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一种棒状杆菌工程菌构建方法及应用

文献发布时间：2023-06-19 12:18:04

技术领域

本发明涉及一种棒状杆菌工程菌构建方法及应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

L-赖氨酸最初是从蛋白质水解产物中分离得到的，蛋白质水解法一般以动物血粉为原料，此法特点是工艺简单，但原料来源有限，仅适合小规模生产。后又出现了化学合成法、酶法，使用的化学合成法主要有荷兰的DMS法和日本的东丽法，这种方法最大的缺点是使用剧毒原料光气，可能残留催化剂，产品安全性差，存在严重的环保问题。1960年，日本首先采用微生物发酵法生产L-赖氨酸。微生物发酵生产氨基酸是人为地解除氨基酸生物合成的代谢控制机制，使其积累大量所需氨基酸。氨基酸的L型立体专一性决定了发酵法生产氨基酸较化学合成的工艺更简单、快捷。我国于20世纪60年代中期开始进行赖氨酸菌株选育和发酵的研究，但因产量较低难以工业化，直到70年代末80年代初世界赖氨酸实现工业化后我国研究才取得突破。目前，世界生产赖氨酸的企业大多采用发酵法，生产的为L型赖氨酸，生产工艺已基本成熟。

用于发酵法生产L-赖氨酸的微生物包括多个种属，例如棒状杆菌、芽孢杆菌、埃希氏菌等，但是，野生型菌株产L-赖氨酸的能力差，代谢副产物多，难以实现高纯度和高产量L-赖氨酸的制备。因此，通常需要获得高产L-赖氨酸的菌株。目前，获得高产L-赖氨酸菌株的方法主要包括诱变筛选育种或者基因工程育种。诱变筛选育种是指通过紫外照射或者其他外界条件刺激，诱导菌株发生不特定的基因位点突变，然后通过筛选获得高产菌株，这种方法缺乏方向性，基因突变位点难以控制，对菌株性能的预期性差。基因工程育种是通过明确的基因改造方式来优化选育菌株，例如通过增加拷贝或者定点突变导入酶活性高的有益酶基因，或者通过敲除不利基因使酶活性/表达消失。目前，谷氨酸棒状杆菌CICC 23604已经被广泛应用于工业发酵生产各类氨基酸，其产品被FDA认证为“generally regarded assafe”(GRAS)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组谷氨酸棒状杆菌是生产食品安全级L-赖氨酸的有效途径。

基因5′端序列一般是指位于结构基因5′端上游，通常包含有RNA聚合酶识别、结合和起始转录位点的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，其本身不被转录，它的特性最初是通过能增加或降低基因转录速率的突变而鉴定的。启动子一般位于基因5′端序列内部，长度因生物种类而异，一般不超过200bp，是典型的顺式作用元件，与转录因子(反式作用因子)相结合调控基因表达的水平、部位及方式(中国专利文献CN109385424A)。基因5′端序列替换可被用于以特定的方式调节基因的表达，如它们的条件表达或过表达。以PCR为基础的基因靶向，通过同源重组实现开放阅读框(ORF)上游调控序列的染色体整合，可以使基因组发生稳定的改变(中国专利文献CN111655860A)。

虽然目前已有很多关于提高L-赖氨酸产量的报道，但是开发新的提高L-赖氨酸产量的方法仍然有其必要性。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种棒状杆菌工程菌构建方法及应用。本发明的棒状杆菌工程菌是通过基因工程改造棒状杆菌宿主菌获得，具体策略为运用基因5′端序列替换的方法替换丙酮酸羧化酶(Pyruvate Carboxylase，PC)基因5′端序列的部分核苷酸序列，获得高产L-赖氨酸的重组棒状杆菌。

术语说明：

丙酮酸羧化酶(Pyruvate Carboxylase，PC)：是糖异生的限速酶，广泛存在于细菌、酵母和动物植物中，可在L-赖氨酸和L-谷氨酸的工业发酵生产中补充消耗的草酰乙酸。

本发明技术方案如下：

一种改造PC基因5′端序列的棒状杆菌工程菌，是在棒状杆菌宿主菌中，将PC基因5′端序列中起始密码子GTG前-73位～-61位核苷酸序列

根据本发明优选的，所述棒状杆菌宿主菌为谷氨酸棒状杆菌；进一步优选为谷氨酸棒状杆菌CICC23604或谷氨酸棒状杆菌CGMCC1.15647。

根据本发明优选的，所述PC的氨基酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.8。

根据本发明优选的，所述PC的氨基酸序列为与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.8的序列一致性大于等于99.2％的氨基酸序列。

根据本发明优选的，所述PC基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.9。

根据本发明优选的，所述PC基因的核苷酸序列为与SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.9的序列一致性大于等于97.6％的核苷酸序列。

根据本发明优选的，所述PC基因5′端序列为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.10。

根据本发明优选的，所述PC基因5′端序列为与SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.10的序列一致性大于等于96.7％的核苷酸序列。

上述棒状杆菌工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)合成上游同源臂-

(2)将上游同源臂-

(3)将替换载体转化棒状杆菌宿主菌感受态细胞，筛选具有卡那霉素抗性的阳性转化子，获得发生了第一次同源单交换的重组菌；

(4)将发生了第一次同源单交换的重组菌自然传代后，筛选能在10％蔗糖培养基生长但不能在具有卡那霉素抗性的培养基生长的菌落，验证后得到完成两次同源单交换的棒状杆菌工程菌。

根据本发明优选的，步骤(2)中上游同源臂-

根据本发明优选的，步骤(3)中以卡那霉素抗性基因引物采用PCR扩增技术筛选具有卡那霉素抗性的阳性转化子，所述引物序列如下：

F1：5′-ATGATTGAACAAGATGGATTGC-3′，

R1：5′-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG-3′。

进一步优选的，所述PCR扩增的体系为：2×HiFi-PCRmaster10μL，10μmol/L F1 1μL，10μmol/L R1 1μL，模板1μL，ddH

所述PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

根据本发明优选的，步骤(4)中所用培养基为LBG培养基：葡萄糖5g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L。

本发明中，步骤(4)采用条件培养基筛选验证后，还可采用PCR扩增技术进一步验证。

上述棒状杆菌工程菌在生产L-赖氨酸中的应用。

根据本发明优选的，所述应用是将棒状杆菌工程菌接种至液体LBG培养基中进行种子培养，其后按体积百分比2～5％接种量接种至发酵培养基发酵培养；

所述LBG培养基：葡萄糖5g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L；

所述发酵培养基：葡萄糖100g/L，蛋白胨20g/L，玉米浆30mL/L，尿素5g/L，(NH

根据本发明优选的，所述种子培养的条件为200～220rpm、28～30℃下培养18-25h；所述发酵培养的条件为200～220rpm、28～30℃。

本发明的技术原理是：

基因5′端序列包含基因的启动子区序列，启动子区序列的二级结构能够影响启动子启动效率，进而影响启动子后基因的表达活性。本发明通过将PC基因5′端序列中起始密码子GTG前-73位～-61位核苷酸序列

有益效果：

本发明提供了一种改造PC基因5′端序列的棒状杆菌工程菌，是将PC基因5′端序列中起始密码子GTG前-73位～-61位核苷酸序列

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。实施例中的涉及的试剂及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品；实施例中涉及的实验方法，若无特殊说明，均为本领域常规技术手段。

微生物来源：

谷氨酸棒状杆菌CICC23604，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号CICC23604，其中丙酮酸羧化酶(PC)的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，PC基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2，PC基因5′端序列为SEQ ID NO.3。

谷氨酸棒状杆菌CGMCC1.15647，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号CGMCC1.15647，其中丙酮酸羧化酶(PC)的氨基酸序列为SEQ ID NO.8，PC基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.9，PC基因5′端序列为SEQ ID NO.10。

SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.8氨基酸序列一致性为99.2％，SEQ ID NO.2与SEQ IDNO.9核苷酸序列一致性为97.6％，SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.10核苷酸序列一致性为96.7％。

实施例中涉及的玉米浆为发酵专用玉米浆，可购自诸城东晓生物科技有限公司。

实施例1：含有拟替换序列同源臂基因合成及替换载体构建

1.1谷氨酸棒状杆菌CICC23604

针对谷氨酸棒状杆菌CICC23604，合成上游同源臂-

1.2谷氨酸棒状杆菌CGMCC1.15647

针对谷氨酸棒状杆菌CGMCC1.15647，合成上游同源臂-

实施例2：制备谷氨酸棒状杆菌CICC23604/CGMCC1.15647感受态细胞

(1)挑取谷氨酸棒状杆菌单菌落，接种于10mL种子培养基中，37℃、220r/min，过夜培养；

种子培养基(1000mL)，组分如下：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g、山梨醇91g；

(2)取1mL上述菌液转接到100mL种子培养基中，37℃、220r/min培养至OD

(3)将菌液转移至100mL离心管，冰浴15-20min，使菌体停止生长；

(4)冰浴后4℃、5000r/min、5min离心，收集菌体；

(5)离心后的菌体用预冷的电转缓冲液(ETM)洗涤3次；

电转缓冲液(1000mL)，每升组分如下：山梨醇91g、甘露醇91g、甘油100mL；

(6)洗涤结束后，使用1000μL电转缓冲液重悬菌体，得感受态细胞；

(7)将制备好的感受态细胞分装100μL/管，-80℃保存，备用。

实施例3：替换载体电转谷氨酸棒状杆菌感受态细胞

首先利用核酸超微量分光光度计测定替换载体pK19mobsacB-PC1或pK19mobsacB-PC2片段浓度，达到300μg/mL浓度后1800V电击5ms，进行电转化，分别转化至谷氨酸棒状杆菌CICC23604感受态细胞和谷氨酸棒状杆菌CGMCC1.15647感受态细胞中，得到的细胞使用液体复苏培养基30℃复苏培养1h后，取100μL涂布在含25μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，在37℃培养2天，分别筛选具有卡那霉素抗性的谷氨酸棒状杆菌CICC23604转化子和谷氨酸棒状杆菌CGMCC1.15647转化子。

其中液体复苏培养基，每1000mL组分如下：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g、山梨醇91g、甘露醇69.4g。

实施例4：阳性重组菌的培养及鉴定

(1)卡那霉素抗性初筛

挑取实施例3中卡那霉素抗性平板上的单菌落分别接种于含25μg/mL卡那霉素的液体LBG培养基中，提取基因组作为模板DNA，并采用卡那霉素抗性基因引物进行PCR扩增来验证，在795bp处有目的条带即为阳性转化子；

其中，所述LBG培养基：葡萄糖5g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L；

所述卡那霉素抗性基因引物序列如下：

F1：5′-ATGATTGAACAAGATGGATTGC-3′，

R1：5′-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG-3′，

所述的PCR扩增体系如下：

表1 PCR扩增体系

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

挑选在795bp处有特异性条带出现的菌株作为发生同源单交换的菌株进行进一步验证。

(2)蔗糖平板复筛

将上述验证正确的发生同源单交换的菌株分别接种到不含抗生素的液体LBG培养基中，自然传代3次，每代培养24h，最后取200μL菌液涂布到含10％蔗糖的固体LBG培养基(不含抗生素)上，18-24h后，挑选菌落点种至具有卡那霉素抗性(25μg/mL)的固体LBG培养基进行培养。筛选能在10％蔗糖LBG培养基生长但不能在具有卡那霉素抗性的LBG培养基生长的菌落，进行基因组的提取，采用PCR扩增进行验证；

其中，针对谷氨酸棒状杆菌CICC23604转化子，所述PCR扩增的引物序列如下：

F2：5′-GGGGAATCGTGTGGTATAATGG-3′，

R2：5′-TTAGGAAATGACGACGATCAAGTC-3′，

F2引物3′末端序列含有替换后的位点

所述PCR扩增体系如下：

表2 PCR扩增体系

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸4min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；

挑选在约3505bp处的特异性条带，连接至pMD18-T载体，并采用载体引物测通测序，验证后获得完成两次同源单交换的棒状杆菌工程菌PC1。

针对谷氨酸棒状杆菌CGMCC1.15647转化子，所述PCR扩增的引物序列如下：

F3：5′-GGGGAATCGTGTGGTATAATGG-3′，

R3：5′-CTAGGAAATGACGACGATCAAGTC-3′，

F3引物3′末端序列含有替换后的位点

所述PCR扩增体系如下：

表3 PCR扩增体系

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸4min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；

挑选在约3505bp处的特异性条带，连接至pMD18-T载体，并采用载体引物测通测序，验证后获得完成两次同源单交换的棒状杆菌工程菌PC2。

实施例5：重组菌的稳定性验证

将上述筛选出并验证正确的棒状杆菌工程菌PC1和PC2分别进行传代培养，首先挑取平板上的单菌落接种于不含抗生素的液体LBG培养基中培养12h，之后按照体积百分比1％的接种量连续传代培养30代，取最后一代菌液进行基因组提取，分别用F2和R2、F3和R3为引物进行菌落PCR验证。结果显示，使用引物F2和R2扩增棒状杆菌工程菌PC1、使用F3和R3扩增棒状杆菌工程菌PC2能够分别扩增出一条特异性基因条带，大小约为3505bp，与理论值相符，证明替换的

其中，所述PCR扩增体系如下：

表4 PCR扩增体系

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸4min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

实施例6：L-赖氨酸发酵测试

将上述制备的棒状杆菌工程菌PC1和PC2分别接种至100mLLBG培养基(葡萄糖5g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L)中220rpm、30℃下进行种子培养20h，其后按体积百分比2％接种量分别接种至100mL发酵培养基(葡萄糖100g/L，蛋白胨20g/L，玉米浆30mL/L，尿素5g/L，(NH

表5不同时间棒状杆菌工程菌PC1与原始菌L-赖氨酸的平均产量

表6不同时间棒状杆菌工程菌PC2与原始菌L-赖氨酸的平均产量

结果显示与原始菌相比，在发酵48h后，棒状杆菌工程菌PC1发酵液中L-赖氨酸的含量达到47.3g/L，较原始菌提高了10.5％，棒状杆菌工程菌PC2发酵液中L-赖氨酸的含量达到0.95g/L，是原始菌的2.16倍。这表明将谷氨酸棒状杆菌PC基因5′端序列中起始密码子GTG前-73位～-61位核苷酸序列替换为

使用RNAfold web server(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)对谷氨酸棒状杆菌CICC23604和CGMCC1.15647中PC基因5′端序列(SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.10)起始密码子GTG前-73位～-61位核苷酸序列替换前后的序列进行稳定性分析，结果显示谷氨酸棒状杆菌CICC23604中PC基因5′端序列起始密码子GTG前-73位～-61位核苷酸序列替换为

SEQUENCE LISTING

<110> 齐鲁工业大学

诸城东晓生物科技有限公司

<120> 一种棒状杆菌工程菌构建方法及应用

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1140

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum) CICC23604

<400> 1

Met Ser Thr His Thr Ser Ser Thr Leu Pro Ala Phe Lys Lys Ile Leu

1 5 10 15

Val Ala Asn Arg Gly Glu Ile Ala Val Arg Ala Phe Arg Ala Ala Leu

20 25 30

Glu Thr Gly Ala Ala Thr Val Ala Ile Tyr Pro Arg Glu Asp Arg Gly

35 40 45

Ser Phe His Arg Ser Phe Ala Ser Glu Ala Val Arg Ile Gly Thr Glu

50 55 60

Gly Ser Pro Val Lys Ala Tyr Leu Asp Ile Asp Glu Ile Ile Gly Ala

65 70 75 80

Ala Lys Lys Val Lys Ala Asp Ala Ile Tyr Pro Gly Tyr Gly Phe Leu

85 90 95

Ser Glu Asn Ala Gln Leu Ala Arg Glu Cys Ala Glu Asn Gly Ile Thr

100 105 110

Phe Ile Gly Pro Thr Pro Glu Val Leu Asp Leu Thr Gly Asp Lys Ser

115 120 125

Arg Ala Val Thr Ala Ala Lys Lys Ala Gly Leu Pro Val Leu Ala Glu

130 135 140

Ser Thr Pro Ser Lys Asn Ile Asp Glu Ile Val Lys Ser Ala Glu Gly

145 150 155 160

Gln Thr Tyr Pro Ile Phe Val Lys Ala Val Ala Gly Gly Gly Gly Arg

165 170 175

Gly Met Arg Phe Val Ala Ser Pro Asp Glu Leu Arg Lys Leu Ala Thr

180 185 190

Glu Ala Ser Arg Glu Ala Glu Ala Ala Phe Gly Asp Gly Ala Val Tyr

195 200 205

Val Glu Arg Ala Val Ile Asn Pro Gln His Ile Glu Val Gln Ile Leu

210 215 220

Gly Asp His Thr Gly Glu Val Val His Leu Tyr Glu Arg Asp Cys Ser

225 230 235 240

Leu Gln Arg Arg His Gln Lys Val Val Glu Ile Ala Pro Ala Gln His

245 250 255

Leu Asp Pro Glu Leu Arg Asp Arg Ile Cys Ala Asp Ala Val Lys Phe

260 265 270

Cys Arg Ser Ile Gly Tyr Gln Gly Ala Gly Thr Val Glu Phe Leu Val

275 280 285

Asp Glu Lys Gly Asn His Val Phe Ile Glu Met Asn Pro Arg Ile Gln

290 295 300

Val Glu His Thr Val Thr Glu Glu Val Thr Glu Val Asp Leu Val Lys

305 310 315 320

Ala Gln Met Arg Leu Ala Ala Gly Ala Thr Leu Lys Glu Leu Gly Leu

325 330 335

Thr Gln Asp Lys Ile Lys Thr His Gly Ala Ala Leu Gln Cys Arg Ile

340 345 350

Thr Thr Glu Asp Pro Asn Asn Gly Phe Arg Pro Asp Thr Gly Thr Ile

355 360 365

Thr Ala Tyr Arg Ser Pro Gly Gly Ala Gly Val Arg Leu Asp Gly Ala

370 375 380

Ala Gln Leu Gly Gly Glu Ile Thr Ala His Phe Asp Ser Met Leu Val

385 390 395 400

Lys Met Thr Cys Arg Gly Ser Asp Phe Glu Thr Ala Val Ala Arg Ala

405 410 415

Gln Arg Ala Leu Ala Glu Phe Thr Val Ser Gly Val Ala Thr Asn Ile

420 425 430

Gly Phe Leu Arg Ala Leu Leu Arg Glu Glu Asp Phe Thr Ser Lys Arg

435 440 445

Ile Ala Thr Gly Phe Ile Ala Asp His Pro His Leu Leu Gln Ala Pro

450 455 460

Pro Ala Asp Asp Glu Gln Gly Arg Ile Leu Asp Tyr Leu Ala Asp Val

465 470 475 480

Thr Val Asn Lys Pro His Gly Val Arg Pro Lys Asp Val Ala Ala Pro

485 490 495

Ile Asp Lys Leu Pro Asn Ile Lys Asp Leu Pro Leu Pro Arg Gly Ser

500 505 510

Arg Asp Arg Leu Lys Gln Leu Gly Pro Ala Ala Phe Ala Arg Asp Leu

515 520 525

Arg Glu Gln Asp Ala Leu Ala Val Thr Asp Thr Thr Phe Arg Asp Ala

530 535 540

His Gln Ser Leu Leu Ala Thr Arg Val Arg Ser Phe Ala Leu Lys Pro

545 550 555 560

Ala Ala Glu Ala Val Ala Lys Leu Thr Pro Glu Leu Leu Ser Val Glu

565 570 575

Ala Trp Gly Gly Ala Thr Tyr Asp Val Ala Met Arg Phe Leu Phe Glu

580 585 590

Asp Pro Trp Asp Arg Leu Asp Glu Leu Arg Glu Ala Met Pro Asn Val

595 600 605

Asn Ile Gln Met Leu Leu Arg Gly Arg Asn Thr Val Gly Tyr Thr Pro

610 615 620

Tyr Pro Asp Ser Val Cys Arg Ala Phe Val Lys Glu Ala Ala Ser Ser

625 630 635 640

Gly Val Asp Ile Phe Arg Ile Phe Asp Ala Leu Asn Asp Val Ser Gln

645 650 655

Met Arg Pro Ala Ile Asp Ala Val Leu Glu Thr Asn Thr Ala Val Ala

660 665 670

Glu Val Ala Met Ala Tyr Ser Gly Asp Leu Ser Asp Pro Asn Glu Lys

675 680 685

Leu Tyr Thr Leu Asp Tyr Tyr Leu Lys Met Ala Glu Glu Ile Val Lys

690 695 700

Ser Gly Ala His Ile Leu Ala Ile Lys Asp Met Ala Gly Leu Leu Arg

705 710 715 720

Pro Ala Ala Val Thr Lys Leu Val Thr Ala Leu Arg Arg Glu Phe Asp

725 730 735

Leu Pro Val His Val His Thr His Asp Thr Ala Gly Gly Gln Leu Ala

740 745 750

Thr Tyr Phe Ala Ala Ala Gln Ala Gly Ala Asp Ala Val Asp Gly Ala

755 760 765

Ser Ala Pro Leu Ser Gly Thr Thr Ser Gln Pro Ser Leu Ser Ala Ile

770 775 780

Val Ala Ala Phe Ala His Thr Arg Arg Asp Thr Gly Leu Ser Leu Glu

785 790 795 800

Ala Val Ser Asp Leu Glu Pro Tyr Trp Glu Ala Val Arg Gly Leu Tyr

805 810 815

Leu Pro Phe Glu Ser Gly Thr Pro Gly Pro Thr Gly Arg Val Tyr Arg

820 825 830

His Glu Ile Pro Gly Gly Gln Leu Ser Asn Leu Arg Ala Gln Ala Thr

835 840 845

Ala Leu Gly Leu Ala Asp Arg Phe Glu Leu Ile Glu Asp Asn Tyr Ala

850 855 860

Ala Val Asn Glu Met Leu Gly Arg Pro Thr Lys Val Thr Pro Ser Ser

865 870 875 880

Lys Val Val Gly Asp Leu Ala Leu His Leu Val Gly Ala Gly Val Asp

885 890 895

Pro Ala Asp Phe Ala Ala Asp Pro Gln Lys Tyr Asp Ile Pro Asp Ser

900 905 910

Val Ile Ala Phe Leu Arg Gly Glu Leu Gly Asn Pro Pro Gly Gly Trp

915 920 925

Pro Glu Pro Leu Arg Thr Arg Ala Leu Glu Gly Arg Ser Glu Gly Lys

930 935 940

Ala Pro Leu Thr Glu Val Pro Glu Glu Glu Gln Ala His Leu Asp Ala

945 950 955 960

Asp Asp Ser Lys Glu Arg Arg Asn Ser Leu Asn Arg Leu Leu Phe Pro

965 970 975

Lys Pro Thr Glu Glu Phe Leu Glu His Arg Arg Arg Phe Gly Asn Thr

980 985 990

Ser Ala Leu Asp Asp Arg Glu Phe Phe Tyr Gly Leu Val Glu Gly Leu

995 1000 1005

Glu Thr Leu Ile Arg Leu Pro Asp Val Arg Thr Pro Leu Leu Val

1010 1015 1020

Arg Leu Asp Ala Ile Ser Glu Pro Asp Asp Lys Gly Met Arg Asn

1025 1030 1035

Val Val Ala Asn Val Asn Gly Gln Ile Arg Pro Met Arg Val Arg

1040 1045 1050

Asp Arg Ser Val Glu Ser Val Thr Ala Thr Ala Glu Lys Ala Asp

1055 1060 1065

Ser Ser Asn Lys Gly His Val Ala Ala Pro Phe Ala Gly Val Val

1070 1075 1080

Thr Val Thr Val Ala Glu Gly Asp Glu Val Lys Ala Gly Asp Ala

1085 1090 1095

Val Ala Ile Ile Glu Ala Met Lys Met Glu Ala Thr Ile Thr Ala

1100 1105 1110

Ser Val Asp Gly Lys Ile Asp Arg Val Val Val Pro Ala Ala Thr

1115 1120 1125

Lys Val Glu Gly Gly Asp Leu Ile Val Val Ile Ser

1130 1135 1140

<210> 2

<211> 3423

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum) CICC23604

<400> 2

gtgtcgactc acacatcttc aacgcttcca gcattcaaaa agatcttggt agcaaaccgc 60

ggcgaaatcg cggtccgtgc tttccgtgca gcactcgaaa ccggtgcagc cacggtagct 120

atttaccccc gtgaagatcg gggatcattc caccgctctt ttgcttctga agctgtccgc 180

attggtaccg aaggctcacc agtcaaggcg tacctggaca tcgatgaaat tatcggtgca 240

gctaaaaaag ttaaagcaga tgccatttac ccgggatacg gcttcctgtc tgaaaatgcc 300

cagcttgccc gcgagtgtgc ggaaaacggc attactttta ttggcccaac cccagaggtt 360

cttgatctca ccggtgataa gtctcgcgcg gtaaccgccg cgaagaaggc tggtctgcca 420

gttttggcgg aatccacccc gagcaaaaac atcgatgaga tcgttaaaag cgctgaaggc 480

cagacttacc ccatctttgt gaaggcagtt gccggtggtg gcggacgcgg tatgcgtttt 540

gttgcttcac ctgatgagct tcgcaaatta gcaacagaag catctcgtga agctgaagcg 600

gctttcggcg atggcgcggt atatgtcgaa cgtgctgtga ttaaccctca gcatattgaa 660

gtgcagatcc ttggcgatca cactggagaa gttgtacacc tttatgaacg tgactgctca 720

ctgcagcgtc gtcaccaaaa agttgtcgaa attgcgccag cacagcattt ggatccagaa 780

ctgcgtgatc gcatttgtgc ggatgcagta aagttctgcc gctccattgg ttaccagggc 840

gcgggaaccg tggaattctt ggtcgatgaa aagggcaacc acgtcttcat cgaaatgaac 900

ccacgtatcc aggttgagca caccgtgact gaagaagtca ccgaggtgga cctggtgaag 960

gcgcagatgc gcttggctgc tggtgcaacc ttgaaggaat tgggtctgac ccaagataag 1020

atcaagaccc acggtgcagc actgcagtgc cgcatcacca cggaagatcc aaacaacggc 1080

ttccgcccag ataccggaac tatcaccgcg taccgctcac caggcggagc tggcgttcgt 1140

cttgacggtg cagctcagct cggtggcgaa atcaccgcac actttgactc catgctggtg 1200

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gctgagttca ccgtgtctgg tgttgcaacc aacattggtt tcttgcgtgc gttgctgcgt 1320

gaagaggact tcacttccaa gcgcatcgcc accggattca ttgccgatca cccgcacctc 1380

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accgtgaaca agcctcatgg tgtgcgtcca aaggatgttg cagctcctat cgataagctg 1500

cctaacatca aggatctgcc actgccacgc ggttcccgtg accgcctgaa gcagcttggc 1560

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ttccgcgatg cacaccagtc tttgcttgcg acccgagtcc gctcattcgc actgaagcct 1680

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