一种用于瞬时验证山楂基因功能的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于瞬时验证山楂基因功能的方法。

背景技术

研究基因的功能具有重要的意义。然而，多数果树的稳定转化较为困难，如果涉及果实的表型，耗时估计数年之久，山楂即是如此。因此，果树上基因功能的验证仍需要在模式植物拟南芥、烟草或者番茄‘Mico-Tom’中进行异源稳定过表达。稳定表达系统是指载体进入宿主细胞并经选择培养，载体DNA稳定存在于细胞内，可随细胞转录表达和传代，目的蛋白的表达持久、稳定。缺点是由于需抗性选择甚至加压扩增等步骤，稳定表达相对耗时耗力。

然而在拟南芥和烟草上的异源稳定过表达并不能观测到果实上的表型，而在番茄上的异源稳定过表达虽然能观测果实表型，但是拿到T3代纯合子花费的时间较长，并且由于植株的复杂性和异源性，并不能准确的体现基因的功能。瞬时表达系统是指宿主细胞在导入表达载体后不经选择培养，载体DNA随细胞分裂而丢失，目的蛋白的表达时限短暂。瞬时表达系统的优点是简捷，实验周期短。目前，没有发现适用于山楂果实表达相关基因功能的验证方法。

发明内容

本发明提供的一种用于瞬时验证山楂基因功能的方法，通过将重组质粒注射入山楂果实赤道处构建了山楂果实的瞬时转化体系，不需要遗传转化操作，又可以直接在果实上验证，是验证果实表达相关基因功能的较为理想的方法。

本发明提供一种用于瞬时验证山楂基因功能的方法，包括如下步骤：

S1，扩增标记基因山楂CpPDS片段，将其连接至TRV2载体上，获得CpPDS-TRV2重组质粒；

S2，将TRV1载体和CpPDS-TRV2重组质粒转化农杆菌；

S3，将S2中鉴定为阳性的菌摇培至OD

S4，将S3中获得的含有TRV1和CpPDS-TRV2重组质粒的农杆菌菌液按照体积比0.9-1.1：1混匀；

S5，在山楂盛花后120天进行注射，注射部位为果实赤道处，注射量为90-110μl。

进一步地，S3中，阳性的菌摇培至OD

进一步地，S4中，将含有TRV1和CpPDS-TRV2重组质粒的农杆菌菌液按照体积比1：1混匀。

进一步地，S5中，所述注射量为100μl。

进一步地，S2中，所述农杆菌为农杆菌GV3101。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明建立了山楂果实的瞬时转化体系，该体系的建立，为山楂基因功能分析和相关的转录调控、蛋白互作等分子生物学的研究，提供了良好的技术支撑。

2、本发明中利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)既不需要遗传转化操作,又可以直接在果实上验证，是验证果实表达相关基因功能的较为理想的方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明中实施例1中山楂果实VIGS体系构建验证图；

图2为本发明中实施例1中Vvs注射10天后果实中GPPS基因的表达量统计图；

图3为本发明中山楂果实发育期硬度的变化图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。

实施例1

本实施例提供一种用于瞬时验证山楂基因功能的方法，包括如下步骤：

S1，扩增标记基因山楂CpPDS片段，将其连接至TRV2载体上，获得CpPDS-TRV2重组质粒；

S2，分别将TRV1载体、TRV2载体和CpPDS-TRV2重组质粒转化农杆菌GV3101；

S3，将上步鉴定为阳性的菌摇培至OD

S4，分别将含有TRV1和TRV2载体的农杆菌菌液按照体积比1：1混匀作为对照组，将含有TRV1和CpPDS-TRV2重组质粒的农杆菌按照体积比1：1混匀后作为实验组；

S5，将S4获得的对照组和实验组菌液分别在山楂盛花后120天(9月初)进行注射，注射部位为果实赤道处，注射量为100μl。

实施例2

实施例2的具体步骤与实施例1相同，区别在于：

S3中，摇培至OD

实施例3

实施例3的具体步骤与实施例1相同，区别在于：

S3中，摇培至OD

实施例4

实施例4的具体步骤与实施例1相同，区别在于：

S5中，注射量为90μl。

实施例5

实施例5的具体步骤与实施例1相同，区别在于：

S5中，注射量为110μl。

实施例6

实施例6的具体步骤与实施例1相同，区别在于：

S4中，含有TRV1和TRV2载体的农杆菌体积比为0.9：1。

实施例7

实施例7的具体步骤与实施例1相同，区别在于：

S4中，含有TRV1和TRV2载体的农杆菌体积比为1.1：1。

实施例8

实施例8的具体步骤与实施例1相同，区别在于：

S4中，含有TRV1和CpPDS-TRV2重组质粒的农杆菌体积比为0.9：1。

实施例9

实施例9的具体步骤与实施例1相同，区别在于：

S4中，含有TRV1和CpPDS-TRV2重组质粒的农杆菌体积比为1.1：1.

以上实施例1-9为本发明的具体实施例，上述实施例最终获得的结果基本一致，以实施例1为代表，分别在果实注射当天，注射后10天、15天和25天观察记录山楂果实的表型变化；

结果如图1所示，注射当天，我们注射TRV1和TRV2混合菌液作为对照，注射了TRV1和TRV2-CpPDS混合菌液作为处理组，注射当天，果实主要以绿色为底色，轻微变红，注射10天后，对照果实正常转红，且注射部位明显仅看到针孔，而处理果实非注射部位转红，注射部位的转色受到阻滞，表明该体系成立。注射后15天，注射部位逐渐开始转色，至注射后25天，注射部位大都转色，符合了VIGS是瞬时沉默的特征。

需要说明的是，PDS是果实颜色形成中的关键基因，该基因沉默后，果实将不能正常转色，因此本专利采用该基因作为标记基因，来验证VIGS体系是否在山楂上构建成功。

如图2所示，我们还取注射后10天的果实样品，进行了实时定量PCR验证，计算了5个果实中CpPDS基因的表达量。

结果表明，不同果实CpPDS基因均有不同程度的沉默，并且沉默效率不同，进一步确认了VIGS体系在山楂果实上是可行的，本发明成功构建了一种用于瞬时验证山楂基因功能的方法；

图2中，TRV2代表对照，即注射TRV1和TRV2混合菌液的果实，其CpPDS基因的表达量定义为1。1#-5#分别表示注射TRV1和TRV2-CpPDS混合菌液的果实。

对比例1

对比例1与实施例1步骤基本相同，区别在于：

S3中，摇培至OD

对比例1结果显示，菌液浓度(OD

对比例2

对比例1与实施例1步骤基本相同，区别在于：

S3中，摇培至OD

对比例2结果显示：当菌液浓度为1.5时，果实注射位置会呈现皱缩的表型，表明菌液浓度过高，注射位置果肉细胞失水，果实失去食用价值。

对比例3

对比例1与实施例1步骤基本相同，区别在于：

S3中，摇培至OD

对比例3结果显示：当菌液浓度为2.0时，果实注射位置也会呈现皱缩的表型，表明菌液浓度过高，注射位置果肉细胞失水，果实失去食用价值。

对比例4

对比例4与实施例1步骤基本相同，区别在于：

S5中，注射部位为果肩。

对比例4结果显示，山楂果实果小核大，果肩部位果肉较薄，不适合注射。

对比例5

对比例5与实施例1步骤基本相同，区别在于：

S5中，注射部位为果底。

对比例5结果显示，山楂果实果小核大，果底部位果肉较薄，不适合注射。

对比例6

对比例6与实施例1步骤基本相同，区别在于：

S5中，注射部位为果心。

对比例6结果显示，山楂果实下部有萼筒，此处容易注射，但菌液存留在果核处，不易扩散。

对比例7

对比例7与实施例1步骤基本相同，区别在于：

S5中，注射量为50μl。

对比例7结果显示：注射50μl菌液，沉默部位面积小，注射过程中会有菌液损失，达不到沉默的效果

对比例8

对比例8与实施例1步骤基本相同，区别在于：

S5中，注射量为150μl。

对比例8结果显示：注射量为150μl时，大量菌液沿针孔流出，不仅造成浪费，过多菌液也造成了污染。

对比例9

对比例9与实施例1步骤基本相同，区别在于：

S5中，注射量为200μl。

对比例9结果显示：注射量为200μl时，大量菌液沿针孔流出，不仅造成浪费，过多菌液也造成了污染。

而本发明实施例1-9中注射90-110μl菌液，均可直接看到果实上有约5cm直径的水渍状，表明折射成功。

对比例10

对比例10与实施例1步骤基本相同，区别在于：

S5中，注射时间为8月中下旬，盛花后80天-110天。

结果显示，由于8月中下旬果实硬度高(如图3所示)，容易出现针头堵塞或者注射的菌液直接沿针孔流出，达不到注射效果，因此，导致试验失败，此外，8月份自然气温较高，携带TRV载体的农杆菌GV3101的最佳生长温度为28度，环境温度也不利于该菌的生长。

对比例11

对比例11与实施例1步骤基本相同，区别在于：

S5中，注射时间为9月中旬。

结果发现，虽然9月中旬果实硬度低，不影响注射，但是9月中旬的果实已转为红色，品质基本形成，对于本发明建立体系来说，不适合观察表型。

因此，本发明中于9月初进行注射，9月初盛花后120天后果实硬度下降较快，此时也处于转色关键期，既有利于注射，也有利于观察果实颜色的变化，是注射的最佳时机。

需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。