一种与卵形鲳鲹抗刺激隐核虫病相关性状的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明属于鱼类遗传育种分子标记辅助育种技术领域，具体涉及一种与卵形鲳鲹抗刺激隐核虫病相关性状的SNP分子标记及其应用。

背景技术

卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)在分类学上隶属于鲈形目(Perciformes)、鲹科(Carangidae)、鲳鲹属(Trachinotus)，俗称金鲳、黄腊鲳、短鲳鲹等，主要分布于我国南方海域。卵形鲳鲹肉质厚实细嫩，味道鲜美，生长速度快，是兼具营养价值和经济价值的可食用海水硬骨鱼类。但由于养殖密度过大、海域水质恶化等因素的影响，卵形鲳鲹养殖海域会爆发各种病害从而导致巨大的经济损失，而刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)病就是对卵形鲳鲹养殖业造成严重影响的病害之一，被刺激隐核虫感染的卵形鲳鲹死亡率极高，因此，研究如何提高卵形鲳鲹对刺激隐核虫的抗性十分必要。

近年来，由于环境污染、病害频发等导致卵形鲳鲹自然种群严重衰退，种质严重退化等；同时卵形鲳鲹养殖群体的近亲繁殖、小规格亲本人工育苗等原因，导致卵形鲳鲹养殖种质严重退化，抗病力减弱，养殖性能下降等。以上问题严重制约了卵形鲳鲹养殖业的持续健康发展，因此卵形鲳鲹的良种选育工作亟需开展。分子标记辅助选择育种是良种选育的方法之一，与目标性状基因紧密连锁的分子标记可以用来对目标性状进行关联分析，可以明确候选的分子标记与个体表型间的紧密关联，进一步缩短育种年限。

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)是一种遗传标记，因其具有数量多分布广、富有代表性、遗传稳定性高、易于实现自动化分析的特点，被看作最具发展潜力的分子标记。SNP的应用也十分广泛，可用于遗传图谱构建、性状基因关联性分析、种质鉴定和亲缘关系分析、辅助育种等方面，其中SNP与性状基因关联性分析不仅可以揭示SNP与基因性状之间的联系，还可以根据SNP位点和实际的育种需求进行分子育种，益处良多。朱克诚等人对卵形鲳鲹MHCⅡβ基因与美人鱼发光杆菌易感性/抗感性的多态性进行分析，发现卵形鲳鲹MHCⅡβ基因中TO-DAB-04，TO-DAB-05和TO-DAB-10这3个多态性位点与对美人鱼发光杆菌易感性显著相关，TO-DAB-01位点与对美人鱼发光杆菌抗感性具有显著关联性，TO-DAB-01位点可以为抗病育种实际应用提供参考。

目前在卵形鲳鲹抗刺激隐核虫病遗传育种方面开展的工作较少，SNPs具有高多态性，分布广泛等众多优点，在鱼类遗传育种中具有广泛的应用前景。目前，还未见与卵形鲳鲹抗刺激隐核虫病性状相关的基因位点的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与卵形鲳鲹抗刺激隐核虫病相关性状的SNP分子标记以及用于扩增所述SNP分子标记的引物。

本发明目的还在于上述的SNP分子标记或上述的引物在鉴别或选育抗刺激隐核虫病卵形鲳鲹品种方面的应用。

本发明的最后一个目的在于提供上述SNP分子标记的获取方法以及一种抗刺激隐核虫病卵形鲳鲹的鉴别方法。

本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种与卵形鲳鲹抗刺激隐核虫病相关性状的SNP分子标记，所述SNP分子标记为SNP6200或SNP6237，所述SNP6200位于LAAO基因如SEQ ID NO：1所示的碱基序列自5’端起的第6200位，其碱基为C或T，所述SNP6237位于LAAO基因如SEQ ID NO：1所示的碱基序列自5’端起的第6237位，其碱基为G或A。

本发明中的SNP分子标记由卵形鲳鲹LAAO基因中克隆得到，位于LAAO基因外显子中，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，在该序列的6200位和6237位碱基处分别存在两个等位基因突变(C/T)和(G/A)，这两个突变分别引起酪氨酸沉默和由甘氨酸突变为亮氨酸。

在该SNP分子标记中，第6200位的TT基因型个体比CC基因型个体更加抗感，即第6200位的TT基因型个体的抗刺激隐核虫病能力高于CC基因型个体；第6237位的AA基因型个体比GG基因型个体更加抗感，即第6237位的AA基因型个体的抗刺激隐核虫病能力高于GG基因型个体。

本发明还提供了用于扩增上述SNP分子标记的引物，所述引物为引物对SNP6200或SNP6237，所述引物对SNP6200的上、下游引物的碱基序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示，所述引物对SNP6237的上、下游引物的碱基序列分别如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示。

其中引物对SNP6200用于扩增第6200位SNP分子标记，引物对SNP6237用于扩增第6237位SNP分子标记。

具体的：

用于扩增SNP6200分子标记的上游引物To__LAAO-G-F1的碱基序列如下：

5’-TGAAACGGTAAGACGCTC-3’，

用于扩增SNP6200分子标记的下游引物To_LAAO-G-R1的碱基序列如下：

5’-GTCAGACCAGGTGTAGGAA-3’(PCR扩增长度为3841bp)；

用于扩增SNP6237分子标记的上游引物To_LAAO-G-F2的碱基序列如下：

5’-CAGCCAGTCAGATAAAGG-3’；用于扩增SNP6237分子标记的下游引物To_LAAO-G-R2的碱基序列如下：

5’-CCATAATACCCAAGAACC-3’(PCR扩增长度为926bp)

本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：上述的SNP分子标记或上述的引物在鉴别或选育抗刺激隐核虫病卵形鲳鲹品种方面的应用。

本发明的最后一个目的可以通过以下技术方案来实现：上述SNP分子标记的获取方法，包括以下步骤：

(1)提取卵形鲳鲹个体的基因组DNA；

(2)根据卵形鲳鲹LAAO基因组序列，设计上述引物对SNP6200或引物对SNP6237，进行PCR扩增；

(3)扩增后使用琼脂糖凝胶电泳检测，对凝胶图中有均一条带的样品进行测序，根据测序峰图判断潜在的SNPs位点；

(4)对SNPs位点进行基因分型，发现LAAO基因的外显子存在两个SNP位点，分别将其命名为SNP6200位点和SNP6237位点。

其中：

优选的，步骤(1)中提取卵形鲳鲹个体的基因组DNA时，采用MagenDNA提取试剂盒(D6310-03B)。

优选的，步骤(2)中PCR扩增时，PCR反应体系总体积为100μL：双蒸水76μL，10×PCR(TaKaRa)缓冲液10μL(含Mg

优选的，步骤(2)中PCR扩增时，PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环(长片段>3kb:94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸90s，30个循环)；72℃延伸10min，10℃保存。

优选的，步骤(3)中使用1％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳检测。

本发明还提供了一种抗刺激隐核虫病卵形鲳鲹的鉴别方法，包括以下步骤：

(1)提取卵形鲳鲹的基因组DNA；

(2)采用上述的引物对SNP6200或引物对SNP6237进行PCR扩增，获得PCR产物；

(3)对扩增后产物进行基因分型，对SNP位点的基因型和等位基因的频率分布进行统计，再对SNP位点与抗刺激隐核虫性状的关联度进行检验，得出两者间是否存在显著性差异。

在该抗刺激隐核虫病卵形鲳鲹的鉴别方法中：

优选的，步骤(3)中利用Excel 2016对SNP位点的基因型和等位基因的频率分布进行统计，再采用SPSS Statistics 17.0软件对SNP位点与抗刺激隐核虫性状的关联度进行卡方检验，得出两者间是否存在显著性差异。

优选的，步骤(3)中SNP6200位点的TT基因型个体比CC基因型个体更加抗感(P<0.05)，SNP6237位点的AA基因型个体比GG基因型个体更加抗感(P<0.05)。

优选的，步骤(3)中SNP6200位点的TT基因型个体和SNP6237位点的AA基因型个体为抗刺激隐核虫病卵形鲳鲹品种。

本发明具有以下有益效果：

(1)本发明从LAAO基因筛选得到与卵形鲳鲹抗刺激隐核虫病相关性状的SNP分子标记，为卵形鲳鲹抗病品种的培育提供有用的遗传标记；

(2)本发明筛选的分子标记对卵形鲳鲹抗刺激隐核虫病性状进行了关联分析，本发明的两个标记可应用于以抗病性状为目标的卵形鲳鲹育种材料早期筛选，能够有效提高育种的效率和缩短育种年限。

附图说明

图1为实施例1中卵形鲳鲹SNP6200的测序峰图；

图2为实施例1中卵形鲳鲹SNP6237的测序峰图。

具体实施方式

下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案，以便本领域技术人员更好理解和实施本发明的技术方案。实施例中所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1

本实施例提供的与卵形鲳鲹抗刺激隐核虫病相关性状的SNP分子标记，所述SNP分子标记为SNP6200或SNP6237，所述SNP6200位于LAAO基因如SEQ ID NO：1所示的碱基序列自5’端起的第6200位，其碱基为C或T，所述SNP6237位于LAAO基因如SEQ ID NO：1所示的碱基序列自5’端起的第6237位，其碱基为G或A。

LAAO基因如SEQ ID NO：1所示的碱基序列的第6200位的TT基因型个体比CC基因型个体更加抗感，即第6200位的TT基因型个体的抗刺激隐核虫病能力高于CC基因型个体；第6237位的AA基因型个体比GG基因型个体更加抗感，即第6237位的AA基因型个体的抗刺激隐核虫病能力高于GG基因型个体。

用于扩增上述SNP分子标记的引物，所述引物为引物对SNP6200或SNP6237，所述引物对SNP6200的上、下游引物的碱基序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示，所述引物对SNP6237的上、下游引物的碱基序列分别如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示。

该SNP分子标记通过以下步骤获得：

(1)随机分别选取10个卵形鲳鲹个体的基因组DNA，采用MagenDNA提取试剂盒(D6310-03B)；

(2)依据文献Zhang et al.,(2019)来调取卵形鲳鲹LAAO基因组序列，设计扩增该基因的基因组序列引物，并以To_LAAO-G-F1(用于扩增SNP6200分子标记的上游引物)5’-TGAAACGGTAAGACGCTC-3’，以及To_LAAO-G-R1(用于扩增SNP6200分子标记的下游引物):5’-GTCAGACCAGGTGTAGGAA-3’(3841bp，引物对SNP6200扩增的长度)或To_LAAO-G-F2(用于扩增SNP6237分子标记的上游引物):5’-CAGCCAGTCAGATAAAGG-3’，To_LAAO-G-R2(用于扩增SNP6237分子标记的下游引物):5’-CCATAATACCCAAGAACC-3’(926bp，引物对SNP6237扩增的长度)；

(3)采用100μL反应体系(双蒸水76μL，10×PCR(TaKaRa)缓冲液10μL(含Mg

(4)扩增后使用1％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶图中有均一条带的样品送往广州睿博兴科生物技术有限公司测序，根据测序峰图判断潜在的SNPs位点；

卵形鲳鲹SNP6200的测序峰图如图1所示；

卵形鲳鲹SNP6237的测序峰图如图2所示；

(5)根据PCR测序等方法对SNPs位点在上述10个个体中进行基因分型，结果发现LAAO基因的外显子存在2个SNP位点，分别将其命名为SNP6200和SNP6237。

实施例2

利用上述SNP分子标记或引物进行卵形鲳鲹抗刺激隐核虫病的鉴别方法，包括以下步骤：

(1)选取卵形鲳鲹的基因组DNA；

(2)采用实施例1中的引物对SNP6200或SNP6237进行PCR扩增，获得PCR产物；

(3)对PCR产物进行测序，分析基因型，根据基因型不同判断卵形鲳鲹是否属于抗刺激隐核虫病。

具体包括以下过程：

挑选健康的卵形鲳鲹1600尾，随机平均分成对照组和实验组，分别放在两个20m

利用Excel 2016对SNP位点的基因型和等位基因的频率分布进行统计，再采用SPSS Statistics 17.0软件对SNP位点与抗刺激隐核虫性状的关联度进行卡方检验，得出两者间是否存在显著性差异。。

通过下表1中的关联分析结果可以看出，SNP6200位点的TT基因型个体比CC基因型个体更加抗感(P<0.05)；SNP6237位点的AA基因型个体比GG基因型个体更加抗感(P<0.05)。

因此，SNP6200位点的TT基因型个体和SNP6237位点的AA基因型个体。

表1卵形鲳鲹LAAO基因的不同基因型与抗病性状的关联分析

注：不同的字母表示差异显著性，P<0.05表示差异显著。

以上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。所属技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容均可实现本发明的目的，任何基于本发明构思基础上做出的改进和变形，均落入本发明的保护范围之内，具体保护范围以权利要求书记载的为准。