一种硅基质核酸纯化柱的再生方法

技术领域

本发明属于分子生物学之核酸纯化技术领域，涉及一种实验用的硅基质核酸纯化柱的再生方法，尤其是一种操作简单、条件温和、便于对这类纯化柱的进行大量处理和再生的方法。

背景技术

核酸是生物遗传信息的承载体和传递者，是分子生物学最基本操作对象，核酸提取和纯化是分子生物学实验的重要组成部分。经典的酚-氯仿法提取和纯化核酸不但步骤烦琐，使用到苯酚、氯仿等有毒害的物质，还有多种杂质污染。离心型核酸纯化柱通常由外层的收集管和内层的纯化柱组成的离心型结构，纯化柱上填充的硅基质膜材料能高效、专一地吸附核酸，最大限度去除杂蛋白及细胞中其他杂质。近年来，商品化的硅基质核酸纯化柱(离心柱型)可特异性地吸附核酸DNA和RNA，有效去除杂质污染，具有操作过程简单，不使用有毒害物质等特点，已广泛用于基因组DNA提取、总RNA提取、DNA纯化、DNA胶回收和质粒DNA制备等常见的分子生物学实验。市场上众多的试剂盒中提供的硅基质核酸纯化柱或96孔板都是一次性的，价格昂贵，纯化柱在使用后直接丢弃，既浪费又不利于环保。如果实验室大量使用一次性的核酸纯化柱，大大增加了实验成本。此外，使用过的纯化柱残留有重组DNA或有害的核酸等成分，这些纯化柱未经处理而直接丢弃的话，可能造成对环境的损害或重要DNA的泄漏和污染。

目前，对这类柱子的再生利用已受到一些研究者的关注。Siddappa等(2007)利用1M盐酸浸泡核酸纯化柱，可有效去除残留的DNA，但处理时间长。Tagliavia等(2009)、姜王声等(中国专利200910220752.8)、韩寒(中国专利201010149814.3)和熊明华等(2015)主要以碱液或酸液相继处理污染基因组DNA的核酸纯化柱，能有效去除柱子上的核酸残留，但这些方法使用到较高浓度的有腐蚀性的强酸强碱(NaOH、H

发明内容

本发明提供一种硅基质核酸纯化柱的再生方法，通过食品级的柠檬酸和一种温和的去污剂Trition X-100的共同作用，将纯化柱上的硅基质膜及其管内壁上残留的核酸进行降解和清除，再通过低浓度的Tris-HCl缓冲液处理，达到消除残留核酸和恢复柱子吸附能力的目的。本方法具有处理条件温和，操作简单，无需使用强酸强碱试剂，具有生态环保等优点，可以一次性处理和再生大量的这类核酸纯化柱。本发明再生5次的纯化柱，其核酸吸附率保持在95％左右，而且其在提取和纯化其它的核酸，并不影响后续的相关实验。本发明方法适用于目前市场上常用硅基质核酸纯化柱，再生的纯化柱包括硅基质DNA纯化柱和硅基质RNA纯化柱，只是在柱子再生时将DNA纯化柱和RNA纯化柱分开进行处理即可。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

本发明所述的核酸纯化柱再生方法所需的溶液，A溶液和B溶液用去离子水现配现用，所述的A溶液为含有2％～4％(W/V)柠檬酸(食品级)和0.025％～0.1％(V/V)的TritionX-100混合溶液，所述的B溶液为5～10mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液。

本发明所述的硅基质核酸纯化柱的再生方法，所述的溶液A优选为含有2％(W/V)柠檬酸(食品级)和0.025％(V/V)的Trition X-100混合溶液，所述的B溶液优选为5mM的Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液。

本发明可以同时对多个硅基质核酸纯化柱进行再生处理，其步骤如下：

将一批使用过的纯化柱与其外部收集管分开，将纯化柱浸泡在2倍体积的A溶液中，于室温以20r/min条件下轻微搅拌10～15小时后，将用过的A溶液倒干净；纯化柱再用自来水冲洗2次；将纯化柱浸泡在2倍体积的B溶液中，搅匀后，静止，使B溶液保持在其pH为中性水平；将纯化柱捞出，浸泡在1倍体积的纯净水中，于121℃灭菌15分钟；将纯化柱捞出，放在60℃烘箱烘干待用；相应的收集管用自来水冲洗干净，晾干即可。

本发明与现有技术成果相比，具有实质性特点和显著的优势：

本发明综合分析了现有各种硅基质核酸离心纯化柱再生方法的存在的问题和不足，针对性地采取行之有效的办法，克服了现有硅基质核酸纯化柱残留核酸的清洗和再生所用强酸、强碱和高温加热处理等问题，通过使用柠檬酸(食品级)和温和的去污剂TritionX-100双重作用，适当的延长处理时间，对纯化柱的硅基质膜和管内壁残留的核酸和其它杂质进行全方面的降解和清除，再通过Tris-HCl缓冲液的平衡作用，有效地恢复了纯化柱对核酸结合能力。本发明所用的药品为实验室常规试剂，使用的柠檬酸是食品安全级的，是大包装，成本低廉，无毒无害。使用本发明的方法，能有效地清除硅基质纯化柱上残留的核酸、蛋白杂质等生物分子，恢复已使用过的硅基质纯化柱的核酸结合能力，使其可以再次应用于其他核酸样品的提取和纯化，不会造成样品间的交叉污染。本发明实施的办法，成本低，经济高效，环境污染小，可一次性地处理大量的硅基质核酸纯化柱，对这类纯化柱再生利用至少5次，大大节约了实验耗材费用。

附图说明

图1新核酸纯化柱和再生纯化柱纯化PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析图

图2新核酸纯化柱和再生纯化柱提取重组质粒及其酶切产物的琼脂糖凝胶电泳分析图

图3再生或未再生的核酸纯化柱其相应洗脱液的PCR产物检测的琼脂糖凝胶电泳分析图

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述，但需要说明的是，实施例并不构成对本发明要求保护范围的限制。

实例1

将40g柠檬酸(无水柠檬酸)加到2000mL去离子水中，充分搅拌至完全溶解，再加0.5mL的Trition X-100，充分搅拌，配制成含有2％(W/V)柠檬酸和0.025％(V/V)的TritionX-100溶液A；称取Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)1.58g加到2000mL去离子水中，充分搅拌至完全溶解，调pH为8.0，得到5mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液为溶液B。

本发明的方法对硅基质核酸纯化柱进行处理和再生，其操作步骤如下：

用75％酒精(或无水乙醇)将使用过核酸纯化柱上的记号标记拭擦干净，将纯化柱与其外部收集管分开，将纯化柱浸泡在2倍体积的A溶液中，于室温以20r/min条件下轻微搅拌10～15小时，再将处理过的溶液A倒干净，纯化柱用自来水冲洗2次。纯化柱再用2倍体积的溶液B浸泡过夜，用pH试纸检测使其溶液保持到pH为7.0即得。将纯化柱捞出，浸泡在装有1倍体积纯净水的三角烧瓶中，于121℃灭菌15分钟；将纯化柱捞出，放在60℃烘箱烘干即得无菌、无污染的纯化柱，收集管用自来水冲洗干净，晾干即可。

实例2

将60g柠檬酸(无水柠檬酸)加到2000mL去离子水中，充分搅拌至完全溶解，再加1.0mL的Trition X-100，充分搅拌，配制成含有3％(W/V)柠檬酸和0.05％(V/V)的TritionX-100溶液A；称取Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)3.16g加到2000mL去离子水中，充分搅拌至完全溶解，调pH为8.0，得到10mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液即溶液B。

按本实例配制溶液A和溶液B，按实例1的操作步骤，对已使用过的硅基质核酸纯化柱进行再生处理。

实例3

将80g柠檬酸(无水柠檬酸)加到2000mL去离子水中，充分搅拌至完全溶解，再加2.0mL的Trition X-100，充分搅拌，配制成含有4％(W/V)柠檬酸和0.1％(V/V)的TritionX-100溶液A；称取Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)3.16g加到2000mL去离子水中，充分搅拌至完全溶解，调pH为8.0，得到10mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液即溶液B。

按本实例配制溶液A和溶液B，按实例1的操作步骤，对已使用过的硅基质核酸纯化柱进行再生处理。

为了更好的对本发明的方法作进一步描述，本发明人以克隆大肠杆菌假定氧化还原酶(putative oxidoreductase)基因yqhD为实验对象，通过使用新纯化柱和再生5次的纯化柱，分别进行PCR产物纯化、重组质粒提取与酶切、纯化柱洗脱液的PCR验证和质粒转化等实验，验证本发明的方法对硅基质核酸纯化柱的处理和再生效果。

需要说明的是，新纯化柱是指商品化试剂盒所附带的未使用过的柱子，再生的纯化柱(使用过的，本发明再生处理得到的柱子)与新纯化柱为同一个供货商的同批次的产品。

由于RNA稳定性极差，在细胞之外RNA很容易发生自身的降解作用，所以本发明以比RNA稳定性更好的基因组DNA和质粒DNA为研究对象，研究本发明方法对这类DNA降解和清除效果，由此确定本发明的硅基质核酸纯化柱再生方法，视为适用于硅基质DNA纯化柱和硅基质RNA纯化柱。

实验材料包括：大肠杆菌基因组提取试剂盒，PCR产物纯化试剂盒和质粒提取试剂盒等，均为国内品牌公司的产品，各试剂盒附带的核酸纯化柱均为硅基质材料的核酸纯化柱。其它实验材料：大肠杆菌JM109、大肠杆菌K-12、克隆质粒pGEM-3zf(+)、相关DNA聚合酶、内切酶、连接酶等。M1:W2003 DNA Marker，M2:λDNA/HindIII DNA Marker，PCR仪为Biometra UNOII Thermoblock。大肠杆菌基因组提取、PCR产物纯化、质粒DNA的提取、酶切与连接、感受态细胞的制备和转化、LB培养基及氨苄青霉素、重组子的筛选，电泳分析、重组菌的培养等相关操作均按照相关说明书和相关方法进行。

GenBank中注释的大肠杆菌(Escherichia coli)K-12(NC_000913)yqhD基因序列为1164bp，根据其核苷酸全序列，设计引物P1(5’-TA

PCR产物纯化所用的试剂和操作方法皆按试剂盒说明书进行，以本发明再生利用5次的纯化柱(以同批次、未使用的新纯化柱为对照)，取等量的PCR产物进行纯化和电泳检测分析，其PCR产物的纯化后的电泳效果如图1所示。图1的M1为W2003 DNA Marker(韦柳静等，生物技术，2004，14(5))，33－35.)，图1中Lane 1、2、3和4都有约1.2kb大小的核酸目的条带出现，yqhD基因大小相符，其中Lane 1、2和3分别为本发明实例1、2和3再生5次的纯化柱纯化的PCR产物分析图，Lane 4为同批次、未使用过的新纯化柱纯化的PCR产物分析图。由此可知，实例1、2和3的方法再生5次的核酸纯化柱，其核酸吸附能力几乎和新纯化柱的吸附能力相当，其核酸吸附率都保持在95％以上，其中实例1的方法再生的纯化柱对核酸的纯化效果(Lane 1)甚至要好于新纯化柱的效果(Lane 4)，其吸附能力有所提高，表明本发明所述的再生方法能对这类纯化柱进行有效地处理，使这类纯化柱得以再生和重复利用，从而降低了实验耗材的费用。

本发明人将上述实例1、2和3再生纯化柱所纯化的PCR产物进行混合，并与克隆载体pGEM-3zf(+)进行平端连接，得到重组质粒pGEM-yqhD，重组质粒再转化到大肠杆菌宿主菌E.coli JM109感受态细胞，经筛选和酶切验证后最终得到重组菌株E.coli JM109/pGEM-yqhD，表明再生的纯化柱其纯化的核酸并不影响核酸片段之间的连接反应和转化效果。

为了验证再生纯化柱对提取质粒的得率和质粒的酶切影响，本发明人提取重组质粒所用的试剂和操作方法皆按试剂盒说明书进行，以本发明再生利用5次的纯化柱(以同批次、未使用的新纯化柱为对照)从重组菌株E.coli JM109/pGEM-yqhD中提取重组质粒pGEM-yqhD，取等量的重组质粒用EcoRI进行酶切，取等量的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图2的Lane 1、2、3和5所示都获得酶切产物约为3.2kb和1.2kb片段，其大小分别与克隆载体pGEM-3zf(+)和yqhD大小相符。图2中的M1为W2003 DNA Marker，M2为λDNA/HindIIIDNA Marker，Lane 1、2和3分别为本发明中实例1、2和3方法再生5次的纯化柱提取重组质粒的酶切结果，Lane 4(新纯化柱提取的质粒，未酶切)和Lane5为新纯化柱提取的重组质粒的酶切结果。由图2可知，Lane 1、2、3和5显示的重组质粒pGEM-yqhD酶切产物电泳亮度几乎一致，表明按本发明方法再生5次的核酸纯化柱，在提取重组质粒DNA时，其核酸吸附能力与新纯化柱的相差不大，其核酸吸附率保持在95％以上，而且其提取的重组质粒，其酶切效果未见受到影响。

为了检测经本发明再生的纯化柱其硅基质膜上的核酸残留情况，并检验再生纯化柱提取的核酸对PCR反应影响等情况，发明人分别使用再生的纯化柱提取重组质粒pGEM-yqhD的DNA和大肠杆菌K-12基因组后，将这些纯化柱分别通过上述实例1、2和3的方法进行再生处理，再分别用50μL的无菌超纯水洗脱这些纯化柱，将相应的洗脱液分别按相应的方法进行质粒转化实验(转化到大肠杆菌宿主菌E.coli JM109感受态细胞)和PCR检测实验。就提取重组质粒pGEM-yqhD的纯化柱而言，实验结果显示，再生的纯化柱其洗脱液经转化后在LB培养基平板上未见有菌落出现；同样条件下，未再生纯化柱其洗脱液经转化后在LB培养基平板有菌落出现(将这些菌落进行培养后，进行质粒提取、酶切验证和电泳分析，其结果和图2的结果相同)，表明本发明的办法能有效的清除硅基质纯化柱上残留的质粒DNA，再生处理的纯化柱其硅基质膜上没有检测到质粒DNA的残留。发明人分别以上述的洗脱液为模板，按上述的yqhD基因的扩增方法进行PCR反应和琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图3所示。图3中的M1为W2003 DNA Marker，Lane 1为提取大肠杆菌K-12基因组后其纯化柱(未经再生处理)洗脱液为模板的PCR检测结果；Lane 2为提取质粒后其纯化柱(未经再生处理)洗脱液为模板的PCR检测结果；图3中Lane 3、4和5为提取重组质粒后分别经实例1、2和3方法再生的纯化柱其洗脱液为模板的PCR检测结果；Lane 6为提取大肠杆菌K-12基因组后经再生处理的柱子其洗脱液为模板的PCR检测结果。研究结果表明，不管是提取基因组DNA还是提取质粒DNA，其相应的核酸纯化柱上还有少量的核酸残留，PCR检测结果呈阳性，有yqhD基因目的条带出现，也表明这些再生纯化柱提取的核酸为模板，并不影响其相应的PCR反应(图3的Lane 1和2)。发明人证实，经过本发明的办法对这类核酸纯化柱进行再生处理，可以有效地清除其硅基质膜及其管内壁上面残留核酸成分，PCR检测结果呈阴性，没有yqhD基因目的条带出现(图3的Lane 3、4、5和6)。综上所述，本发明的再生方法，能有效清除这类纯化柱上残留的核酸、蛋白杂质等生物分子，恢复已使用过的硅基质核酸纯化柱的核酸结合能力，使其可以再次应用于其他核酸样品的提取和纯化，不会造成样品间的交叉污染，用本方法再生的纯化柱其在提取和纯化的核酸，并不影响后续的如DNA连接、转化、酶切及PCR反应等相关最常用的实验。

本发明综合分析了当前核酸纯化柱子的再生处理办法存在的一些问题，创造性的优化组合了最新的试剂配方和处理方法。本发明方法可以有效清除硅基质核酸纯化柱上残留的核酸、蛋白杂质等生物分子，恢复纯化柱的核酸结合能力。本发明实施的办法，具有经济高效、环境污染小等优点，而且可一次性处理大量这类硅基质核酸纯化柱。本发明的方法对已使用过的硅基质核酸纯化柱至少可再生利用5次，大大减少了实验成本。本发明所述硅基质核酸纯化柱的再生方法，也适用于目前常用的、商品化的硅基质DNA纯化柱和硅基质RNA纯化柱，具有适用性和普遍性。

应该理解的是，对本领域的研究人员来说，根据上述说明加以改进或变换，例如，改进上述各溶液中相关试剂的比例和含量，改进、变换和优化相关操作步骤，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。