一种DNA提取方法及鉴定甜瓜杂交种纯度的方法

技术领域

本发明属于遗传育种领域，涉及植物DNA提取方法，以及利用该DNA提取方法进行甜瓜纯度的鉴定方法。

背景技术

目前，甜瓜绝大部分商品种子使用的是杂交种。甜瓜杂交种的遗传真实性是种子质量的重要标志之一，它直接影响甜瓜生产的产量和品质。随着甜瓜杂交种的广泛推广和种业市场的日趋成熟，甜瓜杂交种纯度快速检验的重要性越来越突出。传统的杂交种纯度鉴定主要通过田间形态学鉴定，但鉴定难度大、周期长、成本高，不可控因素多，难以满足生产需求。

SSR分子标记具有多态性高、数量丰富、重复性好、呈共显性遗传等特点，可高效、准确区分父、母本及杂交种的带型，已广泛应用到水稻、油菜、番茄、西瓜等很多作物杂交种纯度鉴定、分子标记辅助育种及其指纹图谱构建等方面。SSR技术是目前进行DUS检测中的首选标记。

植物组织中DNA的有效提取是SSR分子标记的前提和基础，也是最关键的一步。传统植物组织基因组DNA的提取主要采用CTAB法或SDS法，这些操作方法步骤繁琐、试剂组成复杂、易污染、操作难度大、耗时长，无法满足实验室对快速、大规模植物组织基因组DNA提取的需要。同时，传统方法是以叶片作为DNA提取材料，需要在播种后20～30天才能进行DNA提取操作，等待周期太长。

发明内容

鉴于此，本发明目的在于提供一种DNA提取方法，该方法更简便、安全、效率更高。

本发明的另一目的在于提供一种鉴定甜瓜杂交种纯度的方法，该方法简便快捷，克服了形态学鉴定中因环境和人为因素造成的系统误差，准确性更高。

发明人通过长期的探索和尝试，以及多次的实验和努力，不断的改革创新，为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是，提供一种DNA提取方法，顺次包括如下步骤：

S11、取胚根，并将胚根磨碎；

S12、向磨碎后的胚根中添加第一提取液，沸水加热，冷却至室温；

S13、加入第二提取液，充分混匀，冷藏放置后高速离心，取上清液；

所述第一提取液为氢氧化钠和氯化钠的水溶液，所述第二提取液为醋酸钾水溶液。

根据本发明DNA提取方法的一个实施方式，所述第一提取液的浓度为0.1mol/L；所述第二提取液的浓度为0.1mol/L。

根据本发明DNA提取方法的一个实施方式，顺次包括如下具体步骤：

S21、取1～2cm长胚根，置于1.5ml Eppendorf管中，加入0.02g石英砂磨碎；

S22、向每管Eppendorf中加入150ul第一提取液，沸水加热10min，自然冷却至室温；

S23、再向每管Eppendorf中加入150ul第二提取液，充分混匀，4℃冰箱放置10min；8℃，12000r/min离心6min；取上清液；

所述第一提取液为氢氧化钠0.6g、氯化钠0.8766g、150ml水；

所述第二提取液为醋酸钾1.4721g，加水150ml。

根据本发明DNA提取方法的一个实施方式，所述胚根为瓜类植物胚根。

根据本发明DNA提取方法的一个实施方式，所述瓜类植物包括甜瓜、黄瓜。

根据本发明DNA提取方法的一个实施方式，所述胚根通过以下方式催芽得到：

将甜瓜种子在30℃水中浸种6h，再用自来水清洗，将种子用湿毛巾包裹后，再用保鲜膜包裹，置于恒温培养箱中30℃催芽，待胚根长至1～2cm时，取胚根。

本发明还提供了一种鉴定甜瓜杂交种纯度的方法，对杂交种F1代种子纯度进行鉴定，使用前述DNA提取方法提取得到的上清液中DNA进行SSR标记鉴定。

本发明还提供了一种鉴定甜瓜杂交种纯度的方法一个实施方式，所述甜瓜为川蜜脆玉。

根据本发明鉴定甜瓜杂交种纯度的方法的一个实施方式，所述SSR标记鉴定包括PCR扩增步骤：

PCR反应体系：DNA模板1μL，10μmol·L

所述上下游引物为以下引物对中的一对或两对：

第一引物对：

上游引物序列：CAATTTCCAATCCATCTGCTC，

下游引物序列：ATCGAAATTCCTCCCTCGTT；

第二引物对：

上游引物序列：TTTCCCGCATTGATTTTCTC；

下游引物序列：GAGAAACGCTTCCCACAAAC；

PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，引物退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸7min；4℃保存。

根据本发明鉴定甜瓜杂交种纯度的方法的一个实施方式，所述SSR标记鉴定还包括电泳步骤：

扩增产物经垂直电泳分离，分离胶为8％非变性聚丙烯酰胺凝胶，电压150V。

根据本发明鉴定甜瓜杂交种纯度的方法的一个实施方式，还包括种子纯度鉴定分析步骤：

根据扩增PCR产物的电泳带型，统计具有父母本特征条带的个体数量，鉴定为有效杂交种，反之为假杂种，并计算杂交种纯度；

杂交种纯度＝(同时具有父母本条带的个体数/检测总数)×100％。

与现有技术相比，上述技术方案中的一个技术方案具有如下优点：

a)本发明DNA提取方法采用胚根为试验材料，获取胚根的时间(1～2天)远远少于获取叶片组织的时间(20～30天)，且本发明DNA提取方法仅需使用3种无毒试剂即可提取DNA。实验结果表明，本发明方法提取得到的DNA与现有技术真叶CTAB法提取的DNA扩增带型无差异，完全可以保证后续SSR标记。本发明DNA提取方法步骤简单、试剂种类少、安全无毒、成本低、提取过程省时省力，显著提高工作效率，更适用于规模化研究。

b)本发明鉴定甜瓜川蜜脆玉纯度的方法中，筛选到2对在“川蜜脆玉”及其父本、母本间呈现多态性谱带、在杂一代中具有双亲互补特征待型的引物；选取第一引物对和第二引物对杂一代种子进行鉴定，结果与田间形态鉴定结果高度吻合，一致性约为99.39％。试验证明，这2对引物可以作为特异性引物进行瓜类作物特别是“川蜜脆玉”杂交种纯度鉴定。

c)现有技术中，多利用单对SSR特异引物鉴定甜瓜杂交种子纯度，虽可以有效区分杂交一代种子中是否混有母本自交系种子，却不能有效区分是否含有不明来源甜瓜花粉造成的杂交种及人为掺假的种子，从而导致鉴定结果出现偏差。因此，仅仅利用单对SSR引物鉴定甜瓜杂交种纯度具有一定的局限性。为进一步提高检测的准确性和科学性，本发明选取扩增条带位置各不相同的SSR引物进行组合，将某一杂交种与其同母异父的其他杂交组合完全区分开来。本发明中，利用2对具有多态性差异引物，同时对“川蜜脆玉”进行纯度鉴定，确保了鉴定结果的准确性和可靠性。本发明SSR标记的杂交种纯度鉴定技术周期短、简便快捷、效率高、成本低，不仅克服了形态学鉴定周期长、难度大、成本高的难题，同时也克服了因环境或人为因素造成的系统误差，准确性更高。

d)本发明SSR分子标记技术检测技术体系可以取代大田经典的形态性状鉴定方法，在甜瓜杂交种纯度及真实性的快速鉴定应用中大有潜力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1是本发明鉴定甜瓜杂交种纯度的方法中第一引物对在154个“川蜜脆玉”单株中扩增产物电泳图。

图2是本发明鉴定甜瓜杂交种纯度的方法中第二引物对在154个“川蜜脆玉”单株中扩增产物电泳图。

图3是第一引物对、第二引物对在胚根和叶片中的PCR扩增产物电泳图。

具体实施方式

为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。

实施例1

本实施例中所描述的DNA提取方法，顺次包括如下步骤：

S21、取1～2cm长胚根，置于1.5ml Eppendorf管中，加入0.02g石英砂磨碎。

S22、向每管Eppendorf中加入150ul第一提取液，沸水加热10min，自然冷却至室温；所述第一提取液的浓度为0.1mol/L，具体来说，本实施例中第一提取液的组成为氢氧化钠0.6g、氯化钠0.8766g、150ml水。

S23、向每管Eppendorf中加入150ul第二提取液，所述第二提取液的浓度为0.1mol/L；第二提取液的组成为醋酸钾1.4721g，加水150ml；充分混匀，4℃冰箱放置10min；12000r/min离心6min；取上清液。

本实施例中，所述胚根为瓜类植物胚根，例如甜瓜和黄瓜等种子新萌发的胚根。

以甜瓜种子为例，所述胚根通过以下方式催芽得到：

将甜瓜种子在30℃水中浸种6h，再用自来水清洗，将种子用湿毛巾包裹后，再用保鲜膜包裹，置于恒温培养箱中30℃催芽，1～2天后胚根长至1～2cm时，剪取胚根。

当然，还可以用其它现有方式对瓜类植物种子进行催芽萌发，获取胚根。

本发明DNA提取方法与现有技术中的CTAB法提取的真叶DNA的PCR扩增带型无差异，完全可以保证后续SSR标记鉴定的有效开展，同时本发明方法步骤简单、试剂种类少、安全无毒、成本低、提取过程省时省力，显著提高工作效率。本发明DNA提取方法不仅可以用于甜瓜胚根的DNA提取，还可以用于其他植物胚根的DNA提取，例如，发明人使用本发明DNA提取方法成功提取了黄瓜胚根DNA。

SDS法、CTAB法等现有DNA提取方法，需使用2片真叶作为材料提取DNA，育苗过程需要20～30天之久，试验材料获取周期较长，工作效率低。CTAB法提取DNA操作繁琐、涉及试剂种类繁多，甚至包含部分有毒试剂。而本发明获得试验材料胚根仅需1-2天，从胚根中提取DNA步骤简单，且仅需3种无毒试剂即可。

实施例2

本实施例所描述的鉴定甜瓜杂交种纯度的方法中，是以“川蜜脆玉”作为提取对象，所述“川蜜脆玉”是四川省农业科学院园艺研究所育成的适合中国南北保护地的综合抗性好、坐果能力强、耐裂性好的优质高产甜瓜新品种，已在山东省潍坊市、四川省成都市、绵阳市、德阳市等地种植。

本实施例所描述的鉴定甜瓜杂交种纯度的方法是利用实施例1提取得到的DNA，对“川蜜脆玉”种子纯度进行SSR标记鉴定。分别提取母本胚根、母本叶片、父本胚根、父本叶片、“川蜜脆玉”胚根、“川蜜脆玉”叶片的DNA，并使用与本发明筛选所用的相同引物进行SSR标记鉴定，其中，母本胚根、父本胚根、“川蜜脆玉”胚根的DNA采用实施例1的方法进行提取，母本叶片、父本叶片、“川蜜脆玉”叶片的DNA采用现有CTAB法进行提取。

提取的DNA采用微量分光光度计(赛默飞NanoDrop One，美国)进行DNA质量检测，检测合格后，进行PCR扩增。

PCR反应体系(25μL)：

DNA模板1μL，上下游引物各1μL(10μmol·L

本实施例中引物对如序列表所示：

第一引物对：

上游引物序列：CAATTTCCAATCCATCTGCTC，

下游引物序列：ATCGAAATTCCTCCCTCGTT；

第二引物对：

上游引物序列：TTTCCCGCATTGATTTTCTC；

下游引物序列：GAGAAACGCTTCCCACAAAC。

PCR反应程序：

94℃预变性5min；94℃变性30s，引物退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸7min；4℃保存。PCR仪为Bio-Rad T100 PCR仪(美国伯乐公司生产)。

垂直电泳分离

扩增产物经垂直电泳分离(分离胶为8％非变性聚丙烯酰胺凝胶)，电压150V(电泳仪为PowerPac Universal通用型电泳仪，美国伯乐公司生产；电泳槽型号JY-SCZ9型垂直电泳槽，北京君意东方电泳设备有限公司)。采用快速银染法显色并照相记录。图1是本发明鉴定甜瓜川蜜脆玉纯度的方法中第一引物对在154个“川蜜脆玉”单株中扩增产物电泳图。图1中M泳道是marker。图2是本发明鉴定甜瓜川蜜脆玉纯度的方法中第二引物对在154个“川蜜脆玉”单株中扩增产物电泳图。图2中T泳道是marker。图3是第一引物对、第二引物对在母本胚根、母本叶片、父本胚根、父本叶片、“川蜜脆玉”胚根、“川蜜脆玉”叶片中的PCR扩增产物电泳图。图3中：第1泳道是marker，第8～13泳道分别是母本胚根、母本叶片、父本胚根、父本叶片、“川蜜脆玉”胚根、“川蜜脆玉”叶片的以第二引物对为引物的PCR扩增产物电泳图，第43～48泳道分别是母本胚根、母本叶片、父本胚根、父本叶片、“川蜜脆玉”胚根、“川蜜脆玉”叶片的以第一引物对为引物的PCR扩增产物电泳图。

根据电泳结果，进行种子纯度鉴定分析，并与田间形态学纯度鉴定结果进行比对分析。

本发明实施例采用种子纯度鉴定分析：利用可以有效区分父母本和杂交种的多态性SSR标记引物，进行杂交种F1代种子纯度鉴定。根据扩增PCR产物的电泳带型，统计具有父母本特征条带的个体数量，鉴定为有效杂交种，反之为假杂种，并计算杂交种纯度。

杂交种纯度＝(同时具有父母本条带的个体数/检测总数)×100％。

作为对比，采用田间形态学纯度鉴定统计：试验在位于四川省简阳市的国家西甜瓜产业技术体系成都综合试验站试验基地进行。“川蜜脆玉”播种3批，每批100株。大棚内定植株行距为36cm×70cm，采用高垄、膜下滴灌等常规管理。在生长期，根据植株生长势、果实外观、果皮颜色等田间形态特征进行调查，根据田间性状差异确定待测杂交种的田间调查纯度。

田间形态鉴定纯度(％)＝(1-假杂种子数/种植有效总数)×100％。

参见图1和图2，利用第一引物对和第二引物对对154粒“川蜜脆玉”种子胚根进行SSR纯度鉴定，结果显示，图1中151份材料扩增出亲本互补条带，“川蜜脆玉”种子纯度为98.1％。图1显示有3份材料为假杂种，这3份假杂种材料经扩增出与母本一致的条带，分别分布在图1中的泳道I、泳道II和泳道III。图2显示有3份材料为假杂种，这3份假杂种材料PCR扩增出的条带与母本一致，分别分布在图2中的泳道a、泳道b和泳道c。图1中的第一引物对的PCR扩增结果与图2中的第二引物对的PCR扩增结果一致。制种过程中，若母本去雄不彻底，便会导致母本自交结实，使收获的杂交种混有少量母本的种子，出现假杂种。与田间种植的“川蜜脆玉”的大田纯度鉴定结果相比较，((1-4/300)×100％＝98.7％)SSR鉴定结果与其高度吻合，符合率达到99.4％。试验表明利用本发明分子标记方法进行甜瓜杂交种纯度鉴定结果与传统田间鉴定结果一致。

在对比实施方案中，将采用本发明方法提取的胚根DNA与传统的CTAB法提取的真叶DNA进行扩增比较，结果显示：采用第一引物对和第二引物对两对引物条件下，两种不同部位不同方法提取的DNA扩增带型在“川蜜脆玉”及父本和母本中均表现一致，说明采用本发明DNA提取方法获得的DNA能够满足甜瓜SSR标记纯度鉴定的需要，且方法更简单、效率更高。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。