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一种高效组织特异性表达RS1蛋白的重组腺相关病毒及应用

文献发布时间：2023-06-19 12:24:27

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种高效组织特异性表达RS1蛋白的重组腺相关病毒及应用。

背景技术

X连锁的青少年视网膜劈裂症(X-Linked juvenile Retinoschisis，XLRS)是一种X染色体连锁的罕见的遗传性致盲眼病，通常是从男性幼年时期开始出现视力低下以及出现严重的并发症，一直发展到老年时期，且病情逐步恶化。在全球范围内，XLRS发病率约为1:5000～1:25000。XLRS主要累及双侧视网膜，在视网膜神经纤维层和神经节细胞层之间出现劈裂腔。XLRS患者初期的视网膜电图(electroretinogram，ERG)反应中暗适应的b波振幅下降，而a波振幅通常保持正常。由于a波来源于光感受器，这表明初期光感受器的活性相对正常，而b波来源于靠近光感受器的双极细胞，其中的Müller细胞是构成视网膜的重要部分，胞体在内核层，轴突贯穿于视网膜各层，b波就是来源于Müller细胞的去极化过程，XLRS会导致Müller细胞变性，导致负性b波说明突触传递过程存在缺陷。在有视网膜病变家族史的男性中发现这种ERG表型是XLRS的临床诊断的关键。随着XLRS疾病恶化，劈裂程度加深，范围扩大，a波振幅也会出现降低，但是由于b波振幅严重降低，b/a比值仍略小于正常，此时ERG仍可作为诊断的方式，但XLRS晚期a波和b波均出现重度异常，b/a比值稍显正常。XLRS诊断的特征性指标为典型的黄斑区车轮状劈裂和ERG b/a比值下降。目前针对XLRS的临床治疗仍以观察及并发症治疗为主，尚无有效的治疗方法，患者的最终结局多为视力丧失(PubMed：30578483)。

X连锁的青少年性视网膜劈裂症的致病基因为Retinoschisin 1(RSl)基因。该基因定位于Xp22.1-p22.2，由6个外显子构成，编码224个氨基酸，有16000余个碱基对。根据人类基因突变数据库(

腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)载体介导的基因治疗技术已日趋成熟：2012年，欧洲批准了第一个基于AAV的基因治疗产品Glybera，其为治疗脂蛋白脂酶缺乏症的AAV1-LDL载体；2017年，美国FDA批准了首个针对遗传性视力丧失的AAV基因治疗药物Luxturna，用于治疗RPE65基因突变引起的视网膜营养不良症；2019年，美国FDA又批准了另外一款用于脊髓性肌萎缩症的AAV基因治疗药物Zolgensma；目前，包括眼科等各个方面有多个AAV基因治疗产品正在进行不同阶段的临床试验(PubMed：33309881)。

由于AAV为单链DNA病毒，所以单链AAV(Single-strand AAV,ssAAV)必须首先完成单链基因组向有转录活性的双链形式的转变，然后才能开始表达，这一过程会限制AAV载体介导的外源基因的转导，并且会影响外源基因的表达效率。自身互补的双链DNA的AAV(Self-complementary AAV,scAAV)可以克服这一限制，由于不需要经历由单链变为双链的过程，因此scAAV进入细胞后可以直接表达，并且表达时间更快且表达水平更高(PubMed：18682697)。

针对XLRS基因治疗的现有技术大多使用广谱启动子如CMV启动子，不能实现目的蛋白的组织特异性表达，对治疗效果存在一定的限制。另外非组织特异性表达会增加AAV载体的用量，会增加免疫的风险。而且有研究发现，广谱的启动子(如CMV启动子)对眼部的光感受器和视网膜色素上皮细胞存在毒性，而光感受器细胞特异性启动子Rhodopsin Kinase(RK)启动子对眼部细胞没有毒性(PubMed：30833387)。对于XLRS基因治疗来说，不仅要考虑治疗的有效性，由于患者多自幼年发病，所以在考虑有效性的同时，如何实现药物治疗的长效性，是提高患者依从性的关键，也是目前急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种优化后的RS1基因、包含该基因的表达盒和载体及其应用。

本发明的另一目的是提供一种高效组织特异性表达RS1蛋白的重组腺相关病毒及应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种RS1蛋白表达框，由启动子-目的基因序列-聚腺苷酸化(polyadenylation，polyA)信号组成，其中，所述的启动子选自RK启动子，目的基因选自野生型RS1基因或密码子优化的RS1基因，polyA信号序列选自rBG(rabbit beta-globin)或bGH(bovine growthhormone)中的任意一种。

作为本发明的一种优选，所述的经密码子优化的RS1基因核苷酸序列如SEQ IDNO.4中645-1319bp所示。

作为本发明的一种优选，所述的启动子选自RK启动子，polyA选自bGH。

作为本发明的一种优选，启动子、目的基因序列和polyA之间通过键或核苷酸连接序列连接。核苷酸连接序列可选自内含子(intron)序列等连接序列。

作为本发明的一种优选，所述的RS1蛋白表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

一种载体，含有本发明所述的RS1蛋白表达框。

作为本发明的一种优选，所述载体为重组腺相关病毒载体,优选为scAAV。

作为本发明的进一步优选，所述载体选自以下任意一种重组腺相关病毒载体血清型：重组腺相关病毒载体血清型包括AAV1、AAV2、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10，优选AAV2、AAV5、AAV8或AAV9。

作为本发明的更进一步优选，所述的载体全序列如SEQ ID NO.4所示。

一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明所述的载体，或其染色体中整合有外源的如本发明所述的RS1基因或本发明所述的RS1蛋白表达框。

作为本发明的一种优选，所述宿主细胞为哺乳动物细胞,所述哺乳动物包括人或非人哺乳动物。

作为本发明的进一步优选，所述宿主细胞为视网膜细胞和/或视神经细胞。

在一些优选例中,所述宿主细胞选自下组:HEK293细胞、感光细胞(包括锥状细胞和/或杆状细胞)、其他视觉细胞(如双节细胞)、(视)神经细胞、或其组合。

在另一优选例中,所述宿主细胞选自下组:视杆细胞、视锥细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞、无长突细胞、视神经细胞、或其组合。较佳地,所述宿主细胞为感光细胞(光感受器细胞)、双极细胞、视神经细胞、或其组合。

一种组织特异性表达RS1蛋白的重组腺相关病毒，是采用转染试剂将AAV的Rep及Cap蛋白表达质粒、辅助质粒和本发明所述的载体共转染HEK293细胞包装制备得到。

作为本发明的一种优选，所述的AAV的Rep及Cap蛋白表达质粒选自pAAV2/8。

作为本发明的一种优选，所述的辅助质粒选自pAdΔF6。

本发明所述的RS1基因、所述的RS1蛋白表达框或所述的载体、所述的重组腺相关病毒在制备用于治疗X连锁的青少年视网膜劈裂症的长效药物中的应用。

一种药物制剂，所述的制剂含有本发明所述的载体或所述的重组腺相关病毒，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明所述的药物制剂的注射方式为玻璃体腔或视网膜下腔注射。

有益效果：

本发明对RS1蛋白基因进行密码子优化，结合对基因表达框中启动子、polyA序列的优化，利用重组腺相关病毒作为基因递送载体，我们首先使用了广谱启动子CB7，制备了ssAAV8病毒载体，体内实验中显示在RS1基因敲除(RS1-KO)的XLRS疾病模型小鼠中有治疗效果，但是治疗效果有限，在8周龄小鼠中的疗效远低于2周龄小鼠，并且在不同周龄的小鼠中，治疗效果随着时间的增加均发生了显著的下降，无法实现长效治疗效果。随后我们使用了scAAV8携带组织特异性启动子RK，在视网膜或神经节细胞中，实现RS1蛋白的组织特异性高效且持续的表达，降低达到X连锁的青少年视网膜劈裂症有效性的AAV病毒所需要的剂量，1×10

附图说明

图1 ssAAV8.CB7.EGFP.bGH病毒基因组及病毒包装质粒示意图

图2 scAAV8.RK.EGFP.bGH病毒基因组及病毒包装质粒示意图

图3 ssAAV8.CB7.cohRS1.rBG病毒基因组及病毒包装质粒示意图

图4 scAAV8.RK.cohRS1.bGH病毒基因组及病毒包装质粒示意图

图5 ssAAV8.CB7.EGFP.bGH和scAAV8.RK.EGFP.bGH病毒包装质粒体外表达的特异性比较

图6 RS1-KO疾病模型小鼠的构建

图7 ssAAV8.CB7.cohRS1.rBG治疗不同周龄的RS1-KO疾病模型小鼠ERG检测结果比较

图8 scAAV8.RK.cohRS1.bGH治疗不同周龄的RS1-KO疾病模型小鼠ERG检测结果比较

图9 scAAV8.RK.cohRS1.bGH治疗不同周龄的RS1-KO疾病模型小鼠体内表达情况检测

图10 scAAV8.RK.cohRS1.bGH治疗不同周龄的RS1-KO疾病模型小鼠视网膜组织形态恢复情况

具体实施方式

实施例1表达载体构建

本发明首先对RS1基因进行了密码子优化，核苷酸序列如SEQ ID NO.4中645-1319bp所示。在对RS1进行优化的基础上，本发明设计了四个表达框，AAV病毒载体基因组示意图与AAV病毒包装顺式质粒图谱分别如图1-4所示。全序列合成四个病毒包装顺式质粒载体。

ssAAV8.CB7.EGFP.bGH病毒包装质粒(简称pAAVss.CB7.EGFP.bGH)，质粒全序列如SEQ ID NO.1所示，主要功能元件位点：1-168为5’端反向末端重复序列(ITR)，241-899为CB7启动子序列，900-1916为intron序列，1982-2701为EGFP基因序列，2717-2941为bGHpolyA序列，2992-3159为3’端ITR序列。

scAAV8.RK.EGFP.bGH病毒包装质粒(简称pAAVsc.RK.EGFP.bGH)，质粒全序列如SEQ ID NO.2所示，主要功能元件位点：1-105为5’端self-complementary ITR(scITR)序列，143-438为RK启动子序列，487-583为intron序列，645-1364为EGFP基因序列，1380-1604为bGH polyA序列，1665-1822为3’端ITR序列。

ssAAV8.CB7.cohRS1.rBG病毒包装质粒(简称pAAVss.CB7.cohRS1.rBG)，质粒全序列如SEQ ID NO.3所示，主要功能元件位点：1-168为5’端ITR序列，241-899为CB7启动子序列，993-1965为intron序列，1983-2654为人源RS1蛋白经密码子优化后的目的基因序列，2655-2723为HA和OLLAS标签序列，2738-3332为WPRE元件序列，3373-3499为rBG polyA序列，3547-3714为3’端ITR序列。

scAAV8.RK.cohRS1.bGH病毒包装质粒(简称pAAVsc.RK.cohRS1.bGH)，质粒全序列如SEQ ID NO.4所示，主要功能元件位点：1-105为5’端scITR序列，143-438为RK启动子序列，487-583为intron序列，645-1319为人源RS1蛋白经密码子优化后的目的基因序列，1335-1559为bGH polyA序列，1610-1777为3’端ITR序列。

实施例2病毒包装质粒体外表达的特异性比较

将实施例1中的pAAVss.CB7.EGFP.bGH和pAAVsc.RK.EGFP.bGH以相同的质粒量(2μg)转染培养于六孔板中的HEK293细胞和视神经母细胞瘤细胞Y79，48h后通过免疫荧光拍照观察EGFP的表达情况，结果显示表达pAAVss.CB7.EGFP.bGH在HEK293细胞和Y79细胞中均可以表达EGFP，而pAAVsc.RK.EGFP.bGH只会在Y79细胞中表达EGFP，这说明RK启动子可以实现组织特异性启动表达目的蛋白(图5)。

实施例3 AAV病毒制备与纯化

参考Martin Lock等报道包装和纯化重组AAV病毒的方法，采用PEIpro将AAV2的Rep及AAV8的Cap蛋白表达质粒(pAAV2/8)、辅助质粒(pAdΔF6)和AAV目的基因载体顺式质粒(pAAVss.CB7.cohRS1.rBG/pAAVsc.RK.cohRS1.bGH)共转染HEK293细胞包装制备病毒ssAAV8.CB7.cohRS1.rBG和病毒scAAV8.RK.cohRS1.bGH，转染144h后，收获细胞培养上清，切向过滤(TFF)浓缩病毒液后，使用碘克沙醇超速梯度离心纯化AAV病毒，收集纯化后的AAV病毒，使用Amicon Ultra 100K离心去盐，最后将AAV病毒置于20mM Tris(pH8.0),1mMMgCl

实施例4：RS1-KO疾病模型小鼠的构建

我们通过CRISPR-Cas9基因敲除工具，将C57小鼠的RS1基因的外显子1-3序列进行移除后得到了RS1基因敲除(RS1-KO)鼠(图6a)。小鼠眼组织的Western blotting和免疫荧光结果(图6b和6c)显示RS1-KO鼠没有RS1蛋白的表达。免疫荧光和苏木素-伊红(HE)染色结果(图6c和6d)显示，与野生型(WT)小鼠相比RS1-KO小鼠的视网膜结构异常，内核层和外核层的视网膜存在裂隙腔，外核层中的光感受器细胞数量减少以及光感受器细胞定位异常，与人的XLRS疾病表型类似。暗适应ERG结果(图6e)显示，与4周龄的WT小鼠相比，4周龄的RS1-KO小鼠b波(b wave)波幅明显下降，在1.2log cd s/m

实施例5 ssAAV8.CB7.cohRS1.rBG治疗不同周龄的RS1-KO疾病模型小鼠ERG检测结果比较

分别在2周龄，8周龄的RS1-KO雄性小鼠的视网膜下腔注射1×10

实施例6 scAAV8.RK.cohRS1.bGH治疗不同周龄的RS1-KO疾病模型小鼠ERG检测结果比较

分别在2周龄，8周龄的RS1-KO雄性小鼠的视网膜下腔注射1×10

实施例7 scAAV8.RK.cohRS1.bGH治疗不同周龄的RS1-KO疾病模型小鼠体内表达情况检测

实施例6中的2周龄和8周龄治疗组小鼠在注射后4周检测完ERG后，处死小鼠并取眼球进行免疫荧光检测视网膜层中RS1蛋白和GFAP蛋白的表达情况，以注射PBS的RS1-KO疾病模型小鼠眼球作为阴性对照，结果(图9)显示RS1基因在2周龄和8周龄组小鼠治疗眼中均高表达且分布在视网膜感光细胞层(RS1染色)，而对照组眼组织中无RS1蛋白表达且可见内核层和外核层的视网膜存在明显的裂隙腔。同时治疗后能明显改善Müller细胞受损的情况(GFAP染色)。

实施例8 scAAV8.RK.cohRS1.bGH治疗不同周龄的RS1-KO疾病模型小鼠视网膜组织形态恢复情况

实施例6中的2周龄和8周龄治疗组小鼠在注射后4周检测完ERG后，处死小鼠并取眼球进行HE染色检测视网膜的组织形态恢复情况。如图10所示，在2周龄注射组中，治疗组的视网膜结构与WT的组织形态接近，相比于对照组具有更厚的光感受器层(视网膜50μm长度内的感光细胞数量均值±SEM：treated 112.89±7.95，control 66.00±4.11，p＜0.0001，n＝9)，并且治疗组相较于对照组，内核层的裂隙腔更少。在相同时间点检测的8周龄注射组中，治疗后小鼠的视网膜组织也有类似的结构改善，感光细胞数量也有明显的增加(视网膜50μm长度内的感光细胞数量均值±SEM：treated 101.20±6.35，control 51.80±5.80，p＜0.0005，n＝5)。综合ERG的检测结果说明，scAAV8.RK.cohRS1.bGH对RS1-KO疾病模型小鼠进行治疗后，能明显改善小鼠眼睛的组织学形态，并且可以有效恢复小鼠的视网膜功能。

序列表

<110> 成都金唯科生物科技有限公司

<120> 一种高效组织特异性表达RS1蛋白的重组腺相关病毒及应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5775

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta gccatgctct 180

aggaagatcg gaattcgccc ttaagagggt aatggggatc ctctagaact atagctagtc 240

gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 300

catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 360

acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 420

ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 480

aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 540

ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 600

tagtcatcgc tattaccatg gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct 660

cccccccctc cccaccccca attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga 720

tgggggcggg gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg 780

gcggggcgag gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc 840

cttttatggc gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg 900

gagtcgctgc gcgctgcctt cgccccgtgc cccgctccgc cgccgcctcg cgccgcccgc 960

cccggctctg actgaccgcg ttactcccac aggtgagcgg gcgggacggc ccttctcctc 1020

cgggctgtaa ttagcgcttg gtttaatgac ggcttgtttc ttttctgtgg ctgcgtgaaa 1080

gccttgaggg gctccgggag ggccctttgt gcggggggag cggctcgggg ggtgcgtgcg 1140

tgtgtgtgtg cgtggggagc gccgcgtgcg gctccgcgct gcccggcggc tgtgagcgct 1200

gcgggcgcgg cgcggggctt tgtgcgctcc gcagtgtgcg cgaggggagc gcggccgggg 1260

gcggtgcccc gcggtgcggg gggggctgcg aggggaacaa aggctgcgtg cggggtgtgt 1320

gcgtgggggg gtgagcaggg ggtgtgggcg cgtcggtcgg gctgcaaccc cccctgcacc 1380

cccctccccg agttgctgag cacggcccgg cttcgggtgc ggggctccgt acggggcgtg 1440

gcgcggggct cgccgtgccg ggcggggggt ggcggcaggt gggggtgccg ggcggggcgg 1500

ggccgcctcg ggccggggag ggctcggggg aggggcgcgg cggcccccgg agcgccggcg 1560

gctgtcgagg cgcggcgagc cgcagccatt gccttttatg gtaatcgtgc gagagggcgc 1620

agggacttcc tttgtcccaa atctgtgcgg agccgaaatc tgggaggcgc cgccgcaccc 1680

cctctagcgg gcgcggggcg aagcggtgcg gcgccggcag gaaggaaatg ggcggggagg 1740

gccttcgtgc gtcgccgcgc cgccgtcccc ttctccctct ccagcctcgg ggctgtccgc 1800

ggggggacgg ctgccttcgg gggggacggg gcagggcggg gttcggcttc tggcgtgtga 1860

ccggcggctc tagagcctct gctaaccatg ttcatgcctt cttctttttc ctacagctcc 1920

tgggcaacgt gctggttatt gtgctgtctc atcattttgg caaagaatta ccggtgccac 1980

catggtgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga 2040

cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta 2100

cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac 2160

cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa 2220

gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt 2280

cttcaaggac gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct 2340

ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca 2400

caagctggag tacaactaca acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa 2460

cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc 2520

cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca 2580

ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt 2640

cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaagta 2700

atgaacgcgt cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc 2760

gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa 2820

attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac 2880

agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg 2940

gcctcgagtt aagggcgaat tcccgataag gatcttccta gagcatggct acgtagataa 3000

gtagcatggc gggttaatca ttaactacaa ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc 3060

ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg 3120

ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc cttaattaac ctaattcact 3180

ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct 3240

tgcagcacat ccccctttcg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc 3300

ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt 3360

cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca 3420

ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 3480

aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 3540

cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 3600

cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 3660

gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt 3720

tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 3780

cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 3840

ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca 3900

gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc 3960

gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa 4020

accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa 4080

ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac 4140

tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta 4200

aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt 4260

tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg attatcaata 4320

ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat 4380

aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc aatacaacct 4440

attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg agtgacgact 4500

gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc agacttgttc aacaggccag 4560

ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac cgttattcat tcgtgattgc 4620

gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac aattacaaac aggaatcgaa 4680

tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat tttcacctga atcaggatat 4740

tcttctaata cctggaatgc tgttttccca gggatcgcag tggtgagtaa ccatgcatca 4800

tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca taaattccgt cagccagttt 4860

agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac ctttgccatg tttcagaaac 4920

aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg tcgcacctga ttgcccgaca 4980

ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca tgttggaatt taatcgcggc 5040

ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcatactct tcctttttca atattattga 5100

agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat 5160

aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc 5220

attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtctcgcg 5280

cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct 5340

tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc 5400

gggtgtcggg gctggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat 5460

atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgccattcg 5520

ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc 5580

cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt 5640

gagttagctc actcattagg caccccaggc tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt 5700

gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agctatgacc atgattacgc 5760

cagatttaat taagg 5775

<210> 2

<211> 4438

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtgtagcc atgctctagg 120

aagatcggaa ttcgccctta agggccccag aagcctggtg gttgtttgtc cttctcaggg 180

gaaaagtgag gcggcccctt ggaggaaggg gccgggcaga atgatctaat cggattccaa 240

gcagctcagg ggattgtctt tttctagcac cttcttgcca ctcctaagcg tcctccgtga 300

ccccggctgg gatttagcct ggtgctgtgt cagccccggt ctcccagggg cttcccagtg 360

gtccccagga accctcgaca gggcccggtc tctctcgtcc agcaagggca gggacgggcc 420

acaggccaag ggcggtactc tagaggatcc ggtactcgag gaactgaaaa accagaaagt 480

taactggtaa gtttagtctt tttgtctttt atttcaggtc ccggatccgg tggtggtgca 540

aatcaaagaa ctgctcctca gtggatgttg cctttacttc taggcctgta cggaagtgtt 600

acttctgctc taaaagctgc ggaattgtac ccgcggccgc caccatggtg agcaagggcg 660

aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc 720

acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga 780

agttcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga 840

cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca 900

agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca 960

actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc 1020

tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact 1080

acaacagcca caacgtctat atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact 1140

tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga 1200

acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt 1260

ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga 1320

ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa gtaatgaacg cgtcctcgac 1380

tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct 1440

ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct 1500

gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg 1560

ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atggcctcga gttaagggcg 1620

aattcccgat aaggatcttc ctagagcatg gctacgtaga taagtagcat ggcgggttaa 1680

tcattaacta caaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct 1740

cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct 1800

cagtgagcga gcgagcgcgc agccttaatt aacctaattc actggccgtc gttttacaac 1860

gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt 1920

tcgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg 1980

ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt 2040

atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa 2100

gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc 2160

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ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg 2460

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tgtaacatca ttggcaacgc tacctttgcc atgtttcaga aacaactctg gcgcatcggg 3600

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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