一种植物乳杆菌BUFX及其在代谢综合征中的应用

技术领域

本发明涉及微生物及其应用技术领域，尤其是涉及一种植物乳杆菌（

背景技术

随着人们生活水平的提高，饮食结构的改变，吃喝不忌口，多吃少动，糖尿病又被称为“富贵病”。这种现代的生活方式容易造成体内葡萄糖过量，导致血糖升高，而长期的高血糖症或者血糖升高则通常导致糖尿病的发生。随时间推移，糖尿病可能损害心血管、肾脏和神经系统，目前糖尿病对失明、肾衰竭、心脏病发作、中风和下肢截肢的主要病因之一，严重危害人类健康。据国际世界卫生组织统计，糖尿病患者人数从从1980年的1.08亿上升至2014年的4.22亿，每年由于高血糖或糖尿病导致的死亡数目高达几百万。

肠道微生物与人体健康的关系日益得到认可，健康的肠道菌群在很大程度上有助于维持机体健康。肠道益生菌群数量与多样性与人体葡萄糖耐量密切相关。菌群紊乱失调是糖尿病、肥胖症等代谢疾病发展的重要因素之一。大量研究显示，无论是动物实验中的动物模型或者临床试验中的糖尿病患者，摄入某些益生菌或者益生菌发酵食品之后血糖浓度呈现不同程度的下降。

传统的降糖治疗主要包括药物和饮食控制血糖和运动锻炼。长期使用降糖药，容易提高胰岛的耐药性，造成器官功能衰退，另一种药途径胰岛素注射，但容易造成过敏，有效期短，停药会导致血糖水平反弹，当用量过度时，还会导致低血糖，危害更大。由于益生菌具有食用性，益生菌降糖则有很高的安全性，不会对机体产生额外的副作用。目前我国已公布可食用的35种或亚种益生菌，但由于糖尿病发病机制复杂，并且益生菌的功能存在菌株特异性，其对肠道菌群及宿主代谢的影响也存在差异。因此，寻找和挖掘具有优异降糖功效的益生菌株对预防和治疗高血糖症和糖尿病具有重要的市场意义。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有降高血糖功效的植物乳杆菌及其应用；该植物乳杆菌能够促进HepG2肝癌细胞葡萄糖消耗，抑制α-淀粉酶活性，并且可以显著降低高脂饮食小鼠的体重、血脂和高血糖含量，改善葡萄糖耐量及胰岛素抵抗，并缓解肝脏脂肪变性。

本发明第一方面提供保藏编号为CGMCC No. 22172的植物乳杆菌（

其中，所述植物乳杆菌（

本发明筛选到一株降高血糖功效的植物乳杆菌BUFX，通过质谱分析鉴定该菌株为植物乳杆菌（

本发明还可以将所述菌株制备为微生物菌剂，所述微生物菌剂含有前述的植物乳杆菌BUFX的菌体（活菌液或死菌体）或所述植物乳杆菌BUFX的培养物（如培养上清液）。在具体的方案中，所述微生物菌剂可以为液体菌剂或固体菌剂。进一步地，所述微生物菌剂所含副干酪乳杆菌的总菌落数为0.5×10

本发明第二方面提供了上述的植物乳杆菌或其培养上清液或其死菌体在制备用于改善和/或预防代谢综合征的药物中的应用。

本发明第三方面提供了上述的植物乳杆菌或其培养上清液或其死菌体在制备用于改善和/或预防高血糖的药物中的应用。本发明的植物乳杆菌具有促进HepG2肝癌细胞葡萄糖消耗，抑制α-淀粉酶活性的功效，因此，本发明也提供了所述植物乳杆菌在有促进HepG2肝癌细胞葡萄糖消耗、抑制α-淀粉酶活性方面的作用。

本发明第四方面提供了上述的植物乳杆菌或其培养上清液或其死菌体在制备用于改善脂质代谢的药物中的应用。

本发明第五方面提供了上述的植物乳杆菌或其培养上清液或其死菌体在制备用于改善和/或预防脂质积累的药物中的应用。

本发明第六方面提供了上述的植物乳杆菌或其培养上清液或其死菌体在制备用于改善和/或预防高脂血症的药物中的应用。

本发明第七方面提供了上述的植物乳杆菌或其培养上清液或其死菌体在制备用于改善和/或预防脂肪肝的药物中的应用。

本发明第八方面提供了上述的植物乳杆菌或其培养上清液或其死菌体作为食品或食品成分的应用。

本发明第九方面提供了食品，其包括上述的植物乳杆菌或其培养上清液或其死菌体。

本发明第十方面提供了药物组合物，其包括上述的植物乳杆菌或其培养上清液或其死菌体。

本发明第十一方面提供在患者中治疗代谢综合征的方法，包括以第一方面所述的植物乳杆菌或其培养上清液或其死菌体或第十方面所述的药物组合物向所述患者给药。

需要说明的是，本发明所称的代谢综合征为包括但不限于肥胖、高血糖、高血压、血脂异常、高血黏、高尿酸、高脂肪肝发生率、胰岛素抵抗、高胰岛素血症。

需要说明的是，本发明所称的改善包括但不限于降低血糖含量、降低体重、降低血脂含量、抑制α-淀粉酶活性、减少胰岛素抵抗、提高葡萄糖耐量、缓解肝脏脂肪变性。

需要说明的是，本发明所称的药物组合物还包括剂型上或药学可接受的载体，例如固态载体或液态载体，具体地，例如膨润土、碳酸钙、沸石、淀粉；或者植物油、矿物油和水等。所述药物组合物可以制备为多种剂型，例如冻干粉剂、片剂、胶囊剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、酊剂、悬浮液剂、糖浆剂和乳剂或药剂领域普通技术人员熟知的剂型。

其中，当剂型或药学上可接受的载体为固态药物组合物时（如胶囊剂、片剂和粉剂），可以包含合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂、致流动剂和熔化剂等，其中，合适的粘合剂包括淀粉、明胶、天然糖（如葡萄糖或β-乳糖）、玉米甜味剂、天然和合成树胶，如阿拉伯胶、黄耆胶或藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡等。这些剂型中所用的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。崩解剂包括但不限于：淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等。

此外，胶囊剂（例如明胶胶囊）可包含活性成分和粉状载体，如乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸等。类似的稀释剂可用来制备压制片。片剂和胶囊均可制成即时释放产品或缓释产品。压制片可以包糖衣或包膜以遮蔽任何令人不快的味道及保护片剂不受大气影响，或包肠衣使其在胃肠道中选择性崩解。

其中，当剂型或药学上可接受的载体为液态药物组合物时，包含在水、药学上可接受的脂肪和油、醇包括酯或其它有机溶剂中的溶液或悬浮液、乳剂、糖浆或酏剂、悬浮液、溶液和/或从非泡腾颗粒重建的悬浮液及从泡腾颗粒重建的泡腾制剂等液体药物组合物。这样的液体剂型可包括例如合适的溶剂、防腐剂、乳化剂、悬浮剂、稀释剂、甜味剂、增稠剂和熔化剂。

其中，口服给药用的液态药物组合物可包含着色剂和调味剂以提高患者的接受度。一般来说，水、合适的油、盐水、含水右旋糖（葡萄糖）和相应的糖溶液和乙二醇（如丙二醇或聚乙二醇）是非经胃肠道溶液的合适载体。例如，在口服用片剂或胶囊剂型中，活性成分可与口服无毒的药学上可接受的惰性载体（如乳糖、明胶、琼脂、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸二钙、硫酸钙、甘露醇、山梨醇等）混合。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

（1）本发明提供的植物乳杆菌BUFX能够促进HepG2肝癌细胞葡萄糖消耗，抑制α-淀粉酶活性，并且可以显著降低高脂饮食小鼠的体重和血脂含量，改善葡萄糖耐量及胰岛素抵抗，并缓解肝脏脂肪变性，对于预防或治疗糖尿病和肥胖等代谢性疾病的发生具有重要的应用意义。

（2）本发明的植物乳杆菌菌株BUFX是发明人通过大量工作筛选得到的，该菌株较其他植物乳杆菌菌株具有更优异的降血糖能力。该菌株的发现为降糖食品或药品提供了一种新的微生物资源。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明中的植物乳杆菌BUFX的质谱鉴定图；

图2示出了本发明中的植物乳杆菌BUFX对人工胃液（A）、人工肠液（B）及胆盐（C）的耐受性；

图3示出了本发明中的植物乳杆菌BUFX活菌及发酵上清液对α-淀粉酶（A）和α-葡萄糖苷酶（B）活性的抑制；其中，阿卡波糖作为阳性对照；

图4示出了本发明中的植物乳杆菌BUFX发酵上清液对HepG2肝癌细胞葡萄糖消耗的影响，胰岛素作为阳性对照，上清液的添加量设置3个浓度，分别为10%、20%和30%（v/v细胞培养基体积）；

图5示出了本发明中的植物乳杆菌BUFX活菌液及死菌体对高脂喂养小鼠体重的影响；

图6示出了本发明中的植物乳杆菌BUFX改善高脂喂养小鼠的葡萄糖和胰岛素耐受；（A）高脂喂养小鼠的空腹血糖值，（B）小鼠OGTT口服葡萄糖耐量实验；

图7示出了本发明中的植物乳杆菌BUFX降低高脂喂养小鼠的血清甘油三酯TG（A）、总胆固醇TC（B）和低密度脂蛋白胆固醇LDL-c（C）的含量。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

除非另外定义，本发明中使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在现有技术与本发明冲突的情况下，应当以本发明为准。

实施例1：样品采集和菌株分离

采集长期生活在北京城区的健康成年人的粪便作为筛选样品，采集对象人群在采集前未服用过抗生素类药物，无益生菌服用史，无胃肠病史。将采集来的粪便样品稀释后涂布于YCFA培养基，37℃厌氧培养24-48h，分离获得平板上不同的单菌落。用灭菌后的接种环挑取不同单菌落在新的YCFA固体培养基平板上划线纯化，37℃厌氧培养48h，得到纯化菌落29株，分别标注为L1-L29。

需要说明的是，粪便样品的稀释为本领域常规方法，本发明不做限制，在本发明的一个实施例中，使用清水对粪便样品进行稀释。

实施例2：活菌液，代谢产物及灭活菌体的制备

2.1 菌种的培养

取-80℃冻存菌液涂布于YCFA固体平板，在37℃条件下倒置培养24-48h后，取单菌落接种于液体YCFA培养基中，37℃培养18-24h，得到一代菌液；取一代菌液10%接种至新鲜YCFA液体培养基，37℃培养18-24h得到二代菌液；取二代菌液10%接种于新鲜的YCFA液体培养基中，37℃培养18-24h得到工作菌液。

活菌液的获得

在本发明的实施例中，将步骤1获得的工作菌液置于13000 rpm，4℃的条件下离心15 min后，弃去上清，收集沉淀，用生理盐水重悬，获得具有活菌体的活菌液。

活菌液还可以通过本技术领域中的其他方式获得，只要能从培养液中富集菌体即可。例如可以通过离心和/或过滤的方法实现。

代谢产物的获得

菌体代谢产物一般存在菌体的培养液中，因此，可以通过将菌体的培养液进行固液分离，获得上清液的方式来获得代谢产物。当然，细菌培养物上清液的制备也可在厌氧环境下进行。在本发明的一个实施例中，具体是将工作菌液于13000 rpm，4℃离心15 min后留取上清液转移至无菌离心管后即可获得细菌培养物上清液，4℃存放备用，获得代谢产物。

死菌液的获得

死菌体可以通过本领域常规的手段进行制备，例如，加热，辐射等。在本发明的一个实施例中，通过将活菌体在温度为65℃-85℃条件下，加热1h致死获得死菌体的死菌液。

实施例3:具有促进细胞葡萄糖细胞作用的菌株筛选与鉴定

3.1 菌株鉴定

将分离得到的单菌落进行划线培养，然后挑取单菌落涂布在质谱板上，分别加入裂解液和基质干燥后使用MALDI-TOF MS 1000质谱仪（Autobio）进行鉴定，即可获得各菌株信息。

细胞葡萄糖消耗检测实验

本发明所用的人源肝癌HepG2细胞购自于国家生物医学实验细胞资源库。细胞培养采用本领域公知的培养方式，本发明不作限制。

人源肝癌HepG2细胞培养在37℃和5% CO

表1各菌株对HepG2细胞葡萄糖消耗的影响

从表1可以看出，分离获得的29株菌均属于乳杆菌属，包括了粘膜乳杆菌、唾液乳杆菌、戊糖乳杆菌、植物乳杆菌和清酒乳杆菌5个菌种。29株菌均对HepG2细胞葡萄糖消耗表现出不同程度的促进作用，其中L14植物乳杆菌的促消耗作用最强，暗示该株菌很有可能通过促进细胞细胞消耗葡萄糖，减少葡萄糖的储存，达到降血糖的目的。图1的质谱鉴定结果显示L14号菌隶属于植物乳杆菌种，据此我们将本菌株命名为植物乳杆菌（

实施例4: 植物乳杆菌BUFX的胃肠道耐受性评估

4.1 植物乳杆菌BUFX对人工胃液和肠液的耐受性检测

4.1.1人工胃肠液的制备

本发明中所使用的人工胃肠液的制备参照中国药典。

人工胃液：首先配制稀盐酸，量取234 ml浓盐酸，加水稀释至1000 ml，得到9.5%-10.5%的稀盐酸，然后取稀盐酸16.4 ml，加水800 ml与胃蛋白酶10 g，摇匀后，加水稀释至1000 ml即可获得人工胃液。

人工小肠液：取磷酸二氢钾6.8 g，加水500 ml使其充分溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，另称量胰酶10g，加水溶解，将两种溶液混合后，加水稀释至1000 ml即可获得人工肠液。

菌株的耐受性测试

收集培养后的活菌体于13000 rpm，4℃离心15 min后，弃去液体，留取菌体沉淀，用生理盐水重悬，按照活菌数10

图2中A的结果显示本发明中的植物乳杆菌BUFX菌株对人工胃液表现出较好的耐酸性，孵育 1h后，植物乳杆菌BUFX的存活率为92.3%，2h后的存活率大于82.5%，当孵育时间延长至4h后BUFX菌株仍有高达62.4%的存活率，这些结果表明植物乳杆菌BUFX在强酸环境中能保持较高的存活率，可以经受胃部强酸性环境的考验，有利于其充分发挥益生菌的效用。

图2中B的结果显示植物乳杆菌BUFX菌株具有较好的肠液耐受性，在pH 6.8的环境中1h后，本发明的植物乳杆菌BUFX的存活率高达81.4%，2h后的存活率大于70.3%，4h后的存活率为53.7%，表明植物乳杆菌BUFX具有较好的肠液耐受性，可以在肠道中保留较多的菌量，从而有助于发挥益生作用。

植物乳杆菌BUFX胆盐耐受性测定

将收集的活菌按10

根据图2中C所示的结果可以看出，本发明的植物乳杆菌BUFX菌株具有较好的胆盐耐受性，与无胆盐添加组相比，胆盐添加0.25 %时，本发明的植物乳杆菌BUFX的存活率可达65.2%，当胆盐含量增加到1%浓度时，该菌株仍保持48.4%的存活率，因此，上述结果表明本发明的植物乳杆菌BUFX能够很好地耐受胆盐，满足益生菌在人体胃肠消化道的存活要求。

实施例5：植物乳杆菌BUFX对淀粉酶和糖苷酶的抑制作用

5.1 植物乳杆菌BUFX抑制淀粉酶抑制测定

取质量浓度为2 mg/ml的α-淀粉酶溶液2 ml（用50 mM，pH7.0的PBS缓冲液配制），分别加2 ml样液（BUFX活菌悬液和发酵上清液），37℃下反应30 min后加入2 ml 1%可溶性淀粉，37℃反应15 min，加碘液显色，用酶标仪测定660 nm处的吸光值OD

图3中A结果表明：与阳性药阿卡波糖相比，BUFX活菌悬液和发酵上清液的淀粉酶抑制率平均值约为47.5%和42.1%，表明菌株及其代谢产物具有较高的淀粉酶抑制活性，本发明提供的菌株具有有效抑制唾液淀粉酶和胰液淀粉酶活性的潜能。

植物乳杆菌BUFX对α-葡萄糖苷酶的影响

取30 µl植物乳杆菌BUFX样品（包括活菌悬液和发酵上清液）于30 µl α-葡萄糖苷酶酶液（0.1U/ml）混合，在37℃下孵育10 min，之后加入60 µl底物PNPG（0.5mM），在37℃下反应20 min，加入100 µl 2M的碳酸钠溶液终止反应。然后用酶标仪测定405nm处的吸光值OD

图3中B结果显示：BUFX活菌悬液和发酵上清液的α-葡萄糖苷酶抑制率分别为24.1%和26.8%，阿卡波糖的抑制率能达到33.2%。表明菌株及其分泌至胞外的代谢物质具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，由于具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的物质能有效防治餐后高血糖和缓解高胰岛素血症，因此，本发明提供的菌株很有可能在体内发挥防治餐后高血糖和缓解高胰岛素血症的效用。

实施例6：植物乳杆菌BUFX发酵上清液促进肝细胞葡萄糖消耗的量效分析

本发明所用的人源肝癌HepG2细胞购自于国家生物医学实验细胞资源库。细胞培养采用本领域公知的培养方式，本发明不作限制。

本实施例中的细胞培养与操作方法与实施例3中基本相同。将生长状态良好的对数生长期的人源肝癌HepG2细胞，以适宜浓度接种于96孔板中，每孔加入细胞悬液100 µl，并留出一排不加细胞作为空白组，培养24 h至细胞完全贴壁。实验时弃去原培养基，并轻轻拍打96孔板，保证培养基倾倒干净。每8个孔为一组，换上高糖无酚红的不完全培养基，然后进行对应的处理，其中样品组每孔加入含10%/20%/30%体积BUFX菌株发酵上清液，对照组加入同等体积的培养菌株所用培养基YCFA，阳性药组则加入用不完全培养基配制的胰岛素溶液（终浓度10 µmol/L）。将细胞放入培养箱中孵育培养24 h后测定培养基上清中葡萄糖含量。每孔取2 µl培养基上清于新的96孔板中，按南京建成葡萄糖氧化酶试剂盒操作说明加入250 µl反应液，放入37℃烘箱中反应10 min。待反应液显色完全后，用酶标仪测定505 nm处吸光度，然后按试剂盒说明书计算每组的葡萄糖消耗量，实验结果如图4所示。

图4的实验结果可以看出，原始细胞培养基中的葡萄糖含量为22.5 mmol/L，添加本发明植物乳杆菌BUFX发酵上清液（10%、20%和30%）后细胞培养基中的葡萄糖含量明显降低，平均值分别约为16.6 mmol/L和15.8 mmol/L，阳性对照组胰岛素处理细胞后培养基中葡萄糖含量降至平均值约为13.1 mmol/L。可见，本发明提供的植物乳杆菌BUFX菌株发酵上清液能够显著促进HepG2肝癌细胞消耗葡萄糖，减少葡萄糖的在细胞内的积累。

实施例7：植物乳杆菌BUFX改善高脂小鼠的糖脂代谢紊乱中的应用

本实施例用以说明本发明的植物乳杆菌BUFX降血糖和改善葡萄糖耐受的功效。

动物实验所用小鼠购买自北京维通利华实验动物，选取8周龄雄性C57BL/6小鼠32只，随机分4组（正常组Chow，模型组HFD，植物乳杆菌BUFX活菌液组，BUFX死菌体组），随机分配每组8只动物。正常组给予标准小鼠饲料，其余各组给予60%脂肪功能的高脂饲料喂养8周。之后进行灌胃实验，其中BUFX活菌组每天给予1×10

图5结果显示，高脂饲料喂养后小鼠体重明显增加，显著高于正常喂养组，而灌胃本发明中的植物乳杆菌BUFX（包括活菌液和死菌体组）后小鼠体重增加变少，表明BUFX菌株能够抑制体重增加。如图6所示，对各组小鼠血清样本分析后发现灌胃本发明中的植物乳杆菌BUFX（包括活菌液组和死菌体组）可以降低禁食状态下高脂模型组小鼠的高血糖值（238mg/dL vs 157 mg/dL, 173 mg/dL），口服葡萄糖耐量OGTT实验显示BUFX活菌和死菌都能有效改善高脂饮食导致的葡萄糖耐受，增强机体对葡萄糖的敏感性。进一步的血清生化指标检测结果（图7）表明：高脂饮食能够导致小鼠甘油三酯（B）、总胆固醇（C）和低密度脂蛋白胆固醇（D）的水平显著增加，呈现出明显的高脂血症表型，提示小鼠的糖脂代谢功能异常。本发明的植物乳杆菌BUFX活菌和灭活菌体，也能显著降低动物的血脂（TG、TC和LDL-c）水平，以上结果综合说明本发明中的植物乳杆菌BUFX具有出良好的降血糖和降血脂活性，可以改善高脂饮食带来的糖脂代谢紊乱。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。