一种利用灵芝废渣发酵生产壳聚糖的方法

技术领域

本发明属于壳聚糖制备技术领域，具体地，涉及一种利用灵芝废渣发酵生产壳聚糖的方法。

背景技术

壳聚糖是由甲壳素经脱乙酰基作用，脱去C2上的乙酰基得到，又名脱乙酰甲壳素，聚氨基葡萄糖等，其化学名称为β-(1，4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡聚糖。壳聚糖能和多种物质(如胆固醇、脂肪、重金属、蛋白质、肿瘤细胞等)结合；无毒且有生物相容性，广泛应用于食品添加剂、纺织、农业、美容保健、抗菌剂、医疗等众多领域；目前市场上的壳聚糖基本都来源于海洋节肢动物的壳，鲜有植物源性的壳聚糖。动物源壳聚糖在生产工艺大量使用酸碱，对设备腐蚀严重，在处理酸碱的过程中极易造成环境污染和资源浪费，并且原料来源受季节和产地的影响较大，储存不当易发生腐败，且容易滋生有害微生物。

一直以来人们对于灵芝的应用主要集中在灵芝多糖类水溶性成分和灵芝三萜类脂溶性成分，在生产上述两类物质的过程中会产生大量的富含甲壳素的灵芝废渣，如不综合利用，一方面造成了二次固体污染，另一方面没能实现物尽其用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用灵芝废渣发酵生产壳聚糖的方法，解决了现有技术中存在的灵芝加工后废料利用不充分，动物源壳聚糖生产过程化学药品使用量大、污染环境和浪费资源的问题。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种利用灵芝废渣发酵生产壳聚糖的方法，具体包括以下步骤：

步骤S1、原料预处理：将灵芝废渣用纯净水洗净、干燥后，粉碎处理并过40目筛，得到灵芝废渣粉；

步骤S2、制备发酵培养基：向纯净水中加入蔗糖、硝酸铵、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾，充分搅拌溶解后，均匀喷洒到灵芝废渣粉的表面，喷洒期间需要不断搅拌，然后在121.3℃条件下进行蒸汽灭菌处理30mi n，冷却后得到发酵培养基；

步骤S3、固体发酵：向发酵培养基中以1.0×10

步骤S4、酸提和脱色：向灵芝发酵物中加入乙酸溶液，在50-60℃条件下搅拌提取2-3h，过滤收集滤液，向滤液中加入双氧水，在50-60℃条件下保温1h进行脱色，过滤后得到脱色滤液；

步骤S5、离心沉淀：用质量分数为40％的氢氧化钠溶液调节脱色滤液的pH至8-9，静置、离心后收集不溶物，并用纯净水清洗2-3次，将收集到的不溶物冻干或真空烘干，即得壳聚糖。

进一步地，步骤S2中所述蔗糖、硝酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、纯净水和灵芝废渣粉的质量比为15:6:0.6:0.4:1000:3000；所述蔗糖为发酵培养基的碳源，所述硝酸铵为发酵培养基的氮源，所述磷酸氢二钾和磷酸二氢钾为发酵培养基的缓冲盐体系。

进一步地，步骤S3中所述蓝色犁头霉发酵液，由以下方法制备而成：

步骤A1：将采购自中国普通微生物菌种保藏管理中心的蓝色犁头霉(编号CGMCCNO.3.7020)接种至PDA种子培养基中，30℃恒温培养72h，得到蓝色犁头霉种子；

步骤A2：将蓝色犁头霉种子用无菌水配制成孢子悬液，按照1.0×10

进一步地，所述PDA种子培养基由以下方法配制而成：

将200g去皮土豆切成小块，加纯净水1000mL煮烂，趁热用纱布过滤，得到土豆滤液，向土豆滤液中加入20g葡萄糖和20g琼脂，补纯净水至1000mL，电炉小火加热至琼脂完全溶解，不断搅拌以免糊底，然后趁热分装至若干个500mL的三角瓶中，每瓶装入150mL，封口膜包扎瓶口后，使用灭菌锅灭菌处理20min，冷却后备用。

进一步地，所述扩大培养基由以下方法配制而成：

称取酵母膏10g、蛋白胨10g、葡萄糖20g，加入到1000mL纯净水中，混合均匀后，分装至若干个500mL的三角瓶中，每瓶装入250mL，封口膜包扎瓶口后，使用灭菌锅灭菌处理20min，冷却后备用。

进一步地，步骤S4中所述灵芝发酵物和乙酸溶液的料液质量比为1:5，所述乙酸溶液的质量分数为2-10％；所述双氧水用量为滤液体积的1-2％，双氧水的质量分数为30％。

本发明的有益效果：

本发明以灵芝加工后的灵芝废渣作为原料，实现了废物的综合利用，且来源新颖，充分利用灵芝资源，解决了现有技术中灵芝加工后废料利用不充分的问题，同时对于开发植物源壳聚糖的生产工艺具有积极的意义；

本发明不同于传统的热化学法壳聚糖生产工艺，本发明采用微生物固体发酵培养，利用蓝色犁头霉菌在发酵过程中产生的甲壳素脱乙酰基酶，可以特异性地脱去甲壳素C2上的乙酰基，完成对灵芝废渣中甲壳素的脱乙酰基反应，且酶法得到的壳聚糖具有更高的匀质度，反应条件温和，不产生危害环境的废弃物，实现绿色生产；

本发明通过向灵芝发酵物中加入乙酸溶液，将产生的壳聚糖溶解于乙酸溶液中，过滤后再使用双氧水进行脱色，过滤后得到脱色滤液，最后使用氢氧化钠调节pH并将壳聚糖沉淀析出，分离、清洗、干燥后即得到壳聚糖产品，整体处理工艺简单易实施，绿色环保，无废弃物产生，去乙酰度＞85％，产品纯度高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明利用灵芝废渣发酵生产壳聚糖的工艺流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种蓝色犁头霉发酵液，由以下方法制备而成：

步骤A1：将采购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)的蓝色犁头霉(编号CGMCC NO.3.7020)接种至PDA种子培养基中，30℃恒温培养72h，得到蓝色犁头霉种子；

所述PDA种子培养基由以下方法配制而成：

将200g去皮土豆切成小块，加纯净水1000mL煮烂，趁热用纱布过滤，得到土豆滤液，向土豆滤液中加入20g葡萄糖和20g琼脂，补纯净水至1000mL，电炉小火加热至琼脂完全溶解，不断搅拌以免糊底，然后趁热分装至若干个500mL的三角瓶中，每瓶装入150mL，封口膜包扎瓶口后，使用灭菌锅灭菌处理20min，冷却后得到；

步骤A2：将蓝色犁头霉种子用无菌水配制成孢子悬液，按照1.0×10

所述扩大培养基由以下方法配制而成：

称取酵母膏10g、蛋白胨10g、葡萄糖20g，加入到1000mL纯净水中，混合均匀后，分装至若干个500mL的三角瓶中，每瓶装入250mL，封口膜包扎瓶口后，使用灭菌锅灭菌处理20min，冷却后得到。

实施例2

请参阅图1所示，该实施例为利用灵芝废渣发酵生产壳聚糖的方法，具体包括以下步骤：

步骤S1、将灵芝废渣用纯净水洗净、干燥后，粉碎处理并过40目筛，称取300g灵芝废渣粉；

步骤S2、向100g纯净水中加入1.5g蔗糖、0.6g硝酸铵、0.06g磷酸氢二钾和0.04g磷酸二氢钾，充分搅拌溶解后，均匀喷洒到灵芝废渣粉的表面，然后使用灭菌锅对灵芝废渣粉进行灭菌处理15min，冷却后得到发酵培养基；

步骤S3、将实施例1制得的蓝色犁头霉发酵液按照1×10

步骤S4、按照料液质量比为1:5的比例，向灵芝发酵物中加入质量分数为10％的乙酸溶液，50℃条件下搅拌提取3h，过滤收集滤液，向滤液加入质量分数为30％的双氧水，双氧水用量为滤液体积的1％，在50℃条件下保温1h进行脱色，得到脱色滤液；

步骤S5、用质量分数为40％的氢氧化钠溶液调节脱色滤液的pH至8，离心收集不溶物，并用纯净水清洗2次，将不溶物冷冻干燥，得到18.3g壳聚糖，呈灰白色。

实施例3

请参阅图1所示，该实施例为利用灵芝废渣发酵生产壳聚糖的方法，具体包括以下步骤：

步骤S1、将灵芝废渣用纯净水洗净、干燥后，粉碎处理并过40目筛，称取3kg灵芝废渣粉；

步骤S2、向1kg纯净水中加入15g蔗糖、6g硝酸铵、0.6g磷酸氢二钾和0.4g磷酸二氢钾，充分搅拌溶解后，均匀喷洒到灵芝废渣粉的表面，喷洒期间需要不断翻搅，然后在121.3℃条件下进行蒸汽灭菌30min，冷却后得到发酵培养基；

步骤S3、将实施例1制得的蓝色犁头霉发酵液按照1.0×10

步骤S4、按照料液质量比为1:5的比例，向灵芝发酵物中加入质量分数为6％的乙酸溶液，55℃条件下搅拌提取2h，过滤收集滤液，向滤液中加入质量分数为30％的双氧水，双氧水用量为滤液体积的2％，在55℃条件下保温1h进行脱色，得到脱色滤液；

步骤S5、用质量分数为40％的氢氧化钠溶液调节脱色滤液的pH至8.5，离心收集不溶物，并用纯净水清洗3次，将收集到的不溶物真空烘干，得到153g壳聚糖，呈灰白色。

实施例4

请参阅图1所示，该实施例为利用灵芝废渣发酵生产壳聚糖的方法，具体包括以下步骤：

步骤S1、将灵芝废渣用纯净水洗净、干燥后，粉碎处理并过40目筛，称取30kg灵芝废渣粉；

步骤S2、向10kg纯净水中加入150g蔗糖、60g硝酸铵、6g磷酸氢二钾和4g磷酸二氢钾，充分搅拌溶解后，均匀喷洒到灵芝废渣粉的表面，喷洒期间配合搅拌喷洒均匀，然后在121.3℃条件下进行蒸汽灭菌30min，冷却后得到发酵培养基；

步骤S3、将实施例1制得的蓝色犁头霉发酵液按照1.0×10

步骤S4、按照了也质量比为1:5的比例，向灵芝发酵物中加入质量分数为2％的乙酸溶液，60℃条件下搅拌提取3h，过滤收集滤液，向滤液中加入质量分数为30％的双氧水，双氧水用量为滤液体积的2％，在60℃条件下保温1h进行脱色，得到脱色滤液；

步骤S5、用质量分数为40％的氢氧化钠溶液调节脱色滤液的pH至9，静置24h待不溶物沉淀，收集混有沉淀部分的滤液，离心收集不溶物，并用纯净水清洗3次，将收集到的不溶物冷冻干燥，得到1.3kg壳聚糖，呈灰白色。

对比例1

该对比例为中国专利CN108017724B公开的制备方法，在该专利实施例2中40wt％NaOH溶液条件下制备得到的壳聚糖。

采用酸碱滴定法测定实施例2-4和对比例1制备得到的壳聚糖的去乙酰度，测定结果如下表1所述：

表1

由表1数据可知，实施例2-4制得的壳聚糖与对比例1制得的壳聚糖具有更高的去乙酰度，通过蓝色犁头霉菌发酵的方法，更有利于将灵芝废渣中的甲壳素转化为壳聚糖。

在说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。