipofectamine 2000与24.6μl Opti-MEM混合。将溶液在室温下预孵育5分钟。然后将它们合并，并在室温下孵育20分钟。通过向每个孔中添加50μl的mRNA-Lipofectamine复合物来转染细胞。转染后4小时，将培养基更换为DMEM和10％FBS。对于使用Lipofectamine 2000的重复(连续)转染，接种的细胞数降低至每孔12,000。在第0天接种细胞，并在第2、3和4天对其进行转染。

对于基于TransIT mRNA(Mirus Bio)的HEK293细胞转染，将细胞以每孔25,000个细胞接种在聚L-赖氨酸预处理的96孔板上。72小时后，每孔使用最终体积为17.5μl的400ngmRNA、0.22μl TransIT mRNA试剂、0.14μl TransIT增强试剂和OptiMEM I无血清培养基。转染后24小时，将培养基更换为生长培养基。对于MDDC转染，将冷冻细胞融化、洗涤，并将每孔50,000个细胞接种在96孔板上。24小时后，使用0.11μl TransIT mRNA和0.07μl增强试剂转染细胞。转染后4小时更换培养基。

SEAP和eGFP定量

对于eGFP定量，使用EnVision 2105多模式读板器读取板。对于先天免疫原性的测量，在转染后22-24小时通过QUANTI-Blue分泌碱性磷酸酶测定(InvivoGen)来测量SEAP活性。磷酸酶测定的孵育在37℃下进行2小时。

实施例2.

在一些实施方案中，对编码eGFP mRNA的模板DNA的ORF(编码区)进行序列工程化。未经工程化或天然(野生型)eGFP mRNA，具有来自烟草蚀纹病毒(5’UTR)和小家鼠α-珠蛋白(3’UTR)的侧翼UTR序列，以及poly-A尾[120As]。

(SEQ ID NO:1)具有11个涉及TLR8结合的免疫原性基序，其中7个发现于mRNA的编码区中，而其余4个位于5’UTR区和3’UTR区内(图1A)。粗工程化方法导致产生低GU mRNA(SEQ ID NO:2)，其具有总共78个序列改变，其中编码区内7个免疫原性基序中的5个被去除。相反，精确序列工程化方法导致产生低基序mRNA(SEQ ID NO:3)，其具有非常少的序列改变(总共7个)，其中编码区内的所有7个免疫原性基序都被去除(图1B)。

实施例3.

在一些实施方案中，将序列工程化的mRNA用Lipofectamine2000转染到过表达TLR8的HEK293细胞中(图2)。将27,000个细胞/孔接种在聚L-赖氨酸预处理的96孔板上。48小时后，使用Lipofectamine 2000，每孔用400ng/孔mRNA转染。4小时后更换培养基。通过定量转染后24小时的细胞培养上清液中的SEAP活性来确定先天免疫原性(图2)。低GU mRNA(粗)和低基序mRNA均观察到TLR8刺激的减少。粗方法和精确方法(粗+低基序mRNA)的组合使用不会导致TLR8激活的另外降低。

实施例4.

在一些实施方案中，将序列工程化的mRNA用TransIT-mRNA试剂转染到过表达TLR8的HEK293细胞或没有TLR8过表达的亲本HEK293 Null细胞中(图3)。将35,000个细胞/孔接种在聚L-赖氨酸预处理的96孔板上。48小时后，用400ng/孔的mRNA转染细胞。4小时后更换培养基。通过定量转染前和转染后24小时的细胞培养上清液中的SEAP活性来确定先天免疫原性。使用转染前的SEAP读数将免疫信号归一化为接种的细胞数量。在基于TransIT的递送系统中，类似于基于Lipofectamine 2000的转染，精确工程化显示出低TLR8刺激。化学修饰的mRNA类似地显示出较少的TLR8刺激。虽然粗方法也显示出降低的TLR8活性，但低GU mRNA的SEAP信号相比于低基序mRNA和化学修饰的mRNA是更高的。

实施例5.

在一些实施方案中，将序列工程化的mRNA用Lipofectamine2000转染到过表达TLR8的HEK293细胞中(图4)。将27,000个细胞/孔接种在聚L-赖氨酸预处理的96孔板上。48小时后，每孔用400ng/孔mRNA转染。4小时后更换培养基。转染后6天，通过对板成像(图4A)并定量每个孔中的eGFP信号(图4B)来确定eGFP的蛋白表达水平。基于eGFP表达，粗方法和化学修饰导致mRNA翻译减少，而精确序列工程化(低基序mRNA)证明保留了翻译。

实施例6.

在一些实施方案中，将序列工程化的mRNA用TransIT mRNA试剂转染到MDDC中(图5)。将50,000个细胞/孔接种在96孔板上。24小时后，每孔用400ng/孔mRNA转染。4小时后更换培养基。转染后4天，通过对板成像(图5A)并定量每个孔中的eGFP信号(图5B)来确定eGFP的蛋白表达水平。与Lipofectamine转染的mRNA类似，TransIT转染的mRNA显示低基序mRNA的翻译活性相比于低GU mRNA的翻译活性有所改善。

实施例7.

在另一个说明中，将序列工程化的mRNA用Lipofectamine 2000试剂重复转染到过表达TLR8的HEK293细胞中(图6)。在第0天将12,000个细胞/孔接种在聚L-赖氨酸预处理的96孔板上。在第2、3和4天，每孔用400ng/孔mRNA转染。每次转染后4小时更换培养基。在第4、7和11天，通过定量每个孔中的eGFP信号(图5B)来确定eGFP的蛋白表达水平。在重复转染的设置下，低基序mRNA显示出比低GU mRNA和野生型(未经工程化的)mRNA都高的翻译。

序列

SEQ ID NO:1.野生型eGFP mRNA体外转录的合成模板DNA序列。合成的DNA序列，包含T7噬菌体RNA聚合酶启动子位点、烟草蚀纹病毒5’非翻译区(UTR)、天然(野生型)形式的维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)增强的绿色荧光蛋白(eGFP)编码序列、小家鼠α-珠蛋白3’UTR和poly-A尾[120As]。

TTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAGCTGCCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

SEQ ID NO:2.粗工程化(低GU)eGFP mRNA体外转录的合成模板DNA序列，编码序列：G和U降低的维多利亚多管发光水母eGFP编码序列。

ATGGTCAGCAAAGGCGAAGAACTCTTCACCGGCGTCGTCCCCATCCTCGTCGAACTCGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTCTCCGGCGAAGGCGAAGGCGACGCCACCTACGGCAAACTCACCCTCAAATTCATCTGCACCACCGGCAAACTCCCCGTCCCCTGGCCCACCCTCGTCACCACCTTCACCTACGGCGTCCAATGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAACAACACGACTTCTTCAAAAGCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAAGAACGCACCATCTTCTTCAAAGACGACGGCAACTACAAAACCCGCGCCGAAGTCAAATTCGAAGGCGACACCCTCGTCAACCGCATCGAACTCAAAGGCATCGACTTCAAAGAAGACGGCAACATCCTAGGCCACAAACTCGAATACAACTACAACAGCCACAACGTCTACATCATGGCCGACAAACAAAAAAACGGCATCAAAGTCAACTTCAAAATCCGCCACAACATCGAAGACGGCAGCGTCCAACTCGCCGACCACTACCAACAAAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTCCTCCTCCCCGACAACCACTACCTCAGCACCCAATCCGCCCTAAGCAAAGACCCCAACGAAAAACGCGACCACATGGTCCTCCTCGAATTCGTCACCGCCGCCGGCATCACCCACGGCATGGACGAACTCTACAAATAA

SEQ ID NO:3.低基序eGFP mRNA体外转录的合成模板DNA序列。编码序列：去除KNUNDK基序的维多利亚多管发光水母eGFP编码序列。

SEQ ID NO:4.粗(低GU)和低基序eGFP mRNA体外转录的合成模板DNA序列。编码序列：去除KNUNDK基序且GU降低的维多利亚多管发光水母eGFP。

SEQ ID NO:5.DNA–人工序列-寡核苷酸

TTGGACCCTCGTACAGAAGCT

SEQ ID NO:6.DNA–人工序列-寡核苷酸

TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGGCCAGAAGGCAAGCC

序列表

<110> 科纳勒生物公司(Kernal Biologics, Inc.)

<120> 精确工程化的隐形信使RNA和其他多核苷酸

<130> 2013065-0003

<150> 62/716451

<151> 2018-08-09

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1017

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 1

ttggaccctc gtacagaagc taatacgact cactataggg aaataagaga gaaaagaaga 60

gtaagaagaa atataagagc caccatggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg 120

gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc 180

gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc 240

aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc 300

agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc 360

tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag 420

gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag 480

gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat 540

atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc 600

gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc 660

cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc 720

aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc 780

ggcatggacg agctgtacaa gtaagctgcc ttctgcgggg cttgccttct ggccatgccc 840

ttcttctctc ccttgcacct gtacctcttg gtctttgaat aaagcctgag taggaagaaa 900

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 1017

<210> 2

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 2

atggtcagca aaggcgaaga actcttcacc ggcgtcgtcc ccatcctcgt cgaactcgac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtc tccggcgaag gcgaaggcga cgccacctac 120

ggcaaactca ccctcaaatt catctgcacc accggcaaac tccccgtccc ctggcccacc 180

ctcgtcacca ccttcaccta cggcgtccaa tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaaa 240

caacacgact tcttcaaaag cgccatgccc gaaggctacg tccaagaacg caccatcttc 300

ttcaaagacg acggcaacta caaaacccgc gccgaagtca aattcgaagg cgacaccctc 360

gtcaaccgca tcgaactcaa aggcatcgac ttcaaagaag acggcaacat cctaggccac 420

aaactcgaat acaactacaa cagccacaac gtctacatca tggccgacaa acaaaaaaac 480

ggcatcaaag tcaacttcaa aatccgccac aacatcgaag acggcagcgt ccaactcgcc 540

gaccactacc aacaaaacac ccccatcggc gacggccccg tcctcctccc cgacaaccac 600

tacctcagca cccaatccgc cctaagcaaa gaccccaacg aaaaacgcga ccacatggtc 660

ctcctcgaat tcgtcaccgc cgccggcatc acccacggca tggacgaact ctacaaataa 720

<210> 3

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 3