一种脂肪干细胞培养方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地说，涉及一种脂肪干细胞培养方法。

背景技术

脂肪组织在人体内储量丰富，通过抽脂从中获得的大量脂肪干细胞(ADSCs)，有自我更新增殖及多向分化潜能，可向脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞、成骨细胞、神经细胞、神经胶质细胞及胰岛细胞分化，而且可分泌多种促血管生成因子和抗凋亡因子而抗炎、抗氧化，可抵抗氧自由基的损伤，有望成为修复受损的组织和器官的干细胞来源。

目前在抽脂从中获得的大量脂肪干细胞后，需要对其清洗去除残留的血细胞和组织碎片，现有技术中，可能会出现在清洗过程中脂肪纯化不好，脂肪成活率低，使用后导致术后并发症多，同时可能还会需要多次清洗，降低了脂肪干细胞的利用率，增加了用工成本和用工时间。

发明内容

1.要解决的技术问题

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种脂肪干细胞培养方法，它可以实现当需要对吸脂来源的脂肪组织进行清洗时，脂肪组织放置在放置平台上端，将D-Hanks溶液加入进冲洗箱内，按压堵盖使穿透杆插设进脂肪组织，同时膨胀气囊内的D-Hanks溶液通过压力抵压流入至脂肪组织内壁，对脂肪内壁进行清洗，同时加热阻丝持续对冲洗箱内部进行恒温加热，使脂肪组织的分解效率大大提高，为后续的干细胞分离工作降低了难度，当脂肪组织清洗结束后，通过拉动限位柄带动活塞向右侧移动，对排液管道内造成负压现象，清洗后的D-Hanks溶液向限位柄一侧流动，同时吸附薄膜带动着膨胀气囊向下移动，吸附薄膜对D-Hanks溶液上的聚集一起的血细胞和组织碎片进行吸附，同时膨胀气囊对脂肪组织进行挤压，将脂肪组织上的D-Hanks溶液排干。

2.技术方案

为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。

一种脂肪干细胞培养方法，包括以下步骤：

S1、将吸脂来源的脂肪组织放置在冲洗装置中进行冲洗，去除残留的血细胞和组织碎片，称重后消化；

S2、消化完成后，弃掉上层未消化的脂肪组织，将下层的细胞悬液以1500r/min(375g)，离心10min后弃上清，得到离心管底部的脂肪干细胞团，将其重悬，密度调整到1×105mL-1，然后接种在培养面积为25cm*2cm的细胞培养瓶中；

S3、当干细胞长满培养瓶后按一传二进行传代，先用D-Hanks冲洗一遍细胞，然后加入2mL的混合酶溶液(0.25％胰酶和0.02％EDTA)消化，当在显微镜下观察到细胞发生明显的变形，缩成球状后，立即用含有10％胎牛血清的培养基中止消化，并用吸管轻轻吹打瓶底部，确保细胞完全脱落分离到悬液中，再把细胞悬液置于离心机上，以1000r/min(167g)，离心5min；

S4、最后，将离心得到的细胞团重悬，调整密度为合适密度进行接种。

进一步的，S1中的冲洗装置包括冲洗箱，所述冲洗箱上端螺纹连接有密封盖，所述密封盖外端固定连接有膨胀气囊，所述膨胀气囊内填充有D-Hanks溶液，所述膨胀气囊下端固定连接有吸附薄膜，所述吸附薄膜下端固定连接有多个均匀分布的穿透杆，所述穿透杆外端开凿有出液孔，所述穿透杆内壁之间转动连接有两个阻隔封片，所述膨胀气囊上端嵌设有加注口，所述加注口上端卡接有堵盖，所述冲洗箱内壁之间固定连接有放置平台，所述冲洗箱内壁嵌设安装有加热阻丝，所述冲洗箱外端插设有负压装置，当需要对吸脂来源的脂肪组织进行清洗时，通过将密封盖旋转打开，将脂肪组织放置在放置平台上端，将D-Hanks溶液加入进冲洗箱内，在将密封盖与冲洗箱闭合，按压堵盖使膨胀气囊受到挤压，使得穿透杆插设进脂肪组织，同时膨胀气囊内的D-Hanks溶液通过压力抵压将阻隔封片打开，D-Hanks溶液从出液孔流入至脂肪组织内壁，对脂肪内壁进行清洗，同时加热阻丝持续对冲洗箱内部进行恒温加热，使脂肪组织的分解效率大大提高，为后续的干细胞分离工作降低了难度，而脂肪组织清洗后的血细胞和组织碎片能更容于水聚集在一起，方便进行清理。

进一步的，所述负压装置包括排液管道，所述排液管道内壁之间固定连接有过滤网，所述排液管道内壁之间转动连接有阻隔阀门，所述阻隔阀门位于过滤网右侧，所述排液管道右端插设有插杆，所述插杆左端固定连接有活塞，所述活塞与排液管道内壁相接触，所述插杆右端固定连接有限位柄，所述限位柄位于排液管道右侧，所述排液管道外端开凿有排液口，当脂肪组织清洗结束后，通过拉动限位柄带动活塞向右侧移动，对排液管道内造成负压现象，使得阻隔阀门向排液管道内壁两侧转动打开，清洗后的D-Hanks溶液向限位柄一侧流动，同时吸附薄膜受到负压现象的影响带动着膨胀气囊进一步向下移动，吸附薄膜对D-Hanks溶液上的聚集一起的血细胞和组织碎片进行吸附，同时当D-Hanks溶液从排液口内流失至放置平台下侧后，膨胀气囊对脂肪组织进行挤压，将脂肪组织上的D-Hanks溶液排干。

进一步的，所述吸附薄膜采用吸油树脂材料制成的构件，且吸附薄膜位于膨胀气囊边缘处，通过设置吸油树脂，可以使吸附薄膜对D-Hanks溶液漂浮的血细胞和组织碎片具有更好的吸附力，通过设置在膨胀气囊边缘处，可以使膨胀气囊在挤压脂肪组织时，吸附薄膜不易触碰脂肪组织再次造成污染。

进一步的，所述阻隔封片和阻隔阀门的接触处均固定连接有密封垫，所述密封垫为橡胶材料制成的构件，通过设置密封垫，可以使D-Hanks溶液在存储过程中不易造成泄露，不易使D-Hanks溶液流出冲洗箱外造成影响。

进一步的，所述堵盖靠近加注口的一端固定连接有防护垫，所述堵盖上端开设有防滑纹，通过设置防护垫，可以使堵盖在长时间挤压膨胀气囊后，不易将膨胀气囊磨损，导致膨胀气囊泄露的现象，通过设置防滑纹，可以使在按压堵盖时更加的稳固，提高摩擦力。

进一步的，所述放置平台为滤网材料制成的构件，所述滤网孔径的尺寸与穿透杆的尺寸相匹配，通过设置滤网，可以使D-Hanks溶液能更好的渗透脂肪组织，通过相匹配的尺寸，可以使穿透杆在穿透过脂肪组织时不易造成抵触，提高工作效率。

进一步的，所述活塞外端套设有密封圈，所述密封圈与排液管道内壁相接触，通过设置密封圈，可以使活塞在排液管道气压推动时，气压不易造成泄露，使活塞在推动时，负压产生的压力更强。

进一步的，所述排液口内壁设有高分子疏水层，通过设置高分子疏水层，可以使D-Hanks溶液在排放时不易残留在排液口内壁，造成污染。

3.有益效果

相比于现有技术，本发明的优点在于：

本方案可以实现当需要对吸脂来源的脂肪组织进行清洗时，脂肪组织放置在放置平台上端，将D-Hanks溶液加入进冲洗箱内，按压堵盖使穿透杆插设进脂肪组织，同时膨胀气囊内的D-Hanks溶液通过压力抵压流入至脂肪组织内壁，对脂肪内壁进行清洗，同时加热阻丝持续对冲洗箱内部进行恒温加热，使脂肪组织的分解效率大大提高，为后续的干细胞分离工作降低了难度，当脂肪组织清洗结束后，通过拉动限位柄带动活塞向右侧移动，对排液管道内造成负压现象，清洗后的D-Hanks溶液向限位柄一侧流动，同时吸附薄膜带动着膨胀气囊向下移动，吸附薄膜对D-Hanks溶液上的聚集一起的血细胞和组织碎片进行吸附，同时膨胀气囊对脂肪组织进行挤压，将脂肪组织上的D-Hanks溶液排干。

附图说明

图1为本发明整体的结构示意图；

图2为本发明冲洗箱的结构示意图；

图3为本发明密封盖的结构示意图；

图4为本发明阻隔封片的结构示意图；

图5为本发明放置平台的结构示意图；

图6为本发明排液管道的结构示意图。

图中标号说明：

1冲洗箱、2密封盖、3膨胀气囊、4吸附薄膜、5穿透杆、6出液孔、7阻隔封片、8加注口、9堵盖、10放置平台、11加热阻丝、12排液管道、13过滤网、14阻隔阀门、15插杆、16活塞、17限位柄、18排液口。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图；对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；显然；所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例；而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例；本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例；都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“内”、“外”、“顶/底端”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“设置有”、“套设/接”、“连接”等，应做广义理解，例如“连接”，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

实施例：

请参阅图1-6,一种脂肪干细胞培养方法，包括以下步骤：

S1、将吸脂来源的脂肪组织放置在冲洗装置中进行冲洗，去除残留的血细胞和组织碎片，称重后消化；

S2、消化完成后，弃掉上层未消化的脂肪组织，将下层的细胞悬液以1500r/min(375g)，离心10min后弃上清，得到离心管底部的脂肪干细胞团，将其重悬，密度调整到1×105mL-1，然后接种在培养面积为25cm*2cm的细胞培养瓶中；

S3、当干细胞长满培养瓶后按一传二进行传代，先用D-Hanks冲洗一遍细胞，然后加入2mL的混合酶溶液(0.25％胰酶和0.02％EDTA)消化，当在显微镜下观察到细胞发生明显的变形，缩成球状后，立即用含有10％胎牛血清的培养基中止消化，并用吸管轻轻吹打瓶底部，确保细胞完全脱落分离到悬液中，再把细胞悬液置于离心机上，以1000r/min(167g)，离心5min；

S4、最后，将离心得到的细胞团重悬，调整密度为合适密度进行接种。

请参阅图1-5，S1中的冲洗装置包括冲洗箱1，冲洗箱1上端螺纹连接有密封盖2，密封盖2外端固定连接有膨胀气囊3，膨胀气囊3内填充有D-Hanks溶液，膨胀气囊3下端固定连接有吸附薄膜4，吸附薄膜4下端固定连接有多个均匀分布的穿透杆5，穿透杆5外端开凿有出液孔6，穿透杆5内壁之间转动连接有两个阻隔封片7，膨胀气囊3上端嵌设有加注口8，加注口8上端卡接有堵盖9，冲洗箱1内壁之间固定连接有放置平台10，冲洗箱1内壁嵌设安装有加热阻丝11，冲洗箱1外端插设有负压装置，当需要对吸脂来源的脂肪组织进行清洗时，通过将密封盖2旋转打开，将脂肪组织放置在放置平台10上端，将D-Hanks溶液加入进冲洗箱1内，在将密封盖2与冲洗箱1闭合，按压堵盖9使膨胀气囊3受到挤压，使得穿透杆5插设进脂肪组织，同时膨胀气囊3内的D-Hanks溶液通过压力抵压将阻隔封片7打开，D-Hanks溶液从出液孔6流入至脂肪组织内壁，对脂肪内壁进行清洗，同时加热阻丝11持续对冲洗箱1内部进行恒温加热，使脂肪组织的分解效率大大提高，为后续的干细胞分离工作降低了难度，而脂肪组织清洗后的血细胞和组织碎片能更容于水聚集在一起，方便进行清理。

请参阅图6，负压装置包括排液管道12，排液管道12内壁之间固定连接有过滤网13，排液管道12内壁之间转动连接有阻隔阀门14，阻隔阀门14位于过滤网13右侧，排液管道12右端插设有插杆15，插杆15左端固定连接有活塞16，活塞16与排液管道12内壁相接触，插杆15右端固定连接有限位柄17，限位柄17位于排液管道12右侧，排液管道12外端开凿有排液口18，当脂肪组织清洗结束后，通过拉动限位柄17带动活塞16向右侧移动，对排液管道12内造成负压现象，使得阻隔阀门14向排液管道12内壁两侧转动打开，清洗后的D-Hanks溶液向限位柄17一侧流动，同时吸附薄膜4受到负压现象的影响带动着膨胀气囊3进一步向下移动，吸附薄膜4对D-Hanks溶液上的聚集一起的血细胞和组织碎片进行吸附，同时当D-Hanks溶液从排液口18内流失至放置平台10下侧后，膨胀气囊3对脂肪组织进行挤压，将脂肪组织上的D-Hanks溶液排干。

请参阅图3，吸附薄膜4采用吸油树脂材料制成的构件，且吸附薄膜4位于膨胀气囊3边缘处，通过设置吸油树脂，可以使吸附薄膜4对D-Hanks溶液漂浮的血细胞和组织碎片具有更好的吸附力，通过设置在膨胀气囊3边缘处，可以使膨胀气囊3在挤压脂肪组织时，吸附薄膜4不易触碰脂肪组织再次造成污染。

请参阅图4和图6，阻隔封片7和阻隔阀门14的接触处均固定连接有密封垫，密封垫为橡胶材料制成的构件，通过设置密封垫，可以使D-Hanks溶液在存储过程中不易造成泄露，不易使D-Hanks溶液流出冲洗箱1外造成影响。

请参阅图1和图3，堵盖9靠近加注口8的一端固定连接有防护垫，堵盖9上端开设有防滑纹，通过设置防护垫，可以使堵盖9在长时间挤压膨胀气囊3后，不易将膨胀气囊3磨损，导致膨胀气囊3泄露的现象，通过设置防滑纹，可以使在按压堵盖9时更加的稳固，提高摩擦力。

请参阅图5，放置平台10为滤网材料制成的构件，滤网孔径的尺寸与穿透杆5的尺寸相匹配，通过设置滤网，可以使D-Hanks溶液能更好的渗透脂肪组织，通过相匹配的尺寸，可以使穿透杆5在穿透过脂肪组织时不易造成抵触，提高工作效率。

请参阅图6，活塞16外端套设有密封圈，密封圈与排液管道12内壁相接触，通过设置密封圈，可以使活塞16在排液管道12气压推动时，气压不易造成泄露，使活塞16在推动时，负压产生的压力更强。

请参阅图6，排液口18内壁设有高分子疏水层，通过设置高分子疏水层，可以使D-Hanks溶液在排放时不易残留在排液口18内壁，造成污染。

以上所述；仅为本发明较佳的具体实施方式；但本发明的保护范围并不局限于此；任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内；根据本发明的技术方案及其改进构思加以等同替换或改变；都应涵盖在本发明的保护范围内。