发酵液及其用途

根据本发明，发现益生菌微生物的发酵液显示出有益的特征，这使得它们适合作为饲料添加剂以及作为改善其他饲料添加剂特性的手段。

益生菌微生物是通过在发酵培养基中培养益生菌微生物的样品并随后从如此获得的发酵液中分离益生菌微生物而获得的。

剩余的发酵液通常被丢弃。但发酵液的替代用途也已在文献中公开。例如，美国专利号6,060,051公开了剩余发酵液用于分离代谢物的用途，该代谢物可用于对抗真菌和细菌性植物病害，特别是对玉米根虫具有活性。

令人惊讶的是，根据本发明，发现残留发酵液的干燥似乎对残留发酵液中所含的活性物质的活性，特别是酶促活性和抗微生物活性没有不利影响。

此外，发酵液的干燥产生易于处理的产品并因此用作饲料添加剂并与其他饲料添加剂混合。

具体地，结果表明，通过混合不同的干燥发酵液和/或通过混合含有益生菌微生物的干燥发酵液，可以获得具有优异特征的饲料产品，特别是在蛋白水解活性、针对病原体的抗微生物活性和关于有益细菌的益生元活性方面。

因此，本发明的第一主题是一种生产干燥发酵液的方法，包括以下步骤：

a)在发酵培养基中培养微生物，以获得含有微生物的发酵液；

b)从发酵液中分离出至少20％的微生物；

c)干燥这样获得的发酵液以获得干燥发酵液。

在分离步骤中，从发酵液中去除至少20％，优选至少50％、60％、70％、80％、9％0或95％，更优选至少98％、99％或99.5％的微生物。在本发明的非常优选的实施方案中，发酵液不含或几乎不含任何微生物。

从发酵液中分离微生物尤其可以通过离心、浮选、过滤，特别是超滤或微滤和/或倾析来进行。

发酵液的干燥优选通过发酵液的冷冻干燥、喷雾干燥、真空干燥、盘式干燥、转鼓干燥、流化床干燥或喷雾造粒来进行。

发酵液的冷冻干燥可以通过首先使用液氮或干冰或在-20℃冷藏来冷冻发酵液，然后在高真空下进行干燥来进行(Ananta et al.,2004,Microbial Ecology in Healthand Disease,16(2-3):113-124)。冷冻干燥还可能涉及发酵液的蒸发冷却(Bond,2007,pp.99-107,in Methods in Molecular Biology No.368.Humana Press,New York,USA)。

为了喷雾干燥发酵液，通过加热喷嘴喷雾而雾化的发酵液的细小液滴逆着热空气被喷入干燥室中。在室底部收集发酵液的内容物(Masters,1972,Spray drying.LeonardHill Books,London,UK)。

喷雾造粒是一种优选的工艺，其中发酵液直接转化为适当粒度的自由流动的颗粒。

在本发明的特定实施方案中，在微生物培养之后和微生物分离之前和/或微生物分离之后，可以进行浓缩步骤以增加发酵液的总干物质。发酵液的浓缩尤其可以通过溶剂蒸发来进行。如果应用，则溶剂蒸发优选使用旋转蒸发器、薄膜蒸发器或降膜蒸发器在单级或多级过程中进行。

从发酵液中去除微生物后，发酵液优选具有1至10重量％，特别是1至6重量％的固体含量(总干物质)，和/或优选地含有不超过1x10

在去除微生物之后和开始干燥发酵液之前，可以添加特定物质，特别是为了保存酶。这些物质可特别选自抗结块剂、抗氧化剂、填充剂和/或保护剂。有用物质的实例包括多糖(特别是淀粉、纤维素、甲基纤维素、麦芽糊精、树胶、右旋糖酐、壳聚糖和/或菊粉)、聚乙二醇、氨基酸(特别是脯氨酸、甘氨酸和/或谷氨酸)蛋白质来源(特别是蛋白胨、脱脂奶粉和/或甜乳清粉)、肽、糖(特别是乳糖、木糖、果糖、海藻糖、蔗糖和/或右旋糖)、多元醇(特别是甘露醇、甘油和/或山梨糖醇)、酵母提取物、麦芽提取物、大豆粉、脂质(特别是卵磷脂、植物油和/或矿物油)、盐(特别是氯化钠、碳酸钠、碳酸钙、白垩、石灰石、碳酸镁、磷酸钠、磷酸钙、磷酸镁和/或柠檬酸钠)和硅酸盐(特别是粘土，特别是beolite粘土、无定形二氧化硅、烟雾/沉淀二氧化硅、沸石、漂白土、baylith、clintpolite、蒙脱石、硅藻土、滑石、膨润土和/或硅酸盐如硅酸铝、硅酸镁和/或硅酸钙)。

优选地，如果使用的话，添加这些物质中的至少一种和/或这些物质的组合，其量使得相对于添加(一种或多种)物质之前发酵液中所含的总干物质，他们以十分之一至二倍、优选五分之一至相等的量包含在补充的发酵液悬浮液中。

所得干燥产物可以被进一步加工，例如通过研磨或造粒，以达到特定的粒度或物理形式。

此外，用于生产发酵液的微生物优选为益生菌微生物，特别是益生菌细菌，并且优选选自芽孢杆菌属(Bacillus)，特别是枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、萎缩芽孢杆菌(B.atrophaeus)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、弯曲芽孢杆菌(B.flexus)、梭状芽孢杆菌(B.fusiformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、巨大芽胞杆菌(B.megaterium)、马铃薯芽孢杆菌(B.mesentricus)、漠海威芽孢杆菌(B.mojavensis)、多粘类芽孢杆菌(B.polymixa)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、史氏芽孢杆菌(B.smithii)、东京芽孢杆菌(B.toyonensis)和死谷芽孢杆菌(B.vallismortis)；肠球菌属(Enterococcus)，特别是屎肠球菌(E.faecium)和粪肠球菌(E.faecalis)；土芽孢杆菌属(Geobacillus)，特别是嗜热脂肪地芽孢杆菌(G.stearothermophilus)；梭菌属(Clostridium)，特别是酪酸梭菌(C.butyricum)；和链球菌属(Streptococcus)，特别是粪链球菌(S.faecalis)、屎链球菌(S.faecium)、解没食子酸链球菌(S.gallolyticus)、唾液链球菌嗜热亚种(S.salivariussubsp.thermophilus)和牛链球菌(S.bovis)；乳杆菌属(Lactobacillus)，特别是嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、解淀粉乳杆菌(L.amylolyticus)、食淀粉乳杆菌(L.amylovorus)、消化乳杆菌(L.alimentarius)、鸟乳杆菌(L.aviaries)、短乳杆菌(L.brevis)、布氏乳杆菌(L.buchneri)、干酪乳杆菌(L.casei)、纤维二糖乳杆菌(L.cellobiosus)、棒状乳杆菌(L.coryniformis)、卷曲乳杆菌(L.crispatus)、弯曲乳杆菌(L.curvatus)、德氏乳杆菌(L.delbrueckii)、香肠乳杆菌(L.farciminis)、发酵乳杆菌(L.fermentum)、鸡乳杆菌(L.gallinarum)、格氏乳杆菌(L.gasseri)、瑞士乳杆菌(L.helveticus)、希氏乳杆菌(L.hilgardii)、约氏乳杆菌(L.johnsonii)、马乳酒样乳杆菌(L.kefiranofaciens)、开菲尔乳杆菌(L.kefiri)、粘膜乳杆菌(L.mucosae)、面包乳杆菌(L.panis)、丘状乳杆菌(L.collinoides)、副干酪乳杆菌(L.paracasei)、类植物乳杆菌(L.paraplantarum)、戊糖乳杆菌(L.pentosus)、植物乳杆菌(L.plantarum)、桥乳杆菌(L.pontis)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、清酒乳杆菌(L.sakei)、唾液乳杆菌(L.salivarius)和旧金山乳杆菌(L.sanfranciscensis)；片球菌属(Pediococcus)，特别是乳酸片球菌(P.acidilactici)、糊精片球菌(P.dextrinicus)和戊糖片球菌(P.pentosaceus)；链球菌属(Streptococcus)，特别是乳酸链球菌(S.lactis)和嗜热链球菌(S.thermophiles)；双歧杆菌属(Bifidibacterium)，特别是S.adolescentis、动物双歧杆菌(B.animalis)、两岐双岐杆菌(B.bifidum)、短双歧杆菌(B.breve)和长双歧杆菌(B.longum)。

在本发明的非常优选的实施方案中，益生菌微生物属于芽孢杆菌属，特别是选自以下菌株及其组合：枯草芽孢杆菌DSM 32315、枯草芽孢杆菌DSM 32540、枯草芽孢杆菌DSM32592、地衣芽孢杆菌DSM 32314、短小芽孢杆菌DSM 32539、解淀粉芽孢杆菌CECT 5940。

因此，本发明的另一主题还涉及可通过根据本发明的方法获得的干燥发酵液。

本发明的干燥发酵液优选含有不超过1x10

因此，本发明的另一主题也是干燥发酵液，其含有不超过1x10

本发明的干燥发酵液中的细胞量(cfu)因此优选低于1重量％，特别是低于0.5重量％或0.2重量％，更优选低于0.1重量％，特别是低于0.05重量％或0.02重量％。在特定实施方案中，干燥发酵液中的细胞量(cfu)甚至低于0.01重量％，特别是低于0.005重量％、0.002重量％或0.001重量％。

因此，本发明的另一主题也是干燥发酵液，其含有低于1重量％、特别是低于0.5重量％或0.2重量％、更优选低于0.1重量％、特别是低于0.05重量％或0.02重量％的量的细胞(cfu)，其中在特定实施方案中，干燥发酵液中细胞的量(cfu)甚至低于0.01重量％、特别是低于0.005重量％、0.002重量％或0.001重量％，其中该微生物优选选自枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌。以重量百分比计的细胞的量(cfu)优选根据Jeong et al.(1990)inBiotechnology and Bioengineering,Vol.35,pages 160-184所公开的细胞数(cfu)来计算。

因此，本发明的另一主题特别是微生物的干燥发酵液，从其中去除至少20％、优选至少50％、70％或90％的微生物，该干燥发酵液含有至少一种物质，所述物质选自抗结块剂、抗氧化剂、填充剂和/或保护剂，特别是选自多糖(特别是淀粉、纤维素、甲基纤维素、麦芽糊精、树胶、右旋糖酐、壳聚糖和/或菊粉)、聚乙二醇、氨基酸(特别是脯氨酸、甘氨酸和/或谷氨酸)蛋白质来源(特别是蛋白胨、脱脂奶粉和/或甜乳清粉)、肽、糖(特别是乳糖、木糖、果糖、海藻糖、蔗糖和/或右旋糖)、多元醇(特别是甘露醇、甘油和/或山梨糖醇)、酵母提取物、麦芽提取物、大豆粉、脂质(特别是卵磷脂、植物油和/或矿物油)、盐(特别是氯化钠、碳酸钠、碳酸钙、白垩、石灰石、碳酸镁、磷酸钠、磷酸钙、磷酸镁和/或柠檬酸钠)和硅酸盐(特别是粘土，特别是beolite粘土、无定形二氧化硅、烟雾/沉淀二氧化硅、沸石、漂白土、baylith、clintpolite、蒙脱石、硅藻土、滑石、膨润土和/或硅酸盐如硅酸铝、硅酸镁和/或硅酸钙)。包含在干燥发酵液中的至少一种物质和/或这些物质的混合物优选以至少0.1重量％的量、更优选以至少0.5重量％或至少1重量％的量、特别是以0.1重量％至67重量％或10重量％至67重量％的量、优选以0.5重量％至50重量％或10重量％至50重量％的量、更优选以1重量％至30重量％或10重量％至30重量％的量存在于干燥发酵液中。

根据本发明，“干燥发酵液”是指总干物质含量为至少70重量％、更优选至少80重量％、尤其是大于90重量％、特别是至少95重量％的发酵液。

本发明的进一步主题还是组合物，其包含至少两种、优选至少三种，特别是两种、三种、四种或五种不同种类的干燥发酵液，特别是前述细菌的发酵液。

根据本发明，令人惊讶地进一步发现，解淀粉芽孢杆菌的发酵液表现出意料不到的有益特征，例如非常高的蛋白水解活性。

因此，本发明的另一方面是解淀粉芽孢杆菌的发酵液。因此，本发明的另一主题也是组合物，特别是饲料组合物，其包含解淀粉芽孢杆菌的发酵液，其中发酵液优选是解淀粉芽孢杆菌CECT 5940的发酵液。

解淀粉芽孢杆菌的发酵液优选通过在发酵培养基中培养物种解淀粉芽孢杆菌的益生菌微生物以获得含有所述益生菌微生物的发酵液并随后从所述发酵液中分离至少20％、优选至少50％、60％、70％或80％、更优选至少90、95或98％的微生物来获得，使得解淀粉芽孢杆菌、特别是解淀粉芽孢杆菌的发酵是优选的发酵，其中至少20％、优选至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的微生物已从其中去除。

去除/分离微生物后，发酵液优选具有1至10重量％、特别是1至6重量％的固体含量(总干物质)，和/或优选地含有不超过1x10

在本发明的优选实施方案中，解淀粉芽孢杆菌的发酵液以浓缩或干燥形式使用，其中浓缩和/或干燥优选如在先前说明书中公开的进行和/或浓缩或干燥的发酵液具有在先前说明书中提及的特征。

因此，本发明的特定主题也是解淀粉芽孢杆菌、特别是解淀粉芽孢杆菌CECT 5940的浓缩和/或干燥发酵液。

因此，本发明的另一主题也是干燥发酵液，其含有不超过1x10

因此，本发明的另一主题也是干燥发酵液，其含有低于1重量％、特别是低于0.5重量％或0.2重量％、更优选低于0.1重量％、特别是低于0.05重量％或0.02重量％的量的解淀粉芽孢杆菌、特别是解淀粉芽孢杆菌CECT5940的细胞(cfu)，其中在特定实施方案中，干燥发酵液中细胞的量(cfu)甚至低于0.01重量％、特别是低于0.005重量％、0.002重量％或0.001重量％。

根据本发明的解淀粉芽孢杆菌的发酵液优选具有至少500mU/ml、更优选至少1000mU/ml的蛋白水解活性，所述蛋白水解活性用工作实施例中公开的方法测定。

令人惊奇的是，根据本发明，进一步发现，如果在制备最终饲料之前用微生物的发酵液处理动物饲料或其添加剂，则可以改善饲料的特性。

因此，本发明的另一主题是改善饲料或饲料添加剂的特性的方法，其中用至少一种微生物的至少一种发酵液(从其中去除优选至少20％，优选至少50％、70％或90％的微生物)处理/孵育动物饲料或饲料添加剂，其中优选进行处理/孵育以改善最终饲料产品的特性。

用于生产发酵液的微生物在此还优选选自益生菌微生物，特别是益生菌细菌，优选选自芽孢杆菌属，特别是芽孢杆菌属，特别是枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、弯曲芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌、马铃薯芽孢杆菌、漠海威芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、史氏芽孢杆菌、东京芽孢杆菌和死谷芽孢杆菌；肠球菌属，特别是屎肠球菌和粪肠球菌；土芽孢杆菌属，特别是嗜热脂肪地芽孢杆菌；梭菌属，特别是酪酸梭菌；和链球菌属，特别是粪链球菌、屎链球菌、解没食子酸链球菌、唾液链球菌嗜热亚种和牛链球菌；乳杆菌属，特别是嗜酸乳杆菌、解淀粉乳杆菌、食淀粉乳杆菌、消化乳杆菌、鸟乳杆菌、短乳杆菌、布氏乳杆菌、干酪乳杆菌、纤维二糖乳杆菌、棒状乳杆菌、卷曲乳杆菌、弯曲乳杆菌、德氏乳杆菌、香肠乳杆菌、发酵乳杆菌、鸡乳杆菌、格氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、希氏乳杆菌、约氏乳杆菌、马乳酒样乳杆菌、开菲尔乳杆菌、粘膜乳杆菌、面包乳杆菌、丘状乳杆菌、副干酪乳杆菌、类植物乳杆菌、戊糖乳杆菌、植物乳杆菌、桥乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、清酒乳杆菌、唾液乳杆菌和旧金山乳杆菌；片球菌属，特别是乳酸片球菌、糊精片球菌和戊糖片球菌；链球菌属，特别是乳酸链球菌和嗜热链球菌；双歧杆菌属，特别是S.adolescentis、动物双歧杆菌、两岐双岐杆菌、短双歧杆菌和长双歧杆菌，其中在本发明的非常优选的实施方案中，益生菌微生物属于芽孢杆菌属，特别是选自以下菌株及其组合：枯草芽孢杆菌DSM32315、枯草芽孢杆菌DSM 32540、枯草芽孢杆菌DSM 32592、地衣芽孢杆菌DSM 32314、短小芽孢杆菌DSM32539、解淀粉芽孢杆菌CECT 5940。

发酵液也为此目的优选通过首先在合适的发酵培养基中培养微生物并随后从发酵液中分离至少20％、优选至少50％、70％或90％的微生物来获得。

去除/分离微生物后，发酵液优选具有1至10重量％、特别是1至6重量％的固体含量(总干物质)，和/或优选地含有不超过1x10

在本发明的优选实施方案中，发酵液以浓缩或干燥形式使用，其中浓缩和/或干燥优选如在先前说明书中公开的进行和/或浓缩或干燥的发酵液具有在先前说明书中提及的特征。

特别地，发现如果在制备最终饲料之前用发酵液处理饲料或其添加剂，则抗营养素(antinutritional factor，ANF)的量可以显著减少。

动物饲料的原料如玉米，尤其是豆粕(SBM)含有ANF。SBM是家禽和猪膳食蛋白质的主要来源，但作为水产饲料的饲料添加剂也变得越来越重要。饲料中存在的ANF(例如蛋白质抑制剂、非淀粉多糖、凝集素、抗原性蛋白)干扰饲料营养物的利用，并可能导致动物的健康问题。因此，在消耗饲料之前减少或去除ANF很重要。

已知通过乳酸杆菌(lactobacilli)和芽孢杆菌(bacilli)对豆粕进行发酵减少ANF并增加饲料的营养价值。存在例如以下提示，特定细菌菌株对SBM的发酵会导致抗原性蛋白β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的降解。这些ANF被认为是造成肠道和肝脏异常形态变化的原因，如在用SBM喂养的石斑鱼中观察到的。除了减少原料中的ANF外，在原料发酵期间还可以产生抗微生物肽(AMP)，其可以抑制宿主的致病细菌。

令人惊讶地发现，根据本发明，微生物的发酵液也可用于改善饲料添加剂的特性，特别是以有效方式减少和/或消除ANF，因此本发明的另一个主题是改善动物饲料或动物饲料添加剂的特性的方法，其中用至少一种微生物的至少一种发酵液(从其中去除优选至少20％、更优选至少50％、70％或90％的微生物)处理动物饲料或动物饲料添加剂。

本发明该方面的优选主题是降低动物饲料或动物饲料添加剂中抗营养素(ANF)，特别是β-伴大豆球蛋白和/或大豆球蛋白的量的方法，其中用至少一种微生物的发酵液处理所述动物饲料或动物饲料添加剂。

本发明该方面的另一优选主题是降解动物饲料或动物饲料添加剂中的真菌毒素的方法，其中用至少一种微生物的发酵液处理所述动物饲料或动物饲料添加剂。

可以通过将饲料或饲料添加剂与发酵液一起孵育而建立的饲料或饲料添加剂的特性的进一步改善是动物对饲料或饲料添加剂中所含蛋白质的更好的利用率(usability)、饲料或饲料添加剂的保存，特别是通过降低pH和/或降低饲料或饲料添加剂中的污染微生物的量进行。因此，改善这些特性的方法是本发明的进一步优选实施方案。

优选用发酵液处理以改善它们的特性和/或最终饲料的特性的饲料添加剂优选选自玉米、大豆、大麦、水稻、燕麦、高粱、豆粕、菜籽粕和棉粕。

根据本发明优选用于处理动物饲料或动物饲料添加剂的微生物的发酵液选自益生菌微生物，特别是益生菌细菌的发酵液，优选如在以上说明书中已经公开的益生菌微生物的发酵液，即选自芽孢杆菌属，特别是枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、弯曲芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌、马铃薯芽孢杆菌、漠海威芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、史氏芽孢杆菌、东京芽孢杆菌和死谷芽孢杆菌；肠球菌属，特别是屎肠球菌和粪肠球菌；土芽孢杆菌属，特别是嗜热脂肪地芽孢杆菌；梭菌属，特别是酪酸梭菌；和链球菌属，特别是粪链球菌、屎链球菌、解没食子酸链球菌、唾液链球菌嗜热亚种和牛链球菌；乳杆菌属，特别是嗜酸乳杆菌、解淀粉乳杆菌、食淀粉乳杆菌、消化乳杆菌、鸟乳杆菌、短乳杆菌、布氏乳杆菌、干酪乳杆菌、纤维二糖乳杆菌、棒状乳杆菌、卷曲乳杆菌、弯曲乳杆菌、德氏乳杆菌、香肠乳杆菌、发酵乳杆菌、鸡乳杆菌、格氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、希氏乳杆菌、约氏乳杆菌、马乳酒样乳杆菌、开菲尔乳杆菌、粘膜乳杆菌、面包乳杆菌、丘状乳杆菌、副干酪乳杆菌、类植物乳杆菌、戊糖乳杆菌、植物乳杆菌、桥乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、清酒乳杆菌、唾液乳杆菌和旧金山乳杆菌；片球菌属，特别是乳酸片球菌、糊精片球菌和戊糖片球菌；链球菌属，特别是乳酸链球菌和嗜热链球菌；双歧杆菌属，特别是S.adolescentis、动物双歧杆菌、两岐双岐杆菌、短双歧杆菌和长双歧杆菌，其中在本发明的非常优选的实施方案中，发酵液来自芽孢杆菌属的益生菌微生物，特别是选自以下菌株及其组合：枯草芽孢杆菌DSM 32315、枯草芽孢杆菌DSM 32540、枯草芽孢杆菌DSM 32592、地衣芽孢杆菌DSM 32314、短小芽孢杆菌DSM 32539、解淀粉芽孢杆菌CECT 5940。

为了进行饲料或饲料添加剂的预处理，饲料或饲料添加剂与发酵液优选以1:2至20:1\更优选1:1至10:1的比率混合。优选的混合比率取决于发酵液是以液体、浓缩还是干燥形式使用的，因为在浓缩和干燥形式中，活性物质以更高的浓度存在。在非浓缩发酵液的情况下，饲料添加剂与发酵液的优选混合比率为1:2至2:1(基于w/w)，而对于干燥的发酵液，饲料添加剂与发酵液的优选混合比率为5:1至20:1(基于w/w)。

为了有效改善饲料或饲料添加剂的特性，饲料或饲料添加剂和发酵液的孵育优选进行至少一小时，特别是一小时至100小时，更优选进行至少2小时，特别是2小时至80小时，尤其是至少4小时，优选4小时至50小时。

本发明的发酵液，特别是干燥发酵液，优选具有以下特征中的至少一种，更优选至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种，特别是全部：

a)蛋白酶活性；

b)纤维素酶活性；

c)木聚糖酶活性；

d)淀粉酶活性；

e)植酸酶活性；

f)过氧化氢酶活性；

g)超氧化物歧化酶活性；

h)内酯酶活性；

i)抗抗营养素(ANF)的活性，特别是抗β-伴大豆球蛋白和/或大豆球蛋白的活性；

j)抗霉菌毒素的活性；

k)抗病原微生物的活性，特别是抗产气荚膜梭菌(C.perfringens)和/或猪链球菌(S.suis)的活性；

l)群体感应淬灭(Quorum Quenching)活性；

m)对于有益微生物的益生元活性。

在本发明的优选实施方案中，本发明的发酵液至少具有以下特征：

a)蛋白酶活性；

b)纤维素酶活性；

c)木聚糖酶活性；

d)淀粉酶活性；

e)抗抗营养素(ANF)的活性，特别是抗β-伴大豆球蛋白和/或大豆球蛋白的活性；

f)抗病原微生物的活性，特别是抗产气荚膜梭菌和/或猪链球菌的活性。

本发明的发酵液，特别是干燥发酵液，优选含有至少5种，更优选至少6、7、8、9、10或12种代谢物。代谢物优选具有200至5000道尔顿、更优选300至4000道尔顿的分子量。

本发明的另一主题还有组合物，特别是饲料组合物，其包含根据本发明的至少一种发酵液、特别是至少一种干燥发酵液，其中所述饲料组合物优选包含至少一种另外的饲料添加剂，特别是如下文进一步公开的。

本发明的另一主题特别地是一种组合物，特别是饲料组合物，其包含不同种类的发酵液的混合物，特别是不同种类的干燥发酵液的混合物，如说明书中之前所述的，其中所述饲料组合物优选包含至少一种另外的饲料添加剂，特别是如下文进一步公开的。

本发明的发酵液和含有它们的组合物，当施用于动物时，优选增强这些动物的健康和/或改善这些动物的一般身体状况和/或改善这些动物的饲料转化率和/或降低这些动物的死亡率和/或增加这些动物的存活率和/或提高这些动物的体重增加和/或增加这些动物的生产力和/或增加这些动物的抗病性和/或增加这些动物的免疫应答和/或在这些动物中建立或维持健康的肠道菌群和/或减少这些动物通过粪便的病原体脱落。特别地，本发明的发酵液和组合物可用于在出于治疗目的施用抗生素后帮助重建肠道菌群的健康平衡。

因此，本发明的另一主题是一种增强动物的健康和/或改善动物的一般身体状况和/或改善动物的饲料转化率和/或降低动物的死亡率和/或增加动物的存活率和/或改善动物的体重增加和/或增加动物的生产力和/或增加动物的抗病性和/或增加动物的免疫应答和/或在动物中建立或维持健康的肠道菌群和/或减少动物通过粪便的病原体脱落，其中将本发明的发酵液或包含这些发酵液的本发明的组合物施用于动物。

“增加动物的生产力”特别是指以下任何一项：生产更多或更高质量的蛋、奶或肉，或增加的断奶后代产量。

本发明的发酵液还可用于改善水的质量。因此，本发明的另一主题也是控制和/或改善水或水性溶液，特别是饮用水和/或饲养用水的质量的方法，包括将根据本发明的发酵液施加到水中的步骤.

此外，根据本发明的发酵液还可用于治疗植物，特别是用于治疗植物的微生物病害。因此，本发明的另一主题也是治疗植物的方法，特别是治疗和/或预防植物、特别是栽培植物的微生物病害的方法，包括将本发明的至少一种发酵液施加于植物的步骤。施加可以以液体形式，例如通过喷雾，或以固体形式，特别是粉末形式进行。

特别地，本发明的发酵液可以以有效抑制和/或减少动物肠道中致病细菌生长的量施用或喂给动物。这些致病细菌包括梭菌属(Clostridia)、李斯特菌属(Listeria)、沙门菌属(Salmonella)、肠球菌属(Enterococci)、葡萄球菌属(Staphylococci)、气单胞菌属(Aeromonas)、链球菌属(Streptococci)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(Escherichia coli)，和弧菌属(Vibrio)。相关地，本发明的方法可用于减少动物粪便中脱落的致病细菌的量。本发明的方法还可用于维持或增加动物肠道中有益细菌如乳酸菌的生长。通过减少致病细菌和/或增加或维持有益细菌，本发明的组合物能够维持整体健康的肠道菌群。

因此，本发明的另一个主题是在动物肠道中抑制和/或减少有害或致病细菌的生长，和/或维持和/或增加有益细菌的生长的方法，其中本发明的发酵液被施用于动物，其中致病细菌优选选自梭菌属，特别是产气荚膜梭菌(C.perfringens)和艰难梭菌(C.difficile)；李斯特菌属，特别是单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)、西尔李斯特菌(L.seeligeri)和威尔斯李斯特菌(L.welshimeri)；沙门菌属，特别是肠道沙门菌(S.enterica)、鸡沙门菌(S.gallinarum)、鸡瘟沙门菌(S.pullorum)、亚利桑那沙门菌(S.arizonae)、鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)、肠炎沙门菌(S.enteritidis)和S.bongori；肠球菌属，特别是粪肠球菌(E.faecalis)、屎肠球菌(E.faecium)和盲肠肠球菌(E.cecorum)；葡萄球菌属，特别是金黄色葡萄球菌(S.aureus)；气单胞菌属(Aeromonas)；链球菌属，特别是猪链球菌(S.suis)和鹑鸡链球菌(S.gallinaceus)；弯曲杆菌属，特别是空肠弯曲杆菌(C.jejuni)和大肠弯曲杆菌(C.coli)；大肠杆菌；以及弧菌属，特别是是副溶血性弧菌(V.parahemolyticus)和哈维氏弧菌(V.harveyi)，并且有益细菌优选选自乳酸菌，特别是乳杆菌(Lactobacilli)和双歧杆菌(Bifidobacteria)。

在本发明的优选实施方案中，至少一种致病细菌的量，特别是产气荚膜梭菌的量减少至少0.5log，更优选减少至少1log、2log或3log。

因此，本发明的另一个主题还是本发明的发酵液，其在动物肠道中用于抑制和/或减少致病细菌的生长和/或维持和/或增加有益细菌的生长，其中致病细菌优选选自梭菌属，特别是产气荚膜梭菌和艰难梭菌；李斯特菌属，特别是单核细胞增生李斯特菌、西尔李斯特菌和威尔斯李斯特菌；沙门菌属，特别是肠道沙门菌、鸡沙门菌、鸡瘟沙门菌、亚利桑那沙门菌、鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌和S.bongori；肠球菌属，特别是粪肠球菌、屎肠球菌和盲肠肠球菌；葡萄球菌属，特别是金黄色葡萄球菌；气单胞菌属；链球菌属，特别是猪链球菌和鹑鸡链球菌；弯曲杆菌属，特别是空肠弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌；大肠杆菌；以及弧菌属，特别是是副溶血性弧菌和哈维氏弧菌，并且有益细菌优选选自乳酸菌，特别是乳杆菌和双歧杆菌。

致病细菌的出现和/或生长增加确实或可能导致某些疾病的爆发。例如，产气荚膜梭菌的出现和/或生长增加可导致肠道疾病的爆发，特别是在家禽中坏死性肠炎的爆发。产气荚膜梭菌的出现和/或生长增加还可导致其他疾病的爆发，例如细菌性肠炎、坏疽性皮炎和胆管性肝炎(colangiohepatitis)。即使是产气荚膜梭菌最温和形式的感染也可能伴随腹泻，这导致垫料潮湿，从而可能导致继发性疾病，如足底皮肤炎。

因此，本发明的另一主题也是治疗组合物，其包含至少一种如前文所述的本发明的发酵液。

因此，本上下文中优选的主题是治疗组合物，其用于治疗和/或预防动物、优选家禽中的坏死性肠炎、特别是亚临床坏死性肠炎，其包含至少一种如前所述的本发明的发酵液。

因此，本上下文中的另一优选主题是治疗组合物，其用于治疗和/或预防动物、优选家禽中的细菌性肠炎、坏疽性皮炎、胆管性肝炎、梭菌病、腹泻和/或足底皮肤炎，其包含至少一种前述发酵液。

因此，本发明的另一主题也是在家禽中治疗和/或预防疾病，特别是肠道疾病，优选坏死性肠炎，特别是亚临床坏死性肠炎，其中将本发明的至少一种发酵液施用于有此需要的动物。

因此，本发明的另一主题也是治疗和/或预防疾病，优选家禽疾病，该疾病选自细菌性肠炎、坏疽性皮炎、胆管性肝炎、梭菌病、腹泻和/或足底皮肤炎，其中将本发明的至少一种发酵液施用于有此需要的动物。

本发明的发酵液可以在动物生命的多日内或在动物生命的特定阶段或部分期间在饲料和/或饮用水中施用于动物。例如，菌株和/或组合物可以仅在农场动物的起始饮食或仅在育肥后饮食(finisher diet)中施用。

本发明的组合物，特别是饲料、食物和药物组合物以及饮用水或饲养用水，优选包含0.1重量％至10重量％、更优选地0.2重量％至5重量％、特别是0.3重量％至3重量％的量的本发明的发酵液。

本发明的方法可用于所有种类的动物，特别是所有种类的非人类和非昆虫动物，更优选所有种类的脊椎动物，诸如哺乳动物、水生动物和鸟类。

可受益于本发明的动物包括但不限于农场动物、宠物、引进动物、动物园动物、水生动物，用于运动、娱乐或工作的动物。

宠物优选选自狗、猫、家禽和家养的引进动物。

水生动物优选选自优选用于人类营养的有鳍鱼和甲壳类动物。这些特别包括鲤鱼、罗非鱼、鲶鱼、金枪鱼、鲑鱼、鳟鱼、澳洲肺鱼、鲷鱼(bream)、鲈鱼、鳕鱼、虾、龙虾、螃蟹、对虾和小龙虾。在这方面优选的鲑鱼类型是大西洋鲑鱼、红大麻哈鱼、山女鳟(masusalmon)、王鲑、狗鲑(keta salmon)、银鲑、多瑙河鲑、太平洋鲑鱼和粉鲑。

进一步优选的水生动物是养殖鱼，其随后被加工成鱼粉或鱼油。在这方面，鱼优选是鲱鱼、绿鳕、油鲱(menhaden)、凤尾鱼、毛鳞鱼或鳕鱼。

在进一步优选的实施方案中，动物是农场动物，它们被饲养用于消费或作为食物生产者，诸如家禽、猪和反刍动物。

家禽可以选自生产性家禽或家庭性家禽，也可以选自观赏家禽或野禽。在这方面优选的生产性家禽是鸡、火鸡、鸭和鹅。在此上下文中，生产性牲畜优选为优化用于生产幼畜的家禽或优化用于产肉的家禽。优选的观赏家禽或野禽是孔雀、野鸡、鹧鸪、欧石鸡(chukkar)、珍珠鸡、鹌鹑、雷鸟、松鸡、鸽子和天鹅，其中鹌鹑是特别优选的。进一步优选的家禽是平胸类鸟，特别是鸵鸟和鸸鹋，以及鹦鹉。

根据本发明的反刍动物优选选自牛、山羊和绵羊。在一个实施方案中，可以将本发明的组合物喂给幼年反刍动物以增强它们的健康，并且特别是降低这些动物的腹泻发生率。幼年反刍动物是年龄分为为出生到大约十二周的反刍动物，包括小牛。

本发明的组合物可包含至少一种载体或典型的饲料添加剂或其组合。

合适的载体是被添加以提高回收、功效或物理特性和/或有助于包装和施用的惰性制剂添加剂。这些载体可以单独或组合添加。这些载体可以选自抗结块剂、抗氧化剂、填充剂和/或保护剂。有用的载体的实例包括多糖(特别是淀粉、麦芽糊精、甲基纤维素、树胶、壳聚糖和/或菊粉)、蛋白质源(特别是脱脂奶粉和/或甜乳清粉)、肽、糖(特别是乳糖、海藻糖、蔗糖和/或右旋糖)、脂质(特别是卵磷脂、植物油和/或矿物油)、盐(特别是氯化钠、碳酸钠、碳酸钙、白垩、石灰石、碳酸镁、磷酸钠、磷酸钙、磷酸镁和/或柠檬酸钠)和硅酸盐(特别是粘土，特别是beolite粘土、无定形二氧化硅、烟雾/沉淀二氧化硅、沸石、漂白土、baylith、clintpolite、蒙脱石、硅藻土、滑石、膨润土和/或硅酸盐如硅酸铝、硅酸镁和/或硅酸钙)。在American Feed Control Officials,Inc的每年出版一次的OfficialPublication中列出了动物饲料添加剂的合适载体。参见例如Official Publication ofAmerican Feed Control Officials,Sharon Krebs,editor,2006edition,ISBN 1-878341-18-9。可以在使发酵液浓缩之后和/或在干燥期间和/或干燥之后添加载体。根据本发明优选的载体选自碳酸钙、硅藻土和植物油。

本发明的组合物，特别是饲料组合物，还可以包含益生菌作为额外的饲料添加剂，其中益生菌优选选自前述的益生菌列表，即，选自芽孢杆菌属，特别是枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、弯曲芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌、马铃薯芽孢杆菌、漠海威芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、史氏芽孢杆菌、东京芽孢杆菌和死谷芽孢杆菌；肠球菌属，特别是屎肠球菌和粪肠球菌；土芽孢杆菌属，特别是嗜热脂肪地芽孢杆菌；梭菌属，特别是酪酸梭菌；和链球菌属，特别是粪链球菌、屎链球菌、解没食子酸链球菌、唾液链球菌嗜热亚种和牛链球菌；乳杆菌属，特别是嗜酸乳杆菌、解淀粉乳杆菌、食淀粉乳杆菌、消化乳杆菌、鸟乳杆菌、短乳杆菌、布氏乳杆菌、干酪乳杆菌、纤维二糖乳杆菌、棒状乳杆菌、卷曲乳杆菌、弯曲乳杆菌、德氏乳杆菌、香肠乳杆菌、发酵乳杆菌、鸡乳杆菌、格氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、希氏乳杆菌、约氏乳杆菌、马乳酒样乳杆菌、开菲尔乳杆菌、粘膜乳杆菌、面包乳杆菌、丘状乳杆菌、副干酪乳杆菌、类植物乳杆菌、戊糖乳杆菌、植物乳杆菌、桥乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、清酒乳杆菌、唾液乳杆菌和旧金山乳杆菌；片球菌属，特别是乳酸片球菌、糊精片球菌和戊糖片球菌；链球菌属，特别是乳酸链球菌和嗜热链球菌；双歧杆菌属，特别是S.adolescentis、动物双歧杆菌、两岐双岐杆菌、短双歧杆菌和长双歧杆菌，其中在本发明的非常优选的实施方案中，发酵液来自芽孢杆菌属的益生菌微生物，特别是选自以下菌株以及其组合：枯草芽孢杆菌DSM 32315、枯草芽孢杆菌DSM 32540、枯草芽孢杆菌DSM 32592、地衣芽孢杆菌DSM 32314、短小芽孢杆菌DSM32539、解淀粉芽孢杆菌CECT 5940。其他合适的益生菌选自枯草芽孢杆菌PB6(如美国专利号7,247,299中所述，并以ATCC保藏号PTA-6737保藏)，其由Kemin以商标

也可包含在根据本发明的组合物中和/或用于从根据本发明的浓缩或干燥发酵液开始制备饲料组合物的合适的典型动物饲料添加剂包含以下中的一种或多种：蛋白质类、碳水化合物类、脂肪类、益生元类、酶类、维生素类、免疫调节剂类、代乳品类、矿物质类、氨基酸类、抗球虫剂类、酸基(acid-based)产品和/或药物，如抗生素。

可以根据本发明使用的含有碳水化合物的组分是例如草料、粗饲料、小麦粗粉、葵子饼粉或豆粕，以及它们的混合物。

可以根据本发明使用的含有蛋白质的组分是例如大豆蛋白、豌豆蛋白、小麦面筋或玉米面筋，以及它们的混合物。

可以根据本发明使用的含有脂肪的组分特别是动物和植物来源的油，如植物油，例如大豆油、菜籽油、葵花籽油、亚麻籽油或棕榈油、鱼油和它们的混合物。

可以根据本发明使用的额外含有脂肪的含蛋白质的组分是例如鱼粉、磷虾粉、双壳类粉、乌贼粉或虾壳，以及它们的组合。

可根据本发明使用的益生元优选是低聚糖，特别地选自低聚半乳糖、涎酸低聚糖(silayloligosaccharides)、乳果糖、乳蔗糖(lactosucrose)、果糖寡糖、帕拉金糖或异麦芽糖低聚糖、糖基蔗糖、麦芽低聚糖、异麦芽低聚糖、环糊精、低聚龙胆糖、大豆低聚糖、低聚木糖、右旋糖酐、果胶、多聚半乳糖醛酸多糖(polygalacturonan)、鼠李半乳糖醛酸聚糖(rhamnogalacturonan)、甘露聚糖、半纤维素、阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖、抗性淀粉、蜜二糖(mehbiose)、壳聚糖、琼脂糖、菊粉、塔格糖、聚葡萄糖和藻酸盐。

可用于根据本发明的饲料组合物且可有助于饲料消化的酶优选选自植酸酶(EC3.1.3.8或3.1.3.26)；木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)；半乳糖苷酶，特别是α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)；蛋白酶(EC3.4)；磷脂酶，特别是磷脂酶A1(EC3.1.1.32)、A2(EC 3.1.1.4)、C(EC 3.1.4.3)和D(EC3.1.4.4)；溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)；淀粉酶，特别是α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)；溶菌酶(EC 3.2.1.17)；葡聚糖酶，特别是β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)；葡糖淀粉酶；纤维素酶；果胶酶，或其任何混合物。

市售的植酸酶的例子包括Bio-Feed

市售的木聚糖酶的例子包括

可以根据本发明使用的维生素是例如维生素A、维生素D3、维生素E、维生素K(例如维生素K3)、维生素B12、生物素、胆碱、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、叶酸和泛酸(例如Ca-D-泛酸)，或它们的组合。

可以使用的免疫调节剂是例如抗体、细胞因子、喷雾干燥的血浆、白介素或干扰素，或它们的组合。

可以根据本发明使用的矿物质是例如硼、钴、氯化物、铬、铜、氟化物、碘、铁、锰、钼、硒、锌、钙、镁、钾或钠，或它们的组合。

可以根据本发明使用的氨基酸是例如赖氨酸、丙氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸或色氨酸，或它们的组合。

因此，本发明的另一个实施方案是制备动物饲料组合物的方法，包括将至少一种发酵液，特别是干燥发酵液，或根据本发明的发酵液的混合物，特别地以有效增强动物健康的量与饲料添加剂诸如蛋白质、脂质和/或碳水化合物，以及任选的其他有益物质(优选如前所述)混合，以提供饲料产品。该方法还可包括例如造粒步骤。

可以使用本领域技术人员已知的标准造粒工艺，包括干燥或半湿饲料的挤出加工。优选的造粒温度在约65℃和约120℃之间。

在本发明的特别优选的实施方案中，在制备本发明的饲料组合物中，在随后的步骤中将根据本发明的(一种或多种)发酵液添加到已经制备的饲料产品上，特别是添加到饲料丸上，其中将(一种或多种)发酵液添加到已经制备的饲料产品，特别是饲料丸，优选通过喷涂或真空涂覆进行。该方法具有以下特定优点：可以完全避免(一种或多种)发酵液中所含酶的热降解。

此外，其他敏感材料如油和/或酶可以通过喷涂或真空涂覆添加到饲料产品中，特别是添加到饲料丸中。

本发明的发酵液可以通过根据本领域众所周知的方法培养本发明的菌株来获得，包括使用例如在US6,060,051、EP0287699、US2014/0010792或FAO Report 179(2016):Probiotics in Animal Nutrition中描述的培养基、条件和方法。常规的大规模微生物培养工艺包括深层发酵、固态发酵或液体表面培养。在发酵接近尾声时，随着营养物被耗尽，芽孢杆菌菌株的细胞开始从生长阶段转变为孢子形成阶段，使得发酵的最终产物主要是孢子、代谢物和残留的发酵培养基。孢子形成是这些菌株自然生命周期的一部分，并且通常由细胞响应营养限制而启动。发酵被配置为获得高水平的益生菌细胞菌落形成单位并促进孢子形成。

优选地，根据本发明，在本发明的实施方案中总是使用有效量的本发明的发酵液。术语“有效量”是指与未施用本发明的发酵液，但除此之外施用相同的饮食(包括饲料和其他化合物)的动物相比，对动物和/或环境产生至少一种有益效果(特别是关于先前已经描述的特征)的量。

在治疗性应用的情况下，优选使用治疗量的本发明的发酵液。术语“治疗量”是指足以改善、逆转或预防动物疾病状态的量。除了别的之外，通过评估组合物的以下能力，本领域技术人员可以容易地确定各种动物的最佳剂量水平：(i)在各种剂量抑制或减少肠道中致病细菌的能力，(ii)增加或维持有益细菌水平的能力和/或(iii)在各种剂量增强动物健康的能力。

附图说明

图1显示了以下的纤维素酶活性：a)枯草芽孢杆菌菌株DSM 32540的营养细胞；b)解淀粉芽孢杆菌CECT 5940菌株的营养细胞；c)解淀粉芽孢杆菌CECT5940发酵的无菌过滤的未干燥的上清液；d)解淀粉芽孢杆菌CECT 5940发酵的无菌过滤的未干燥的上清液。纤维素酶活性导致琼脂板上纤维素水解区周围的清除。

图2显示了以下的纤维素酶活性：a)枯草芽孢杆菌菌株DSM 32540的营养细胞；b)枯草芽孢杆菌DSM 32540发酵的无菌过滤上清液；c)枯草芽孢杆菌DSM 32540发酵的无菌过滤的未干燥的上清液；d)枯草芽孢杆菌DSM 32540发酵的非无菌过滤的未干燥的上清液；e)枯草芽孢杆菌DSM32540发酵的非无菌过滤的上清液。纤维素酶活性导致琼脂板上纤维素水解区周围的清除。

图3显示了显示了以下的纤维素酶活性：a)–d)解淀粉芽孢杆菌CECT5940发酵的无菌过滤(冷冻干燥并溶解)的上清液；e)解淀粉芽孢杆菌CECT5940的营养细胞。纤维素酶活性导致琼脂板上纤维素水解区周围的清除。

图4显示了以下的木聚糖酶活性：a)解淀粉芽孢杆菌CECT 5940的营养细胞；b)枯草芽孢杆菌DSM 32540的营养细胞；c)解淀粉芽孢杆菌CECT5940发酵的无菌过滤的未干燥的上清液；d)解淀粉芽孢杆菌CECT5940发酵的无菌过滤的未干燥的上清液。木聚糖酶活性导致琼脂板上木聚糖水解区周围的清除。

图5显示了以下的淀粉酶活性：a)–d)解淀粉芽孢杆菌CECT 5940发酵的无菌过滤(冷冻干燥并溶解)的上清液；e)解淀粉芽孢杆菌CECT5940菌株的营养细胞。淀粉酶活性导致琼脂板上淀粉水解区周围的清除。

图6显示了以下的蛋白酶活性：a)枯草芽孢杆菌DSM 32540的营养细胞；b)解淀粉芽孢杆菌CECT 5940的营养细胞；c)解淀粉芽孢杆菌CECT5940发酵的无菌过滤的未干燥的上清液；d)解淀粉芽孢杆菌CECT 5940发酵的无菌过滤的未干燥的上清液。蛋白酶活性导致琼脂板上底物水解区周围的清除。

图7显示了以下的蛋白酶活性：a)–d)解淀粉芽孢杆菌CECT 5940发酵的无菌过滤(冷冻干燥并溶解)的上清液；e)解淀粉芽孢杆菌CECT5940的营养细胞。蛋白酶活性导致琼脂板上底物水解区周围的清除。

图8显示了用枯草芽孢杆菌DSM32540发酵的无菌过滤的未干燥的上清液处理大豆蛋白提取物24小时的SDS-PAGE图。

图9显示了用解淀粉芽孢杆菌CECT 5940发酵的无菌过滤的未干燥的上清液处理24小时的大豆蛋白提取物的SDS-PAGE图。指示的蛋白质带通过nLC/MS分析鉴定为：1-大豆(Glycine max)的β-伴大豆球蛋白，α'链；2-大豆的β-伴大豆球蛋白α亚基；3-大豆的β-伴大豆球蛋白α亚基；4-大豆的大豆球蛋白；5-大豆的β-伴大豆球蛋白α原亚基；6-大豆的β-伴大豆球蛋白α原亚基；7-大豆的β-伴大豆球蛋白α亚基。

工作实施例

实施例1.消化酶活性的定性和定量评估

对在益生菌枯草芽孢杆菌DSM 32540和解淀粉芽孢杆菌菌株CECT5940的标准培养基中发酵的上清液的消化酶活性进行评估，特别是需氧纤维素活性(图1-3)、木聚糖水解活性(图4)、淀粉酶活性(图5)和蛋白水解活性(图6-7)。

为了评估纤维素酶活性，将3μl的益生菌芽孢杆菌发酵的无菌过滤的未干燥和/或冷冻干燥且溶解的上清液点样到含有5g/l Sigmacell纤维素的LB琼脂上。为了筛选蛋白酶活性，将3μl的益生菌芽孢杆菌菌株发酵的无菌过滤的未干燥和/或冷冻干燥且溶解的上清液点样到含有10％脱脂牛奶的LB琼脂上。在含有0.5％木聚糖的LB琼脂上以类似的方式分析木聚糖酶活性；在含有10g/l可溶性淀粉的LB琼脂上分析淀粉酶活性。

作为阳性对照，分析了相应益生菌菌株的营养细胞的酶活性。因此，将3μl液体培养物直接点样在相应的琼脂平板上，将其在37℃在有氧条件下进行孵育。读出的参数是由酶活性产生的水解区的出现。将纤维素酶和淀粉酶测定中使用的平板用卢戈碘溶液进行染色(图1-3；5)。

以定性方式对消化酶活性的分析表明，可以在无菌过滤的上清液以及冷冻干燥且溶解的无菌过滤的上清液中发现相应的活性。

此外，以定量方式评估芽孢杆菌属菌株发酵的无菌过滤的未干燥的上清液的蛋白水解活性。将10μL无菌过滤的上清液添加到20μL 0.5％荧光素异硫氰酸酯酪蛋白(FITC；C3777，Sigma-Aldrich)溶液中，该溶液含有20μL由20mM磷酸钠(无水二碱价的)与150mM氯化钠(所有成分均来自Sigma-Aldrich)组成的缓冲剂，然后在37℃孵育1小时。在添加150μL10％(v/v)三氯乙酸(Sigma-Aldrich)并在37℃再孵育30分钟后，将样品以19,000rpm离心15分钟，然后将2μL上清液转移至200μL 500mM TRIS HCl溶液(Trizma BaseTRIS，Sigma-Aldrich)。在494nm激发波长、518nm发射波长下测定由于蛋白水解释放引起的可溶性肽的荧光(TECAN GENios Microplate Reader,Tecan Group Ltd.,

表1：枯草芽孢杆菌DSM 32540和解淀粉芽孢杆菌CECT 5940发酵的无菌过滤的上清液的蛋白酶活性。

在直接比较中，解淀粉芽孢杆菌CECT 5940发酵的上清液的蛋白酶活性是枯草芽孢杆菌DSM32540发酵的上清液的大于10倍。

实施例2.益生菌芽孢杆菌菌株发酵的上清液的病原体抑制。

使用孔扩散拮抗试验(Parente et al.1995)来评估通过在发酵期间由益生菌芽孢杆菌菌株产生的次级代谢产物进行的上清液的病原体抑制。

用不同病原体来自Teo和Tan(2005)的产气荚膜梭菌型菌株ATCC13124和猪链球菌ATCC 43765进行孔扩散拮抗试验(用冷冻干燥的溶解的无菌过滤上清液进行测定)。已知菌株ATCC 13124是一种α-产毒素A型菌株，用作梭菌的一类菌株。

猪链球菌是猪的重要病原体，并且是断奶后仔猪细菌性死亡的最重要原因之一，其导致败血症、脑膜炎和许多其他感染(Goyette-Desjardins et al.2014)。ATCC43765属于血清学组：R；血清型2，并且是从猪中分离出来的。

致病菌株在合适的条件下以液体培养物的形式生长至600nm光密度至少为1，然后用无菌刮铲将130μl涂抹在琼脂平板的表面上。对于所有病原体，均使用TSBYE琼脂平板。将9mm直径的孔切入干燥平板。第1个孔用作没有培养物的未接种的培养基对照，其他孔接种100μL的益生菌芽孢杆菌菌株发酵的无菌过滤的上清液(有或没有热处理)。在37℃的合适条件下孵育24小时后，确定以mm计的从切割孔的边缘到所清除的菌苔边缘的清除区域。每个菌落测量两次(水平、垂直)，然后取平均值。结果见下表2和3。

表2：在TSBYE培养基上的孔扩散拮抗试验中，解淀粉芽孢杆菌CECT5940发酵的热处理和非热处理的无菌过滤的非干燥上清液对致病性产气荚膜梭菌菌株的抑制能力(以mm计的病原体的清除值)的比较。

数据表明，解淀粉芽孢杆菌CECT5940发酵的未干燥的上清液(也经过热处理)非常有效地抑制了产气荚膜梭菌的生长。

表3：在TSBYE培养基上的孔扩散拮抗试验中，枯草芽孢杆菌DSM32540发酵的热处理和非热处理的无菌过滤的上清液对致病性猪链球菌菌株的抑制能力(以mm计的病原体的清除值)的比较。

数据显示，枯草芽孢杆菌DSM 32540发酵的上清液(也经过热处理)非常有效地抑制了猪链球菌ATCC43765的生长。此外，在冷冻干燥后仍可观察到抑制作用。

Teo,A.Y.-L.and Tan,H.-M.(2005).Inhibition of Clostridium perfringensby a novel strain of Bacillus subtilis from the gastrointestinal tracts ofhealthy chickens.Appl.Environm.Microbiol.,71:4185-90。

Parente,E.,Brienza,C.,Moles,M.,&Ricciardi,A.(1995).A comparison ofmethods for the measurement of bacteriocin activity.Journal ofmicrobiological methods,22(1),95-108。

Goyette-Desjardins,G.,Auger,J.P.,Xu,J.,Segura,M.and Gottschalk,M.(2014).Streptococcus suis,an important pig pathogen and emerging zoonoticagent—an update on the worldwide distribution based on serotyping andsequence typing.Emerg Microbes Infect.2014Jun；3(6):e45。

实施例3：益生菌芽孢杆菌菌株发酵的无菌过滤的上清液对豆粕的抗营养素的水解活性的评估。

使用改编自Iwabuchi and Yamauchi(1987)的方法从脱脂豆粕中提取蛋白质。使用含有10mMβ-巯基乙醇的100ml 0.03M Tris-HCl(pH8)在室温搅拌1小时提取脱脂豆粕。将样品离心，对上清液进行无菌过滤并将样品储存在-20℃。

将益生菌枯草芽孢杆菌DSM 32540和解淀粉芽孢杆菌CECT5940发酵的无菌过滤的未干燥的上清液与大豆蛋白提取物以2:1的比率在37℃孵育。在0小时、6小时和24小时取样，离心并将上清液储存在-20℃以供进一步分析。将添加了未使用的培养基的对照样品进行平行分析。

使用Bio-Rad蛋白质检测试剂盒(Bio-Rad，USA)测定蛋白质浓度。使用SDS-Page监测蛋白质水解。在凝胶上样之前，调节蛋白质浓度并通过5分钟95℃热处理使蛋白质变性。将20μg的提取的蛋白质上样入10％Mini Protean TGX Precast SDS凝胶的每个孔中。将Precision Plus Protein

在仅含有培养基和大豆蛋白提取物的对照样品中检测不到大豆蛋白提取物的蛋白水解降解。分别将大豆蛋白提取物与枯草芽孢杆菌DSM 32540发酵和解淀粉芽孢杆菌CECT 5940发酵的无菌过滤的上清液孵育6小时和24小时后，可以检测到主要蛋白质的水解。较小肽(<25kDa)的增加伴随着多个较大的蛋白质带(25-75kDa)的减少。将随时间降解的蛋白质带和来自仅用培养基孵育的大豆提取物的对照样品的特定带通过纳米LC/MS进行分析，并通过高分辨率质谱法鉴定为大豆的β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白。因此，大豆的抗原性蛋白质β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白在用芽孢杆菌发酵的非干燥的无菌过滤的上清液孵育期间被降解。

Iwabuchi,S.and Yamauchi,F.(1987):Determination of glycinin andβ-conglycinin in soybean proteins by immunological methods.J.Agric.FoodChem.35,200-205。