杂交胸腺、制备方法及诱导异种移植物耐受性、恢复免疫能力和胸腺功能的使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年9月20日提交的美国专利申请序列号62/734,019的优先权，所述申请在此以引用的方式整体并入。

政府利益声明

本发明是根据美国国家卫生研究院授予的AI084903、AI045897和AI106697在政府资助下进行的。政府对本发明具有一定权利。

技术领域

本公开涉及制备猪-人杂交胸腺及使用所述杂交胸腺在异种移植中诱导耐受性。

背景技术

目前，同种异体供体的严重短缺限制了进行器官移植的数量。可通过使用来自其他物种的器官(异种移植物)来纠正此供需差距。鉴于与使用非人灵长类动物相关的伦理问题和不切实际，猪被认为是最适合人的供体物种。除了与人的器官大小和生理相似性之外，猪快速繁殖和近亲繁殖的能力使它们特别适合进行能够提高其作为人移植供体的能力的遗传修饰。Sachs,Path.Biol.42:217-219,1994；Piedrahita等人,Am.J.Transplant,4增刊6:43-50,2004。

尽管有最新进展，但对异种移植物的免疫反应仍然很强，限制了它们的临床应用。虽然移植与非特异性免疫抑制疗法结合存在高的早期移植物耐受性，但临床器官移植成功的主要限制因素是晚期移植物丢失，这主要是由于移植物的慢性排斥。此外，免疫抑制疗法通常带有不良副作用或增加感染风险。因此，控制对异种移植物的免疫反应的方法将大大提高其适用性。

缺乏Gal基因的基因工程猪避免了由于抗Galα1-3Gal(Gal)天然抗体而在非人灵长类动物中的常见排斥。Cooper D.A brief history of cross-species organtransplantation.Proc(Bayl Univ Med Cent).2012年1月；25(1):49–57。尽管取得了此进步，但T细胞依赖性抗体仍可识别引起排斥的其他猪特异性。Yang YG,SykesM.Xenotransplantation:current status and a perspective on the future.Nat RevImmunol.2007年7月；7(7):519-31。在非人灵长类动物中，T细胞抑制延长猪异种移植物的存活时间，但此类治疗具有很高的毒性。Yamada K,Sykes M,Sachs DH.Tolerance inxenotransplantation.Curr Opin Organ Transplant.2017年12月；22(6):522-528。

T细胞抑制的替代方法是诱导耐受性。异种移植物耐受性方法包括混合嵌合(mixed chimerism)诱导和猪胸腺移植。

混合嵌合可在受体中T细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞水平上诱导对供体的耐受性。Griesemer A.,Yamada K.和Sykes M.,Xenotransplantation:Immunological hurdlesand progress toward tolerance,Immunol.Rev.2014；258(1):241–258。Sachs D.H.,Kawai T.和Sykes M.,Cold Spring Harb.Perspect.Med.2014；4:a015529。

胸腺异种移植也可诱导强大的耐受性。Kalscheuer H,Onoe T,Dahmani A,Li HW,

然而，其余的限制还包括不能高效识别外来抗原的次优受体免疫功能；自身反应性T细胞的次优存活、体内稳态和低效去除；以及防止自身免疫的调节性T细胞阳性选择的缺乏。

发明内容

本公开提供了一种在第一物种的受体哺乳动物中诱导对从第二物种的供体哺乳动物获得的移植物的耐受性的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将杂交胸腺组织引入到受体哺乳动物中，其中杂交胸腺组织是来自第二物种的胸腺组织，并且包含来自第一物种的胸腺上皮细胞；以及

(b)将来自供体哺乳动物的移植物植入受体哺乳动物中。

在一些实施方案中，在进行步骤(a)之前，受体哺乳动物中基本上没有胸腺功能。在一些实施方案中，受体哺乳动物是灵长类动物，并且在一些实施方案中，它是人。在一些实施方案中，供体哺乳动物是猪，并且在一些实施方案中，它是小型猪。

在一些实施方案中，来自供体哺乳动物的胸腺组织是胎儿胸腺组织。在一些实施方案中，来自供体哺乳动物的胸腺组织是新生儿胸腺组织。

在一些实施方案中，来自受体哺乳动物的胸腺上皮细胞从受体哺乳动物的胸腺获得。在一些实施方案中，来自受体哺乳动物的胸腺上皮细胞由受体哺乳动物的诱导性多能干细胞(iPSC)产生。在一些实施方案中，来自受体哺乳动物物种的胸腺上皮细胞由与受体哺乳动物共享HLA等位基因的胚胎干细胞产生。在一些实施方案中，胚胎干细胞被基因工程改造以与受体哺乳动物共享HLA等位基因。

在一些实施方案中，在步骤(a)中，将杂交胸腺组织植入受体哺乳动物中。在一些实施方案中，步骤(a)在步骤(b)之前进行或与步骤(b)同时进行。

在一些实施方案中，杂交胸腺组织是通过将来自受体哺乳动物的胸腺上皮细胞引入到来自供体哺乳动物的胸腺组织中来产生的。在一些实施方案中，杂交胸腺组织是通过将来自第一物种的受体哺乳动物的胸腺上皮细胞注射到来自第二物种的供体哺乳动物的胸腺组织中来产生的。在一些实施方案中，方法还包括向受体哺乳动物施用造血干细胞(HSC)。在一些实施方案中，移植物包含细胞、组织或器官。

在其他实施方案中，杂交胸腺组织通过包括以下步骤的方法产生：

(i)用2-脱氧葡萄糖(2DG)处理来自第二物种的供体哺乳动物的胸腺组织；以及

(ii)将来自第一物种的受体哺乳动物的胸腺上皮细胞引入到2DG处理的胸腺组织中。

在一些实施方案中，将来自第一物种的胸腺上皮细胞在注射到2DG处理的胸腺组织中之前悬浮在Matrigel中。

本公开还提供了一种恢复或诱导第一物种的受体哺乳动物的免疫能力的方法，所述方法包括将杂交胸腺组织引入到第一物种的受体哺乳动物中的步骤，其中杂交胸腺组织是来自第二物种的供体哺乳动物的胸腺组织，并且包含来自第一物种的胸腺上皮细胞。

本公开还提供了一种恢复或促进T细胞祖细胞在第一物种的受体哺乳动物中发育成成熟的功能性T细胞的胸腺依赖性能力的方法，所述方法包括将杂交胸腺组织引入到第一物种的受体哺乳动物中，其中杂交胸腺组织是来自第二物种的供体哺乳动物的胸腺组织，并且包含来自第一物种的胸腺上皮细胞。

在这些方法的一些实施方案中，在引入步骤之前，受体哺乳动物中基本上没有胸腺功能。在一些实施方案中，在引入步骤之前对受体哺乳动物进行胸腺切除。在一些实施方案中，受体哺乳动物患有免疫病症。

在一些实施方案中，供体哺乳动物是猪，并且在一些实施方案中，猪是小型猪。在一些实施方案中，受体哺乳动物是灵长类动物。在一些实施方案中，受体哺乳动物是人。

在一些实施方案中，来自供体哺乳动物的胸腺组织是胎儿胸腺组织。在一些实施方案中，来自供体哺乳动物的胸腺组织是新生儿胸腺组织。

在一些实施方案中，胸腺上皮细胞从受体哺乳动物的胸腺获得。在一些实施方案中，胸腺上皮细胞由受体哺乳动物的诱导性多能干细胞(iPSC)产生。在一些实施方案中，胸腺上皮细胞由与受体哺乳动物共享HLA等位基因的胚胎干细胞产生。在一些实施方案中，胚胎干细胞被基因工程改造以与受体哺乳动物共享HLA等位基因。

在一些实施方案中，杂交胸腺组织被植入受体哺乳动物中。

在一些实施方案中，杂交胸腺组织是通过将来自第一物种的胸腺上皮细胞引入到来自第二物种的供体哺乳动物的胸腺组织中来产生的。在一些实施方案中，杂交胸腺组织是通过将来自第一物种的胸腺上皮细胞注射到来自第二物种的供体哺乳动物的胸腺组织中来产生的。

在一些实施方案中，杂交胸腺组织通过包括以下步骤的方法产生：

(i)用2-脱氧葡萄糖(2DG)处理来自第二物种的供体哺乳动物的胸腺组织；以及

(ii)将来自第一物种的胸腺上皮细胞引入到2DG处理的胸腺组织中。

在一些实施方案中，将来自第一物种的胸腺上皮细胞在注射到2DG处理的胸腺组织中之前悬浮在Matrigel中。

本公开还提供了一种分离的杂交胸腺组织，所述分离的杂交胸腺组织包含来自第一哺乳动物物种的胸腺上皮细胞和来自第二哺乳动物物种的胸腺组织；以及一种制备杂交胸腺组织的方法。

在一些实施方案中，第二哺乳动物物种是猪，并且在一些实施方案中，猪是小型猪。在一些实施方案中，第一哺乳动物物种是灵长类动物。在一些实施方案中，受体哺乳动物是人。

在一些实施方案中，来自第二哺乳动物物种的胸腺组织是胎儿胸腺组织。在一些实施方案中，来自第二哺乳动物物种的胸腺组织是新生儿胸腺组织。

在一些实施方案中，胸腺上皮细胞从来自第一哺乳动物物种的胸腺获得。在一些实施方案中，来自第一哺乳动物物种的胸腺上皮细胞从胎儿胸腺组织获得。在一些实施方案中，来自第一哺乳动物物种的胸腺上皮细胞从新生儿胸腺组织获得。在一些实施方案中，胸腺上皮细胞由来自第一哺乳动物物种的诱导性多能干细胞(iPSC)产生。在一些实施方案中，胸腺上皮细胞由与第一哺乳动物物种共享HLA等位基因的胚胎干细胞产生。在一些实施方案中，胚胎干细胞被基因工程改造以与第一哺乳动物物种共享HLA等位基因。

本公开还提供了一种分离的杂交胸腺组织，所述分离的杂交胸腺组织包含来自第一哺乳动物物种的胸腺上皮细胞和来自第二哺乳动物物种的胸腺组织；以及一种制备杂交胸腺组织的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)用2-脱氧葡萄糖(2DG)处理来自第二哺乳动物物种的胸腺组织；以及

(ii)将来自第一哺乳动物物种的胸腺上皮细胞引入到2DG处理的胸腺组织中。

在一些实施方案中，将来自第一哺乳动物物种的胸腺上皮细胞在注射到2DG处理的胸腺组织中之前悬浮在Matrigel中。

附图说明

出于说明本发明的目的，在附图中描绘了本发明的某些实施方案。然而，本发明不限于附图中描绘的实施方案的精确布置和手段。

图1.人/猪杂交胸腺的产生。在移植后12至20周，对用杂交猪/人胸腺和人CD34+细胞产生的人源化小鼠施以安乐死，并且将移植的胸腺取出、切片并染色，以使用双光子共聚焦显微镜检测人TEC。图1A、图1B和图1C示出了未注射的移植猪胸腺(图1A)、注射有人胎儿胸腺间质细胞(胎龄为20周)(图1B)和注射有儿科人胸腺间质细胞(来自4个月大的胸腺)(图1C)的图像。B和C中的箭头指向CK14+HLA-DR+细胞，其代表猪胸腺内的人TEC。图1A至图1C所示的全部切片的定量分析在图1D中示出。定量分析还包括人胎儿和儿科胸腺以及猪胸腺的另外对照。通过lmarisColoc软件进行分析，所述软件允许计算全部胸腺切片中的所有CK14+细胞之中CK14+HLA-DR+细胞的共定位。条形图顶部显示的数字是CK14+细胞中CK14+HLA-DR+细胞的百分比。图1E和图1F示出了扩增的人胸腺间充质细胞(TMC)(图1E)和TEC(图1F)的代表性图像，所述细胞在用释放酶消化17岁的儿科胸腺后，在3-D Matrigel培养系统上从huCD45耗竭的人胸腺细胞培养3周。图1G和图1H分别示出了扩增的TMC和TEC的代表性流式细胞仪表征。CD105-CD326+被视为TEC，而CD105+CD326-细胞被视为TMC。

图2.在通过将人胸腺间质细胞(来自胎儿胸腺)(TEC)注射到猪胸腺中而产生的杂交胸腺中检测到CK14+HLA-DR+细胞。图2A：不注射人TEC。图2B：注射人TEC。图2C：注射2-DG处理的猪胸腺+人胎儿TEC。

图3.示出用于产生杂交胸腺的方法发展的结果。图3A示出了流式细胞术结果，其显示将细胞注射到猪胎儿胸腺碎片中后释放的细胞数。将PBMC细胞重悬于Matrigel中，以防止它们在注射后从猪胸腺中漏出来。使用三种不同的方法来将细胞注射到解冻的猪胎儿胸腺碎片中。方法A：使用Hamilton注射器进行注射，同时将小片放置在V形底96孔板的孔内。方法B：使用PE50管材进行注射。方法C：使用Hamilton注射器进行注射，同时将小片用镊子保持在孔的外部，直到Matrigel固化为止。通过流式细胞术确定释放的细胞数以追踪CFSE染色的注射PBMC。图3B和图3C示出了各种试剂耗减离体猪胸腺碎片中的胸腺细胞的结果。图3B是用每种试剂处理的细胞的总活细胞计数(顶图)和用每种试剂处理的细胞的活细胞百分比(底图)的图。图3C是含有间质细胞的在双阴性(DN)细胞上剩余的活双阳性CD4和CD8细胞(DP)或单阳性(SP)CD4(SP-CD4)或SP-CD8细胞的比率用作读数的图。用2DG 100nM处理12小时导致最低的比率，并且因此是在保留间质细胞的同时去除胸腺细胞的最佳策略。

图4示出了用于制备杂交胸腺并将杂交胸腺移植到受体小鼠中的实验方案。

图5示出了以下杂交胸腺移植后的人免疫细胞重建水平的图：用2DG处理且注射有人胸腺间质细胞的胎猪胸腺(由图上的圆形表示)、未用2DG处理且注射有人胸腺间质细胞的胎猪胸腺(由图上的正方形表示)和用2DG处理且未注射人胸腺间质细胞的胎猪胸腺(由图上的三角形表示)。图5A示出了白细胞内hCD45+的百分比。图5B示出了hCD45+中CD3+细胞的百分比。图5C示出了每μl血液中的hCD45+细胞计数。图5D示出了每μl血液中的hCD3+细胞计数。图5E示出了hCD3+中CD4+细胞的百分比。图5F示出了每μl血液中的hCD4+细胞计数。图5G示出了hCD45+中CD19+细胞的百分比。图5H示出了hCD45+中CD14+细胞的百分比。图5I示出了每μl血液中的hCD19+细胞计数。图5J示出了每μl血液中的hCD14+细胞计数。图5K示出了hCD3+中幼稚细胞的百分比。图5L示出了hCD3+中效应记忆细胞的百分比。

图6示出了在移植的胸腺中注射的与猪TEC混合的人TEC的检测图像。左侧显示移植到人源化小鼠中的未注射的猪胸腺，并且右侧显示移植到人源化小鼠中的杂交胸腺。

图7示出了体外T细胞增殖结果的图，其表明具有杂交胸腺的小鼠外周T细胞对人TEC供体部分耐受。图7A示出了具有各种移植胸腺的小鼠对猪树突状细胞的T细胞增殖反应。图7B示出了具有各种移植胸腺的小鼠对人猪树突状细胞的T细胞增殖反应。未注射人胸腺间质细胞的胎猪胸腺由圆形表示，注射有人胸腺间质细胞且没有用2DG处理的胎猪胸腺由正方形表示，并且注射有用2DG处理的人胸腺间质细胞的胎猪胸腺由三角形表示。

图8示出了与在人胸腺(HU/HU小鼠)中发育的人T细胞相比，在猪胸腺(SW/HU小鼠)中发育的人T细胞对人组织限制性抗原(TRA)(MART-1、NYESO1和胰岛抗原IA-2)的反应性增强。图8A是小鼠模型的示意图。图8B是显示来自小鼠的人外周T细胞(移植后18周)对人HSC供体DC呈递的人TRA(IA-2、MART-1和NYESO1)的增殖反应的图。

图9显示与在人胸腺(HU/HU小鼠)中发育的人Treg和CD8 T细胞相比，在猪胸腺(SW/HU小鼠)中发育的人Treg和CD8 T细胞的存活率较低。图9是显示与SW/HU小鼠相比，HU/HU小鼠中移植的胸腺细胞中的各种细胞以及与SW/HU小鼠相比，HU/HU小鼠中脾/淋巴结中的各种细胞的图。HU/HU小鼠数显示为圆形，SW/HU小鼠数显示为正方形。图9A示出了移植的胸腺中的总胸腺细胞计数。图9B示出了移植的胸腺中胸腺细胞亚群的百分比。图9C示出了移植的胸腺中SP-CD4+中的Treg百分比。图9D示出了移植的胸腺中Ki67+细胞的百分比。图9E示出了移植的胸腺中CD45RO+细胞的百分比。图9F示出了移植的胸腺中CTLA-4+细胞的百分比。图9G示出了每个小鼠亚群中脾和淋巴结(LN)中的总细胞计数。图9H示出了每个小鼠亚群中脾和淋巴结(LN)中的hCD45+细胞的百分比。图9I示出了每个小鼠亚群中脾和淋巴结(LN)中的hCD45+中T细胞的百分比。图9J示出了每个小鼠亚群中脾和淋巴结(LN)中的T细胞中CD4和CD8细胞的百分比。图9K示出了每个小鼠亚群中脾和淋巴结(LN)中的CD4+中Treg的百分比。图9L示出了每个小鼠亚群中脾和淋巴结(LN)中的幼稚细胞的百分比。图9M示出了每个小鼠亚群中脾和淋巴结(LN)中的EM细胞的百分比。图9N示出了每个小鼠亚群中脾和淋巴结(LN)中的HLA-DR+细胞的百分比。图9O示出了每个小鼠亚群中脾和淋巴结(LN)中的Ki67+细胞的百分比。图9P示出了每个小鼠亚群中脾和淋巴结(LN)中的hCD45RO+的百分比。图9Q示出了每个小鼠亚群中脾和淋巴结(LN)中的CTLA-4+的百分比。

图10示出了人TEC在“杂交胸腺”中的长期(大于20周)持久性。图10A是移植的猪胸腺的图像，包括未注射人TEC的猪胸腺(SW THY，左上图)、注射有人胎儿TEC的猪胸腺(SW/胎儿hu-TES THY，右上图)、注射有人儿科TEC的猪胸腺(SW/儿科hu-TEC THY，左下图)和注射有人hPSC的猪胸腺(SW/hPSC-TEC THY，右下图)。图10B是来自各种长期胸腺移植物的消化间质中门控CD45阴性细胞的代表性流式细胞术染色，显示EPCAM+、CD105阴性hu-TEC仅存在于人胸腺(右上)和注射有hPSC-TEC祖细胞的SW移植物(左下图)中，但不存在于未注射的SWTHY移植物(左上)中。图10C是来自接受注射人ES-TEC的SW胸腺与未注射的SW胸腺的多只小鼠的CD45-HLA-ABC+EpCAM+(注射的人TEC)的百分比的定量图。

图11显示，将hES-TEC注射到猪胸腺中促进T细胞发育增加和外周CD4

具体实施方式

SW- 猪

HU- 人

TEC- 胸腺上皮细胞

TMC- 胸腺间充质细胞

WBC- 白细胞

DP- 双阳性细胞(CD4+，CD8+)

SP- 单阳性细胞(CD4+或CD8+)

Treg- 调节性T细胞

LN- 淋巴结

TRA- 组织限制性抗原

2DG- 2D葡萄糖

MACS- 磁激活细胞分选

HSC- 人造血细胞

本公开提供了一种产生人/猪杂交胸腺以实现对猪抗原的免疫耐受性以及所产生的人T细胞库的最佳免疫功能的方法。方法通过改善猪胸腺中人T细胞的功能和自身耐受性，同时允许发展对猪异种移植物的耐受性，克服了使用单纯猪胸腺时遇到的局限性。

本发明方法产生含有患者特异性胸腺上皮细胞(TEC)的杂交猪-人胸腺。患者特异性TEC可直接从患者的胸腺中获得、从患者特异性诱导的多能干细胞产生、或从与患者天然或人工共享人白细胞抗原(HLA)等位基因的胚胎干细胞产生。患者特异性TEC可参与阳性选择，从而导致产生更容易识别外周中受体HLA分子呈递的外来抗原的T细胞。另外，由于许多组织特异性抗原(TSA)在人与猪之间不同，因此在胸腺中添加人TEC来制造人TSA有助于确保免受自身免疫。因此，使用杂交胸腺代替猪胸腺可改善所产生的人T细胞库的功能和自身耐受性，并使得能够诱导异种移植物耐受性。

本发明的杂交胸腺/胸腺组织(例如，杂交猪-人胸腺/胸腺组织)也可用于缺乏适当胸腺功能或具有T细胞免疫缺陷(例如成人胸腺衰老)的患者的免疫重建。杂交胸腺/胸腺组织(例如，杂交猪-人胸腺/胸腺组织)的应用包括用于药理学和药物筛选的异种模型、医学异种移植物耐受性测试和制备以及对在移植或免疫病症治疗期间使用的可引起免疫原性的治疗分子(例如mAb)的耐受性诱导。

如本文所用，杂交胸腺组织是指来自第二物种的供体哺乳动物的胸腺组织，并且包含来自第一物种的受体哺乳动物的胸腺上皮细胞。

在一个实施方案中，构建了杂交胸腺/胸腺组织，其中猪胸腺/胸腺组织(例如，胎儿胸腺/胸腺组织)含有从人的胸腺/胸腺组织(例如，患者的胸腺/胸腺组织)获得的人(例如患者特异性)胸腺上皮细胞(TEC)。在另一个实施方案中，构建了杂交胸腺/胸腺组织，其中猪胸腺/胸腺组织(例如，胎儿胸腺/胸腺组织)含有由人(例如患者特异性)诱导的多能干细胞产生的人(例如患者特异性)TEC。在另一个实施方案中，构建了杂交胸腺/胸腺组织，其中猪胸腺/胸腺组织(例如，胎儿胸腺/胸腺组织)含有由与患者天然地共享HLA等位基因或已被工程改造成这样的胚胎干细胞产生的人TEC。

在猪胸腺移植物中包含人TEC可具有对抗原识别的功能性作用。

本公开提供了一种在第一物种的受体哺乳动物中诱导对从第二物种的供体哺乳动物获得的移植物的耐受性的方法。方法可包括以下步骤：(a)将杂交胸腺组织引入到受体哺乳动物中，其中杂交胸腺组织是来自第二物种的胸腺组织，并且包含来自第一物种的胸腺上皮细胞；以及(b)将来自供体哺乳动物的移植物植入受体哺乳动物中。供体可为包括小型猪的猪。受体可为人。

本公开还提供了一种产生灵长类动物-猪杂交胸腺/胸腺组织以实现对猪抗原的免疫耐受性以及所产生的灵长类动物T细胞库的最佳免疫功能的方法。本公开的一个实施方案提供了一种猪到狒狒中的杂交胸腺/胸腺组织。

杂交胸腺/胸腺组织可作为主要血管化的胸腺叶或复合胸腺-肾移植物被植入。

杂交胸腺/胸腺组织可经肌肉内移植到受体中。杂交胸腺/胸腺组织可移植到单独的股四头肌中，或移植到股四头肌与受体的其他移植部位(例如，肾囊和大网膜)中。Wu等人,Xenogeneic Thymus Transplantation in A Pig-to-baboon Model,Transplantation,2003,75(3):282-291。

异种移植的受体是第一哺乳动物物种的哺乳动物。异种移植的供体是指第二哺乳动物物种的哺乳动物。供体哺乳动物是异种移植的细胞、组织和/或器官的供体。

本公开提供了一种在第一物种的受体哺乳动物中诱导对从第二物种的供体哺乳动物获得的移植物的耐受性的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将杂交胸腺组织引入到受体哺乳动物中，其中杂交胸腺组织是来自第二物种的胸腺组织，并且包含来自第一物种的胸腺上皮细胞；以及(b)将来自供体哺乳动物的移植物植入受体哺乳动物中。步骤(a)可在步骤(b)之前进行或与步骤(b)同时进行。

本公开还提供了一种恢复或诱导第一物种的受体哺乳动物的免疫能力的方法，所述方法包括将杂交胸腺组织引入到受体哺乳动物中的步骤，其中杂交胸腺组织是来自第二物种的供体哺乳动物的胸腺组织，并且包含来自第一物种的胸腺上皮细胞。

本公开还涵盖一种恢复或促进T细胞祖细胞在第一物种的受体哺乳动物中发育成成熟的功能性T细胞的胸腺依赖性能力的方法，所述方法包括将杂交胸腺组织引入到受体哺乳动物中，其中杂交胸腺组织是来自第二物种的供体哺乳动物的胸腺组织，并且包含来自第一物种的胸腺上皮细胞。

在一个实施方案中，在引入杂交胸腺组织之前，受体哺乳动物中基本上没有胸腺功能。在另一个实施方案中，在引入杂交胸腺组织之前对受体哺乳动物进行胸腺切除。在另一个实施方案中，受体哺乳动物患有免疫病症。

第二物种可为猪，诸如小型猪。

第一物种可为灵长类动物，诸如非人灵长类动物或人。

在一个实施方案中，受体哺乳动物为人，并且供体哺乳动物为小型猪。

来自第二物种的胸腺组织可为胎儿胸腺组织或新生儿胸腺组织。

来自第一物种的胸腺上皮细胞可从受体哺乳动物的胸腺获得。来自第一物种的胸腺上皮细胞可由受体哺乳动物的诱导性多能干细胞(iPSC)产生。来自第一物种的胸腺上皮细胞可由与受体哺乳动物共享HLA等位基因的胚胎干细胞产生。例如，胚胎干细胞可与受体哺乳动物天然地共享HLA等位基因或被基因工程改造以与受体哺乳动物共享HLA等位基因。

在一个实施方案中，将杂交胸腺组织植入受体哺乳动物中。例如，杂交胸腺组织可作为主要血管化的胸腺叶或复合胸腺-肾移植物被植入。

杂交胸腺组织可通过将来自第一物种的胸腺上皮细胞引入到来自第二物种的胸腺组织中来产生。杂交胸腺组织可通过将来自第一物种的胸腺上皮细胞注射到来自第二物种的胸腺组织中来产生。

杂交胸腺组织可通过包括以下步骤的方法产生：(i)用2-脱氧葡萄糖(2DG)处理来自第二物种的胸腺组织；以及(ii)将来自第一物种的胸腺上皮细胞引入到2DG处理的胸腺组织中。

在步骤(ii)中，可将胸腺上皮细胞在注射到2DG处理的胸腺组织中之前悬浮在生物材料诸如Matrigel中。

可将胸腺上皮细胞在注射到来自第二物种的胸腺组织中之前悬浮在生物材料(诸如Matrigel)中。

在一些实施方案中，在将来自第一物种的胸腺上皮细胞引入到来自第二物种的胸腺组织中之前，可将其与生物材料组合(例如，悬浮在其中)。生物材料可为溶胶-凝胶、载有蛋白质的水凝胶、Matrigel、具有细胞的人工构建的支架及其组合。生物材料的非限制性实例还可包括聚乙烯亚胺和硫酸葡聚糖、聚(乙烯基硅氧烷)共聚物聚乙烯亚胺(poly(vinylsiloxane)ecopolymerepolyethyleneimine)、磷酸胆碱、聚(乙二醇)、聚(乳酸-乙醇酸)、聚(乳酸)、聚羟基戊酸酯和共聚物、聚羟基丁酸酯和共聚物、聚对二氧环己酮(polydiaxanone)、聚酸酐、聚(氨基酸)、聚(原酸酯)、聚酯、胶原蛋白、明胶、纤维素聚合物、壳聚糖、海藻酸盐、纤连蛋白、细胞外基质蛋白、粘着斑蛋白(vinculin)、琼脂、琼脂糖、透明质酸、基质胶(matrigel)及其组合。

本发明方法还可包括将造血干细胞(HSC)施用于受体哺乳动物。

移植物可包含细胞、组织或器官。在一个实施方案中，移植物包含造血干细胞。在另一个实施方案中，移植物包含骨髓。在另一个实施方案中，移植物包含心脏、肾脏、肝脏、胰腺、肺、肠、皮肤、小肠、气管、角膜或其组合。

本公开提供了一种分离的杂交胸腺组织，所述分离的杂交胸腺组织包含来自第一哺乳动物物种的胸腺上皮细胞和来自第二哺乳动物物种的胸腺组织。

已经开发出替代方法来实现对高度不同的异种供体的中央T细胞耐受性，所述异种供体涉及将猪胸腺移植到具有免疫能力的、T细胞耗竭且经胸腺切除的受体上。这些研究是在小鼠中开始的，所述小鼠在体外表现出明显且特异性的无反应，以及延长了供体特异性皮肤移植物的存活时间。Lee LA,Gritsch HA,Sergio JJ等人Specific toleranceacross a discordant xenogeneic transplantationbarrier.ProcNatlAcadSciUSA.1994；91:10864-10867。Zhao Y,Swenson K,Sergio JJ,ArnJS,Sachs DH,Sykes M.Skin graft tolerance across a discordant xenogeneicbarrier.Nature Med.1996；2:1211-1216。鼠模型允许对异种胸腺移植物中T细胞重建所赋予的耐受性和免疫功能的机制进行广泛研究。胸腺内克隆缺失是使新发育的胸腺细胞对异种供体和受体耐受的主要机制。Zhao Y,Sergio JJ,Swenson KA,Arn JS,Sachs DH,SykesM.Positive and negative selection of functional mouse CD4 cells by porcineMHC in pig thymus grafts.J Immunol.1997；159:2100-2107。Zhao Y,Rodriguez-Barbosa JI,Shimizu A,Swenson K,Sachs DH,Sykes M.Despite efficient intrathymicnegative selection of host-reactive T cells,autoimmune disease may develop inporcine thymus-grafted athymic mice:Evidence for failure of regulatorymechanisms suppressing autoimmunity.Transplantation.2002；75:1832-1840。另外的研究涉及了猪胸腺移植物中发育的抑制残余小鼠抗猪反应的Treg。Zhao等人Theinduction of specific pig skin graft tolerance by grafting with neonatal pigthymus in thymectomized mice.Transplantation.2000；69:1447-1451。Rodriguez-Barbosa等人Enhanced CD4 reconstitution by grafting neonatal porcine tissue inalternative locations is associated with donor-specific tolerance andsuppression of pre-existing xenoreactive T cells.Transplantation.2001；72:1223-1231。使用具有不同的MHC单倍型和先前已鉴定出阳性和阴性选择鼠MHC等位基因的T细胞受体(TCR)的TCR转基因受体小鼠，证明猪胸腺移植物中的阳性选择仅由猪胸腺MHC介导，其中没有来自鼠造血细胞的贡献，而阴性选择由猪和小鼠MHC介导，这与来自供体猪胸腺移植物中两种物种的II类MHC+APC的存在一致。Zhao Y,Rodriguez-Barbosa JI,Zhao G,Shaffer J,Arn JS,Sykes M.Maturation and function of mouse T cells with atransgeneic TCR positively selected by highly disparate xenogeneic porcineMHC.Cell Mol Biol.2000；47:217-228。Zhao Y,Swenson K,Sergio JJ,Sykes M.Pig MHCmediates positive selection of mouse CD4+ T cells with a mouse MHC-restrictedTCR in pig thymus grafts.J Immunol.1998；161:1320-1326。值得注意的是，尽管缺乏鼠MHC参与阳性选择，并且猪胸腺和鼠受体的MHC完全不同，但这些T细胞能够对鼠MHC分子呈递的蛋白抗原的免疫产生反应，并且最重要的是保护小鼠免于其清除依赖于CD4+ T细胞的机会性病原体。Zhao等人Immune restoration by fetal pig thymus grafts in T cell-depleted,thymectomized mice.J Immunol.1997；158:1641-1649。这些结果被解释为表明，如果在异种胸腺移植物中选择多样化T细胞库，则可发生足以识别受体MHC上的外来抗原的交叉反应。

已将针对耐受性的猪胸腺移植方法扩展到人源化小鼠模型，以提供人T细胞可正常发育并且对猪胸腺移植物中的猪异种抗原具有中央耐受的原理论证(proof-of-principle)。Nikolic B,Gardner JP,Scadden DT,Arn JS,Sachs DH,Sykes M.Normaldevelopment in porcine thymus grafts and specific tolerance of human T cellsto porcine donor MHC.J Immunol.1999；162:3402-3407。Kalscheuer HO,T.；Dahmani,A.；Li,H.；Holzl,M.；Yamada,K.；Sykes,M.Xenograft tolerance and immune functionof human T cell developing in pig thymus xenografts.J Immunology.2014；192(7):3442-3450。在猪胸腺移植物中发育的胸腺和外周人T细胞对供体猪均显示出特异性无反应，其中在混合淋巴细胞反应(MLR)中对第三方猪和同种异体人的反应完整。这些T细胞还显示出在MLR中对人造血干细胞(HSC)供体和鼠受体无反应，反映出在胸腺异种移植物中检测到的人供体APC和鼠APC对阴性选择的贡献。Kalscheuer等人A model for personalizedin vivo analysis of human immune responsiveness.Science TranslationalMedicine.2012；4(125):125ra130。重要的是，观察到在猪胸腺移植物中发育的人T细胞的供体特异性皮肤移植物耐受性。

基于鼠模型的结果，针对耐受性的胸腺异种移植方法已扩展到大型动物猪到狒狒物种的组合。与对照相比，使用放置在狒狒的肾囊下的猪胸腺碎片的初步研究展现出一些T细胞恢复、体外供体特异性低反应性和延长的供体皮肤移植物存活时间。然而，被植入并血管化的猪胸腺组织的量非常有限。Wu等人Xenogeneic thymus transplantation in apig-to-baboon model.Transplantation.2003；75(3):282-291。为了实现更稳健的胸腺功能，并且鉴于上述鼠数据，预期可能需要在猪胸腺中发育的供体特异性Treg来抑制预处理方案未耗竭的预先存在的T细胞，随后的研究利用了主要血管化的猪胸腺，这在同种异体猪肾移植模型中已显示出诱导耐受性的功效。Yamada K,Shimizu A,Utsugi R等人Thymictransplantation in minature swine.II.Induction of tolerance bytransplantation of composite thymokidneys to thymectomized recipients.JImmunol.2000；164:3079-3086。通过将自体胸腺碎片放置在猪的肾囊下或通过猪胸腺叶在狒狒中的直接血管吻合，将胸腺作为几个月前在供体猪中制备的复合“胸腺肾”移植物的一部分进行移植。Yamada K,Yazawa K,Shimizu A等人Marked prolongation of porcinerenal xenograft survival in baboons through the use of alpha1,3-galactosyltransferase gene-knockout donors and the cotransplantation ofvascularized thymic tissue.Nature medicine.2005；11(1):32-34。两种方法都首次导致狒狒中GalT基因敲除猪肾脏的长期存活。Tasaki等人,Rituximab treatment preventsthe early development of proteinuria following pig-to-baboon xeno-kidneytransplantation.Journal of the American Society of Nephrology:JASN.2014；25(4):737-744。接受此治疗的动物的存活时间受到抗CD40L血栓性并发症和由于微小病变肾病(如肾小球病)引起的蛋白尿的限制，这可以通过使用非血栓形成性抗CD40以及分别施用利妥昔单抗(rituximab)和CTLA4Ig来避免。Yamada等人,Xenotransplantation:Where AreWe with Potential Kidney Recipients？Recent Progress and Potential FutureClinical Trials.Curr Transplant Rep.2017；4(2):101-109。

接受猪胸腺肾移植物的狒狒已显示出猪胸腺移植物中从头受体(狒狒)胸腺生成的证据、外周中新近胸腺迁出细胞的出现及Elispot和MLR测定中的供体特异性无反应、以及非Gal天然抗体的下降。Tanabe等人Role of Intrinsic(Graft)Versus Extrinsic(Host)Factors in the Growth of Transplanted Organs Following Allogeneic andXenogeneic Transplantation,Am J Transplant.2017年7月；17(7):1778-1790。虽然后者可能反映猪肾脏的吸收，但是在这些异种移植物上检测到最小的IgM结合，其中没有补体固定或明显的病理。因此，用此模型获得的结果证明了复合胸腺-肾异种移植物在灵长类动物中诱导耐受性的潜力。

在异种猪胸腺中产生人T细胞库的局限性包括优先识别猪MHC上的微生物抗原，这将有助于保护移植物，但不能优化针对感染宿主的微生物病原体的保护，以及无法阴性选择常规T细胞和阳性选择识别人组织限制性抗原(TRA)的Treg。事实上，对人源化小鼠的研究表明，当人T细胞在猪而非人胸腺移植物中发育时，人APC在免疫后呈现的对肽的反应降低。

克服此局限性的方法涉及创建“杂交胸腺”，其中将从胸腺切除标本获得或从干细胞产生的受体胸腺上皮细胞注射到猪胸腺组织中。已经从出生后的胸腺供体中产生了杂交胸腺，其中杂交胸腺促进了人T细胞之中对人TRA的耐受性。

已证明猪胸腺移植物支持正常的多样化鼠或人T细胞库的发育，并且这些T细胞对异种猪供体是特异性耐受的。然而，识别外周中受体HLA分子呈递的外来抗原是次优的。因此，免疫功能可能不是最佳的。如本文所示，这可以通过在猪-人杂交胸腺移植物中提供受体TEC来克服，因为这些TEC将参与阳性选择，从而导致产生能够更容易地识别外周中受体HLA分子呈递的外来抗原的T细胞。对于猪胸腺移植物，在外周中未找到“阳性选择”配体的T细胞的存活、体内稳态和功能是次优的。阳性选择配体是TEC上的MHC/肽复合物，当胸腺细胞具有识别此复合物的低亲和力T细胞受体时，所述TEC可将胸腺细胞从程序性细胞死亡中拯救出来。在猪-人杂交胸腺中提供受体TEC允许对将在外周中受体细胞上找到相同配体的T细胞进行阳性选择，从而赋予正常的存活、体内稳态和功能。对于猪胸腺移植物，TEC产生以其他方式仅在外周中非常特定的组织中表达的抗原(即，组织特异性抗原TSA)。TEC对TSA的此表达的两个重要结果是：a)强烈识别TSA的胸腺细胞的克隆缺失，从而将这些自身反应性T细胞从库中去除；b)识别TSA的调节性T细胞的阳性选择，从而添加防止外周中自身免疫的安全网。由于许多TSA在人与猪之间不同，因此在猪-人杂交胸腺移植物中添加人TEC来制造人TSA将有助于确保免受自身免疫。

综上所述，使用杂交胸腺代替单纯的猪胸腺可改善在猪胸腺中产生的人T细胞库的功能和自身耐受性，同时允许发展对猪的耐受性。

在一个实施方案中，对受体进行胸腺切除。在另一个实施方案中，不对受体进行胸腺切除。在另一个实施方案中，受体由于年龄而具有低的胸腺生成率。在另一个实施方案中，受体具有衰老胸腺。

使用本发明的杂交胸腺/胸腺组织的胸腺异种移植可能与混合嵌合诱导组合或可能不与混合嵌合诱导组合。例如，当将胸腺异种移植与混合嵌合诱导与持久的猪-人嵌合组合时，猪和人APC都将存在于天然人胸腺和猪胸腺异种移植物中，从而确保了识别在造血细胞上表达的猪或人抗原的胸腺细胞的终身阴性选择。此外，识别猪或人TRA的常规T细胞将在相关物种的胸腺中缺失，并且由于相反物种的胸腺中的发育而逃避缺失的T细胞将被另一胸腺中发育的TRA特异性Treg充分抑制。混合猪嵌合将确保对识别未知异种靶的天然抗体的耐受性，并且也将使NK细胞耐受。

异种移植比来自已故人供体的同种异体移植更容易诱导耐受性，因为选择性地进行异种移植的能力允许在器官异种移植物之前应用耐受性方案(例如混合嵌合诱导)。在一个实施方案中，本发明方法涉及首先使受体的免疫系统耐受，确认已经实现耐受性，并随后在没有免疫抑制或免疫抑制疗程缩短的情况下进行器官移植。

本公开提供了一种在第一物种(例如，灵长类动物诸如人)的受体哺乳动物中诱导对从第二物种(例如猪)的哺乳动物获得的移植物的耐受性的方法。方法包括：在移植物的移植之前或同时，将杂交胸腺/胸腺组织引入到受体哺乳动物中；以及(任选地)将移植物植入受体中。杂交胸腺/胸腺组织通过诱导T细胞水平的免疫耐受性，使受体为随后的移植物做准备。

本公开提供了用于在受体中诱导异种移植物耐受性的方法，所述方法包括将杂交胸腺/胸腺组织引入到受体中的步骤。

在一个实施方案中，已经接受了杂交胸腺/胸腺组织的无胸腺、T细胞耗竭的受体的宿主T细胞可在杂交胸腺/胸腺组织中成熟。在植入的杂交胸腺/胸腺组织中成熟的宿主T细胞具有免疫能力。

本公开提供了一种恢复或诱导宿主或受体(例如，灵长类动物宿主或受体，例如人)中免疫能力(或恢复或促进T细胞祖细胞到成熟或发育成功能性成熟T细胞的胸腺依赖性能力)的方法，所述方法能够产生T细胞祖细胞但存在胸腺功能缺陷，并因此不能产生足够数量的成熟功能性T细胞用于正常免疫反应。方法包括将杂交胸腺/胸腺组织引入到受体中的步骤，使得宿主T细胞可在植入的杂交胸腺/胸腺组织中成熟。

在一个实施方案中，受体/宿主为灵长类动物，例如人，并且供体为猪，例如小型猪。

方法可包括促进对杂交胸腺/胸腺组织的接受或以其他方式优化所述方法的其他步骤。在某些实施方案中，向肝或脾组织，诸如胎儿或新生儿肝或脾组织中植入胸腺组织；向受体施用供体造血细胞(例如，脐带血干细胞或胎儿或新生儿肝或脾细胞)，例如腹膜内或静脉内施用胎儿肝细胞的悬浮液。可对受体进行胸腺切除，诸如在引入杂交胸腺/胸腺组织之前或引入杂交胸腺/胸腺组织之时。

在某些实施方案中，方法包括：(优选在将胸腺组织引入到受体中之前或引入到受体中之时)例如通过将能够结合受体的自然杀伤(NK)细胞的抗体引入到受体中来使受体NK细胞耗竭、失活或抑制受体NK细胞，以防止NK介导的胸腺组织排斥；(优选在将胸腺组织引入到受体中之前或引入到受体中之时)例如通过将能够结合受体的T细胞的抗体引入到受体中来使宿主T细胞功能耗竭、失活或抑制宿主T细胞功能；(优选在将胸腺组织引入到受体中之前或引入到受体中之时)例如通过将能够结合受体的CD4或CD4+细胞的抗体引入到受体中来使宿主CD4+细胞功能耗竭、失活或抑制宿主CD4+细胞功能。

某些实施方案包括(优选在胸腺组织或造血干细胞移植之前)例如通过以下中的一种或多种来创建造血空间的步骤：以低剂量(例如，约100拉德与400拉德之间)的全身照射来照射受体哺乳动物，施用骨髓抑制药物，或施用造血干细胞失活或耗竭抗体，以使受体的骨髓耗竭或部分耗竭(优选在胸腺组织移植之前)。

某些实施方案包括(优选在胸腺组织或造血干细胞移植之前)通过以下中的一种或多种使胸腺T细胞失活：用例如约700拉德的胸腺照射来照射宿主，向受体施用一个或多个剂量的抗T细胞抗体，例如抗CD4和/或抗CD8单克隆抗体，或向受体施用短疗程的免疫抑制剂。

某些实施方案包括例如通过以下中的一种或多种来使天然抗体耗竭或以其他方式失活：施用使天然抗体耗竭或失活的药物，例如脱氧精胍菌素(deoxyspergualin)；施用抗IgM抗体，或从宿主的血液中吸附天然抗体，例如通过使宿主的血液与供体抗原接触，例如通过对来自供体物种的供体器官(例如肾脏或肝脏)进行血液灌流。

其他方法可与本文公开的方法组合以促进受体对移植物的接受。例如，也可通过将表达供体抗原例如供体MHC基因的核酸插入受体的细胞(例如造血干细胞)中，并将基因工程细胞引入到受体中来诱导对胸腺组织的耐受性。例如，可对人受体干细胞工程改造以表达猪MHC基因，例如，猪I类或II类MHC基因或者I类和II类基因，并且将细胞植入将接受杂交胸腺组织的人受体中。当将供体MHC基因插入受体灵长类动物例如人体内时，供体MHC基因的表达导致对随后暴露于供体抗原具有耐受性，并且因此可诱导对胸腺组织的耐受性。

例如通过植入造血干细胞来诱导耐受性的方法也可与本文公开的方法组合。

诱导耐受性的其他方法也可用于促进对胸腺组织的接受。例如，已经发现可通过例如施用短疗程的高剂量免疫抑制剂例如环孢素来诱导的对辅助性T细胞的抑制可诱导耐受性。在这些方法中，仅在植入移植物之后相对短的时间内抑制辅助性T细胞，并且不需要或不包括慢性免疫抑制。

例如通过改变细胞因子活性水平或抑制移植物抗受体疾病来促进耐受性或促进对供体组织的接受的其他方法也可与本发明方法组合使用。

在另一方面，本公开提供了一种减少或抑制接收来自供体哺乳动物的移植物的受体哺乳动物(例如灵长类动物，例如人)中T细胞活性(优选胸腺或淋巴结T细胞活性)的方法。所述方法包括：诱导对移植物的耐受性；向受体施用足以使T细胞、优选胸腺或淋巴结T细胞失活的短疗程的免疫抑制剂，例如环孢素。

如本文所用，“胸腺功能缺陷”是指与正常个体相比，个体的胸腺支持T细胞成熟的能力受损的情况。胸腺缺陷情况包括基本上没有胸腺或胸腺功能的情况。

如本文所用，“耐受性”是指抑制或降低移植物受体产生例如对供体抗原的免疫反应的能力，所述免疫反应将例如响应于将非自身MHC抗原引入到受体中而以其他方式发生。耐受性可能涉及体液反应、细胞反应或体液和细胞反应。耐受性的概念包括完全耐受性和部分耐受性。换句话讲，如本文所用，耐受性包括对移植物受体产生例如对供体抗原的免疫反应的能力的任何程度的抑制。

如本文所用，“造血干细胞”是指能够发育成成熟的髓样和/或淋巴样细胞的细胞。优选地，造血干细胞能够长期重建造髓样和/或淋巴样谱系。可将源自受体或供体的脐带血的干细胞用于本公开的方法中。

如本文所用，“小型猪”是指完全或部分近交的小型猪。

如本文所用，“移植物”是指身体部位、器官、组织、细胞或其部分。

如本文所用，“间质组织”是指器官的支持组织或基质，如区别于其功能元件或实质。

如本文所用，恢复、诱导或促进免疫能力意指以下中的一种或两种：(1)通过增加受体成熟的功能性T细胞的数量或提供已在受体中成熟的成熟功能性供体-T细胞中的一者或两者来增加受体中成熟功能性T细胞的数量(超过在不使用本公开的方法进行治疗的情况下所看到的)；或(2)改善例如通过对回忆抗原产生皮肤反应的能力所测量的受体的免疫反应性，或改善例如通过体外测试所测量的受体的T细胞反应性，例如通过改善对抗原的增殖反应(例如对破伤风抗原或同种异体抗原的反应)。

如本文所用，恢复或诱导T细胞祖细胞成熟为成熟T细胞的胸腺依赖性能力意指以下中的一种或两种：增加受体中受体来源的功能性成熟T细胞的数量，或向受体提供成熟的功能性供体T细胞，这是通过提供T细胞可在其中成熟的供体胸腺组织来进行的。所述增加可为部分的，例如，不能使成熟功能性T细胞的水平上升到导致基本上正常的免疫反应的水平的增加，或可为部分的，例如，不足以使受体的成熟功能性T细胞的水平上升到导致基本上正常的免疫反应的水平的增加。

在某些实施方案中，使受体为器官移植或胸腺替换做准备包括以下步骤中的任何步骤或所有步骤。它们可按以下顺序进行。

首先，将马抗人胸腺细胞球蛋白(ATG)制剂静脉内注射到受体中。所述抗体制剂消除成熟T细胞和自然杀伤细胞。如果不消除，成熟T细胞可能促进对胸腺移植物及致敏后的异种移植物器官的排斥。ATG制剂还消除自然杀伤(NK)细胞。NK细胞可能对植入的器官没有影响，但可能立即起作用来排斥新引入的胸腺组织。也可使用从任何哺乳动物宿主获得的抗人ATG，例如在猪中产生的ATG，不过到目前为止，猪ATG的制剂具有比马源性ATG低的滴定度。ATG优于抗NK单克隆抗体，因为后者通常不能使所有宿主NK细胞裂解，而ATG中的多克隆混合物能够裂解所有宿主NK细胞。然而，可使用抗NK单克隆抗体。在相对严重的免疫低下的个体中，此步骤可能不是必需的。随着宿主(或供体)T细胞在异种胸腺中成熟，它们将是胸腺组织耐受的。替代地，随着宿主免疫系统的逐渐恢复，可能需要治疗宿主以诱导对胸腺组织的耐受性。

最佳地，可对受体进行胸腺切除。在经胸腺切除的受体中，受体T细胞没有机会在受体胸腺中分化，但必须在杂交胸腺组织中分化。在一些情况下，可能有必要对受体进行脾切除以避免贫血。

第二，可向受体施用低剂量辐射。虽然此步骤被认为对骨髓移植有益(通过为新注射的骨髓细胞创建造血空间)，但在不伴有骨髓移植的胸腺移植物中，此步骤不太重要。然而，可使用亚致死剂量，例如，约等于100拉德或大于100拉德且小于约400拉德的全身辐射加上700拉德的局部胸腺辐射的剂量。

第三，可从受体的血液中吸附天然抗体。抗体的去除可通过将受体的血液暴露于供体或供体物种抗原来完成，例如，通过对供体物种的肝脏进行血液灌流来吸附受体天然抗体。预先形成的天然抗体(nAb)是移植物排斥的主要剂。天然抗体与异种内皮细胞结合，并且主要属于IgM类。这些抗体不依赖于任何已知的对异种供体抗原的先前暴露。产生这些天然抗体的B细胞趋向于是T细胞非依赖性，并且通常在发育期间通过暴露于这些抗原而对自身抗原耐受。同样，至少在最初，相对严重的免疫低下的患者可能不需要此步骤。

将杂交胸腺组织植入受体中。可包括胎儿或新生儿的肝或脾组织。

这些程序中的一种或包括所有程序的任何组合可帮助植入的胸腺组织或另一种异种器官的存活。

本公开的方法可用于赋予对异种移植物的耐受性，例如其中移植物供体为非人动物，例如猪，例如小型猪，并且移植物受体为灵长类动物，例如人。

异种移植物的供体和提供诱导耐受性的胸腺组织的个体可为同一个体，或可以尽可能地密切相关。例如，优选从高度近交或完全近交的一群供体中获得异种移植物。

第二哺乳动物物种(即供体)可为非人哺乳动物物种，诸如猪物种(例如小型猪物种)或非人灵长类动物物种。第一哺乳动物物种的非限制性实例包括猪、啮齿动物、非人灵长类动物、牛、山羊和马。

在一个实施方案中，第二哺乳动物物种(即供体)是至少部分近交的小型猪(例如，猪在猪白细胞抗原(SLA)基因座处是纯合的，和/或在所有其他遗传基因座的至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多处是纯合的)。基因工程可在全部或部分近交的猪(例如小型猪、转基因猪等)中进行。例如，近交的马萨诸塞州综合医院(MGH)小型猪可用于本发明方法中。这些包括已近交超过40年并且在所有遗传基因座上都是纯合的MGH小型猪。在一个实施方案中，可使用近交SLA

第一哺乳动物物种(即受体)可为灵长类动物，诸如非人灵长类动物(例如狒狒或食蟹猴)或人。在一个实施方案中，第二物种为人。

在各种实施方案中，供体(第二物种)和受体(第一物种)是不同的物种。例如，供体为非人动物，例如小型猪，并且受体为人。

本公开还涵盖将来自第二哺乳动物物种的此种供体动物的移植物移植到第一哺乳动物物种的受体哺乳动物(例如人)中的方法。

本发明的转基因供体动物的细胞、组织、器官或体液可用于移植(例如异种移植)。从供体动物收获的用于移植的移植物可包括但不限于心脏、肾脏、肝脏、胰腺、肺移植物、肠、皮肤、甲状腺、骨髓、小肠、气管、角膜、肢体、骨骼、内分泌腺、血管、结缔组织、祖干细胞、血细胞、造血细胞、胰岛、脑细胞和来自内分泌及其他器官的细胞、体液及其组合。

细胞可为任何类型的细胞。在某些实施方案中，细胞为造血细胞(例如，造血干细胞、淋巴细胞、髓样细胞)、胰腺细胞(例如，β-胰岛细胞)、肾细胞、心脏细胞或肝细胞。

可将供体动物的骨髓细胞(BMC)或造血干细胞(例如，胎肝悬浮液或动员的外周血干细胞)注射到受体中。

方法还可包括以下治疗中的一种或多种：抑制T细胞、阻断补体或以其他方式下调受体对移植物的免疫反应的治疗。

促进移植物耐受性和/或降低移植物免疫识别的治疗包括使用免疫抑制剂(例如，环孢素、FK506)、抗体(例如，抗T细胞抗体诸如多克隆抗胸腺细胞抗血清(ATG)和/或单克隆抗人T细胞抗体诸如LoCD2b)、照射以及诱导混合嵌合的方法。美国专利号6,911,220；6,306,651；6,412,492；6,514,513；6,558,663；和6,296,846。Kuwaki等人,Nature Med.,11(1):29-31,2005。Yamada等人,Nature Med.11(1):32-34,2005。

在一些实施方案中，对受体进行胸腺切除和/或脾切除。可使用胸腺照射。

在一些实施方案中，向受体施用低剂量辐射(例如，在100拉德与400拉德之间全身辐射的亚致死剂量)。也可使用局部胸腺辐射。

受体可用使补体耗竭的剂诸如眼镜蛇毒因子来进行治疗。

天然抗体可通过器官灌流和/或移植诱导耐受的骨髓来消除。天然抗体可通过供体物种肝脏的血液灌流从受体的血液中吸收。可对用于移植的细胞、组织或器官进行基因修饰，使得它们不被宿主的天然抗体识别(例如，细胞是α-1,3-半乳糖基转移酶缺陷型)。

在一些实施方案中，方法包括用人抗人CD154 mAb、吗替麦考酚酯和/或甲泼尼龙治疗。方法还可包括可用于支持疗法的剂，诸如抗炎剂(例如，前列环素、多巴胺、更昔洛韦(ganiclovir)、左氧氟沙星、西米替丁(cimetidine)、肝素、抗凝血酶、促红细胞生成素和阿司匹林)。

在一些实施方案中，施用供体间质组织。

免疫抑制剂(immunosuppressant)也称为免疫抑制剂(immunosuppressiveagent)，可以是降低免疫系统的一个或多个方面诸如体液或细胞免疫系统或补体系统的组分的功能或活性的任何化合物。

免疫抑制剂的非限制性实例包括：(1)抗代谢物，诸如嘌呤合成抑制剂(诸如肌苷单磷酸脱氢酶(IMPDH)抑制剂，例如硫唑嘌呤、霉酚酸酯(mycophenolate)和吗替麦考酚酯(mycophenolate mofetil))、嘧啶合成抑制剂(例如来氟米特(leflunomide)和特立氟胺(teriflunomide))和抗叶酸剂(例如甲氨蝶呤)；(2)钙调神经磷酸酶抑制剂，诸如他克莫司(tacrolimus)、环孢素A、吡美莫司(pimecrolimus)和伏环孢素(voclosporin)；(3)TNF-α抑制剂，诸如沙利度胺和来那度胺；(4)IL-1受体拮抗剂，诸如阿那白滞素(anakinra)；(5)哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂，诸如雷帕霉素(西罗莫司(sirolimus))、地磷莫司(deforolimus)、依维莫司(everolimus)、替西罗莫司(temsirolimus)、佐他莫司(zotarolimus)和优美莫司(biolimus)A9；(6)皮质类固醇，诸如泼尼松；和(7)针对多种细胞或血清靶中的任一种的抗体(包括抗淋巴细胞球蛋白和抗胸腺细胞球蛋白)。

非限制性示例性细胞靶及其各自的抑制剂化合物包括但不限于补体组分5(例如，依库珠单抗(eculizumab))；肿瘤坏死因子(TNF)(例如，英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、阿非莫单抗(afelimomab)和戈利木单抗(golimumab))；IL-5(例如，美泊利单抗(mepolizumab))；IgE(例如，奥马珠单抗(omalizumab))；BAYX(例如，奈瑞莫单抗(nerelimomab))；干扰素(例如，法拉莫单抗(faralimomab))；IL-6(例如，艾西莫单抗(elsilimomab))；IL-12和IL-13(例如，来金珠单抗(lebrikizumab)和优特克单抗(ustekinumab))；CD3(例如，莫罗单抗-CD3(muromonab-CD3)、奥昔珠单抗(otelixizumab)、替利珠单抗(teplizumab)、维西珠单抗(visilizumab))；CD4(例如，克立昔单抗(clenoliximab)、凯利昔单抗(keliximab)和扎木单抗(zanolimumab))；CD11a(例如，依法利珠单抗(efalizumab))；CD18(例如，厄利珠单抗(erlizumab))；CD20(例如，阿夫土珠单抗(afutuzumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、帕考珠单抗(pascolizumab))；CD23(例如，鲁昔单抗(lumiliximab))；CD40(例如，替奈昔单抗(teneliximab)、托利珠单抗(toralizumab))；CD62L/L-选择素(例如，阿塞珠单抗(aselizumab))；CD80(例如，加利昔单抗(galiximab))；CD147/基础免疫球蛋白(basigin)(例如，加维莫单抗(gavilimomab))；CD154(例如，鲁利珠单抗(ruplizumab))；BLyS(例如，贝利单抗(belimumab))；CTLA-4(例如，伊匹木单抗(ipilimumab)、曲美木单抗(tremelimumab))；CAT(例如，柏替莫单抗(bertilimumab)、乐地单抗(lerdelimumab)、美替木单抗(metelimumab))；整合素(例如，那他珠单抗(natalizumab))；IL-6受体(例如，托珠单抗(tocilizumab))；LFA-1(例如，奥度莫单抗(odulimomab))；和IL-2受体/CD25(例如，巴利昔单抗(basiliximab)、达昔单抗(daclizumab)、伊诺莫单抗(inolimomab))。

受体的天然抗体可通过器官灌流和/或移植诱导耐受的骨髓来消除。

在一个实施方案中，用静脉内注射的马抗人胸腺细胞球蛋白(ATG)制剂(例如在移植前第-3天、第-2天、第-1天，例如以大约25-100mg/kg，例如50mg/kg的剂量)治疗人。所述抗体制剂消除成熟T细胞和自然杀伤细胞。ATG制剂还消除自然杀伤(NK)细胞。也可使用从任何哺乳动物宿主获得的抗人ATG。另外，如果指示进一步的T细胞耗竭，则可用单克隆抗人T细胞抗体诸如LoCD2b(Immerge BioTherapeutics,Inc.,Cambridge,Mass.)治疗受体。对于骨髓移植，可向受体施用低剂量辐射。在一些情况下，受体可用使补体耗竭的剂诸如眼镜蛇毒因子来进行治疗(例如在第-1天)。

在一些实施方案中，维持疗法(例如，在移植前立即开始，并在移植后持续至少几天)包括用人抗人CD154 mAb治疗。可施用吗替麦考酚酯(MMF)来维持全血水平。甲泼尼龙也可从移植当天开始施用，此后在接下来的3-4周内逐渐减少。

可用于支持疗法(例如，在第0-14天)的各种剂包括抗炎剂，诸如前列环素、多巴胺、更昔洛韦、左氧氟沙星、西米替丁、肝素、抗凝血酶、促红细胞生成素和阿司匹林。

在一些实施方案中，施用供体间质组织。所述供体间质组织可从胎儿肝脏、胸腺和/或胎儿脾脏获得，可植入受体中，例如肾囊中。胸腺组织可通过植入自体肾囊下进行血运重建而为移植做准备。通过提供来自供体物种的造血间质环境，可增强跨不同物种屏障的干细胞植入和造血。间质基质提供造血细胞与其间质环境之间相互作用所需的物种特异性因子，诸如造血生长因子、粘附分子及其配体。

由于肝脏是胎儿造血的主要部位，因此胎儿肝脏也可用作骨髓的替代，作为造血干细胞的来源。每个器官包括可支持被植入宿主中的相应未分化干细胞的分化的器官特异性间质基质。作为植入的替代或辅助，胎儿肝细胞可以液体悬浮液形式施用。

可将供体的骨髓细胞(BMC)或造血干细胞的另一来源(例如，胎肝悬浮液)注射到受体中。供体BMC位于受体的适当部位，并与剩余的宿主细胞一起连续生长并增殖，从而形成嵌合的淋巴造血群。通过此过程，新形成的B细胞(及其产生的抗体)暴露于供体抗原，使得移植物将被视为自身。在实现了造血干细胞(例如BMC)植入的动物中，在T细胞水平上也观察到了对供体的耐受性。使用异种供体允许可以使用来自同一动物或基因匹配动物的骨髓细胞和器官。

从下面的实验细节将更好地理解本发明。然而，本领域技术人员将容易地理解，所讨论的具体方法和结果仅是对本发明的说明，本发明如在随后的权利要求书中得到更充分描述。

实施例1-产生人/猪杂交胸腺以实现对猪抗原的免疫耐受性以及最佳免疫功能

对异种移植物的强大免疫反应难以在没有过度毒性的情况下用常规免疫抑制来控制。胸腺移植是诱导异种移植的T细胞耐受性的有前途的方法。先前已证明，用人造血干细胞(HSC)和猪(SW)胸腺移植物产生的人源化小鼠对这两种物种都是耐受的。然而，此方法仍然存在一些挑战。首先，在猪胸腺的SW MHC上选择的T细胞可能无法最佳地识别外周中人MHC(HLA)呈递的抗原。其次，由于SW胸腺上皮细胞(TEC)不显示人组织限制性抗原(TRA)，因此可能存在受损的阴性选择以及针对人TRA的Treg的缺乏。通过产生本文所述的人/猪杂交胸腺来克服这些问题。

为了产生人/猪杂交胸腺，通过用释放酶消化人胎儿(胎龄20周)和儿科(4个月大)胸腺，之后对人CD45+细胞进行磁性耗竭，来分离胸腺间质细胞。将人CD45细胞重悬于Matrigel中，并注射到已用2-脱氧葡萄糖(其抑制糖酵解)处理的冷冻/解冻的胎儿SW胸腺组织中，以减少胎儿SW胸腺中猪胸腺细胞的数量(图2A至图2C)。

然后将这些注射的SW胸腺植入到受照射的NOD scid共同γ链敲除(NSG)小鼠中，之后注射来自同一huTEC供体或同种异体供体的人胎肝源性CD34+HSC。移植后12–20周，将移植的胸腺取出、切片并染色，以使用双光子共聚焦显微镜检测人TEC(图1A至图1D)。由于成年胸腺中TEC的数量因胸腺退化而减少，因此将来自17岁供体的胸腺源性huTEC和胸腺间充质细胞(TMC)扩展到2D Matrigel基质上，并将细胞注射到胎猪胸腺组织中，之后移植到人源化小鼠中(图1E至图1H)。

注射HuTEC的SW胸腺在人源化小鼠中是具有功能的并支持人胸腺生成。在人胎儿和儿科供体产生的杂交胸腺中检测到了细胞角蛋白(CK)14+HLA-DR+细胞和CK8+HLA-DR+细胞以及CK8+CK14+HLA-DR+细胞。这些TEC广泛分布并与猪TEC混合(图1A至图1D)。将17岁的胸腺EpCAM+ TEC在单次传代中扩增5倍。用体外扩增的人TEC和间充质细胞产生的杂交胸腺含有人TEC(图1E至图1H)。

将人胸腺间质细胞注射到猪胸腺中是产生人/猪杂交胸腺的有效方法。来自较老胸腺的人TEC可用本文所述的方案在体外扩增，并且可在猪移植物中长期检测到。

实施例2-用于产生杂交胸腺的方法的发展

将细胞重悬于Matrigel中，以防止它们在注射后从猪胸腺中漏出来。作为原理论证，在此实验中，使用人PBMC代替人胸腺上皮细胞。首先，用CFSE(2.5μM)作为示踪染料对1000万个人PBMC染色。将CFSE染色的PBMC(800万个细胞)重悬在冰上的140μl Matrigel中，其中细胞浓度为50,000个细胞/μl。用于将细胞注射到解冻的猪胎儿胸腺碎片中的三种不同的方法：

·方法A：使用Hamilton注射器进行注射，同时将小片放置在V形底96孔板的孔内(5-8μl)；

·方法B：使用PE50管材进行注射(20μl)；

·方法C：使用Hamilton注射器进行注射，同时将小片用镊子保持在孔的外部，直到Matrigel固化为止(4-6μl)。

将所有注射的小片转移至含有补充有10％FBS的DMEM/F12培养基的96孔板的不同孔中。3小时后，将小片用释放酶消化。通过流式细胞术确定释放的细胞数以追踪CFSE染色的注射PBMC。如图3A所示，对于所有三种注射方法，将至少一部分注射的细胞回收。

综上所述，在注射前将细胞重悬于Matrigel中有助于将注射的细胞保留在猪胸腺组织中。Matrigel是由Corning Life Sciences和BD Biosciences生产和销售的Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞所分泌的凝胶状蛋白混合物的商品名。

存在不同的策略使离体猪胸腺碎片中的胸腺细胞耗竭，包括抗猪CD3免疫毒素和补体介导毒性(兔血清作为补体来源加上抗猪CD2)。然而，这两种策略均无效。前一种策略在较高浓度下诱导猪胸腺细胞凋亡，杀死SP和DP T细胞以及非T细胞，并在胸腺中留下大量活胸腺细胞。后一种战略不能有效地使离体胸腺碎片的猪胸腺细胞耗竭。结果未示出。

鉴于这些结果，使用以下方法测试了以下试剂使离体猪胸腺细胞耗竭的能力：

·第0天：解冻猪胸腺小片，将其与以下中的一种一起孵育(一式三份)：

a)环孢素A

b)氢化可的松

c)Notch抑制剂(γ分泌酶抑制剂＝GSi)

d)ABT-737

e)2脱氧鸟苷

f)2D葡萄糖

g)无处理

·在不同的时间点，将组织消化并测试死细胞和凋亡细胞的百分比。参见图3B。

用2-脱氧葡萄糖(2DG，100mM)离体预处理12小时是使胸腺细胞耗竭，同时保持间质细胞存活的最佳方法。将含有间质细胞的在双阴性(DN)细胞上剩余的活双阳性CD4和CD8细胞(DP)或单阳性(SP)CD4(SP-CD4)或SP-CD8细胞的比率用作读数。用2DG 100nM处理12小时导致最低的比率，并且因此是在保留间质细胞的同时去除胸腺细胞的最佳策略。参见图3C。

使用2DG处理使猪胸腺细胞耗竭，并使用Hamilton注射器(上述方法C)注射人胸腺间质细胞，产生了杂交胸腺，并在体内对其进行测试。具体地，解冻两个小瓶的胎猪胸腺。在上下吸移以释放尽可能多的胸腺细胞后，将一半小片用100mM 2DG处理12小时，并且另一半保持未处理。

在第二天，解冻六个小瓶的人胎儿胸腺。在上下吸移以释放尽可能多的胸腺细胞后，使用释放酶消化并释放间质细胞并制成单细胞悬浮液。使用磁激活细胞分选(MACS)来使人CD45+细胞耗竭后，将1000万个胸腺间质细胞以66,000个细胞/μl的浓度溶解于150μl冷Matrigel中。将约10μl细胞(约660,000个胸腺间质细胞)注射到每个胎猪胸腺小片(经2DG处理和未处理的)中。将小片用细镊子保持在室温下约2分钟，直到Matrigel固化。然后，将每个小片转移至含有具有10％人血清的培养基的96孔板的孔中。作为对照，一些小片未注射人胸腺间质细胞。在培养箱中10分钟后，将板在冰上转移至小鼠设施中，以用于移植到免疫缺陷的NSG小鼠。先前已对受体小鼠进行胸腺切除，因此它们没有天然的小鼠胸腺，并且胸腺生成的唯一部位是移植的胸腺碎片。首先对受体NSG小鼠进行照射(100cG)，之后注射人胎肝源性CD34+造血干细胞(HSC)。然后，将一个胸腺小片移植到每只受体小鼠的肾囊下。

实验方案在图4中示出。

移植后每2-3周，对小鼠进行放血，并评估人免疫细胞重建的水平。如图5所示，用2DG处理猪胸腺碎片不会影响移植胸腺中的人胸腺生成。

在移植后20周，对小鼠实施安乐死，并且将移植的胸腺取出并冷冻在OCT中。冷冻切片后，将载玻片用抗人HLA-DR、细胞角蛋白8(CK8，作为皮质胸腺上皮细胞(TEC)的标记物)和CK14(作为髓质TEC的标记物)的抗体染色。由于CK抗体对人和猪都具有交叉反应性，因此使用HLA-DR来区分人和猪TEC。如图6所示，在移植的胸腺中检测到注射的与猪TEC混合的人TEC。CK阴性的HLA-DR+细胞是从骨髓迁移到移植胸腺的HSC衍生的抗原呈递细胞。

体外T细胞增殖结果表明，具有杂交胸腺的小鼠外周T细胞是人TEC供体部分耐受的(图7B)。

来自所有小鼠的人T细胞是猪供体树突状细胞(DC)耐受的，但不对SLA-CC第三方猪树突状细胞(DC)耐受(图7A)。

来自所有小鼠的人T细胞是人HSC供体DC耐受的(图7B)。

响应于人胸腺供体-DC(与人HSC同种异体)和人同种异体DC，来自具有猪胸腺的小鼠的人T细胞以相似的水平增殖。与同种异体DC相比，响应于人胸腺供体-DC，来自具有杂交胸腺的小鼠的人T细胞以降低的水平增殖(图7B)。

实施例3-与在人胸腺(HU/HU小鼠)中发育的人T细胞相比，在猪胸腺(SW/HU小鼠)中发育的人T细胞对人组织限制性抗原(TRA)(MART-1、NYESO1和胰岛抗原IA-2)的反应性增强

为了评估缺乏对在猪胸腺中发育的人TRA特异性T细胞的阴性选择的假设，产生了具有相同的人胎肝CD34+HSC和自体人胎胸腺(HU/HU)或猪胎胸腺(SW/HU)的两组人源化小鼠。参见图8A。在两组中，均取出天然小鼠胸腺，以确保仅在人或猪胸腺中发生胸腺生成。移植后约22周，对小鼠实施安乐死，并使用MACS使合并的淋巴结(LN)和脾细胞中的小鼠CD45+细胞耗竭。剩余的细胞与自体HSC衍生的树突状细胞共培养，所述树突状细胞负载有不同的人TRA蛋白，以测量响应于这些TRA的T细胞增殖。

如图8B所示，SW/HU小鼠中的人外周T细胞显示出对自体人DC呈递的人TRA(IA-2、MART-1和NYESO1)的增殖反应显著增加。这些TRA的氨基酸序列在人与猪之间显著不同。此发现支持在猪胸腺中缺乏对人TRA特异性T细胞的阴性选择，并证明了对于使用杂交胸腺的需求。

实施例4-与在人胸腺(HU/HU小鼠)中发育的人Treg和CD8 T细胞相比，在猪胸腺(SW/HU小鼠)中发育的人Treg和CD8 T细胞的存活率较低

在移植后约24周，对实施例3中产生的小鼠(SW/HU和HU/HU小鼠)实施安乐死。收集移植的胸腺以及合并的脾和淋巴结(颈部、腋窝、肱和肠系膜LN)。通过物理力分离胸腺细胞、脾和LN细胞(将两个载玻片之间的胸腺组织压碎，并使用注射器柱塞通过70μm的细胞滤网将脾和LN压碎)。ACK裂解缓冲液(Gibco)用于裂解脾细胞中的RBC。使用血细胞计数器对分离的细胞进行计数。在对细胞总数进行计数后，将每个胸腺以及合并的脾和LN中的0.2-1百万个细胞用图9中所示的抗体染色，以进行流式细胞术分析。用BD Fortessa流式细胞仪读取细胞，并用Flowjo软件分析数据。

与SW/HU小鼠相比，HU/HU小鼠的脾和LN细胞以及移植的胸腺细胞数量明显更高(图9A和图9G)。在HU/HU与SW/HU小鼠之间，移植胸腺中的DP(双阳性CD4+CD8+)和SP细胞(单阳性SP-CD4或SP-CD8)的比率相似(图9B)。功能性胸腺的DP细胞比率应高于SP细胞。

此外，SP-CD4细胞中Treg(调节性T细胞)的比例相似(图9C)。与HU/HU胸腺相比，SW/HU胸腺中增殖(Ki67+)SP-CD4和Treg细胞的水平更高(图9D和图9F)。此外，SW/HU胸腺Treg的较高比例表达CD45RO(图9E)。

与胸腺中类似水平的SP-CD4和SP-CD8细胞相反，SW/HU小鼠的T细胞之中CD8细胞的比例较低，并且外周中CD4细胞之中Treg的比例也较低(脾和淋巴结，图9I至图9K)。此发现表明，这两个细胞亚群都需要与为其存活选择的相同MHC相互作用。似乎在SW/HU小鼠外周中的CD4和CD8细胞亚群中，幼稚到记忆的转化率更高(图9L和图9M)。外周CD4、CD8和Treg细胞中Ki67+(增殖)(图9O)、HLA-DR+(激活)(图9N)、CD45RO+(图9P)和CTLA-4+细胞(图9Q)的比例在HU/HU与SW/HU之间没有不同。

这些结果进一步证明了对使用杂交胸腺的需求。

实施例5-具有胚胎干细胞衍生的TEC(ES-TEC)的杂交胸腺的产生和人TEC在杂交胸腺中的长期持久性

将人胎儿或儿科胸腺间质细胞(hu-TEC)或hPSC-TEC祖细胞(1-2x10

移植后约20周，将移植的胸腺取出、切片并染色，以使用双光子共聚焦显微镜检测人TEC。

然后将细胞从间质中释放出来，并通过流式细胞术确定细胞数。

如图10所示，人TEC在“杂交胸腺”中存在长期(大于20周)持久性。如图10A所示，所有移植物(包括未注射人TEC的猪胸腺(左上图))均具有人HSC衍生的HLA-DR+APC(绿色)和猪/人CK14+ TEC(红色)。然而，只有杂交胸腺具有可检测的HLA-DR+CK14+人TEC(黄色，见箭头)。

来自长期胸腺移植物的消化间质中门控CD45阴性细胞的流式细胞术染色显示，EPCAM+、CD105阴性hu-TEC仅存在于人胸腺(图10B，右上)和注射有hPSC-TEC祖细胞的SW移植物(图10B，左下图)中，但不存在于未注射的SW THY移植物(图10B，左上)中。还参见图10C。

实施例6-将hES-TEC注射到猪胸腺中促进T细胞发育增加和外周CD4

将hES-TEC(1-2x10

移植后18-22周，通过流式细胞术分析来自胸腺移植物的脾细胞和胸腺细胞。

如图11A至图11D所示，注射有hES-TEC的胸腺移植物的人脾CD3

为了评估终末分化的终末阶段，对胸腺细胞进行染色以表达HuCD45、CD19、CD14、CD4、CD8、CD45RA和CD45RO。如图11E所示，注射有hES-TEC的胸腺移植物具有更高数量的总胸腺细胞，以及更高数量的人CD45细胞、双阳性CD4+CD8+、单阳性CD4+CD8-、CD4-CD8+和未成熟的CD45RO+。

本发明的范围不受上文具体显示和描述的内容的限制。本领域技术人员将认识到，对于所描述的材料、配置、构造和尺寸的实例，存在合适的替代方案。在本发明的描述中引用和论述了许多参考文献，包括专利和各种出版物。提供此类参考文献的引用和论述仅仅是为了阐明本发明的描述，而不是承认任何参考文献是本文所述发明的现有技术。本说明书中引用和论述的所有参考文献以引用的方式整体并入本文。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本领域的普通技术人员将会想到本文描述的内容的变化、修改和其它实现。虽然已经显示和描述了本发明的某些实施方案，但对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行改变和修改。在前面的描述中阐述的内容仅作为说明而非限制提供。