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具有沉默突变的重组RSV、其相关疫苗和方法

文献发布时间：2023-06-19 12:24:27

本申请是申请日为2014年03月14日，申请号为2014800254152，发明名称为“具有沉默突变的重组RSV、其相关疫苗和方法(原名称为具有沉默突变的重组RSV、疫苗及其相关方法)”的申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求2013年3月14日提交的美国临时申请号61/781,228和2013年10月14日提交的美国临时申请号61/890,500的优先权，两者均通过引用以其全文结合。

技术领域

本申请涉及但不限于具有沉默突变的重组RSV、其相关疫苗和方法。

背景

呼吸道合胞病毒(RSV)导致下呼吸道感染。免疫功能低下的患者、早产儿和儿童尤其处于严重疾病的风险。RSV是婴儿中病毒性死亡的主要原因。RSV治疗集中于预防感染和改善呼吸。帕利珠单抗是可以预防性地给药的一种人源化单克隆抗体。帕利珠单抗在RSV感染之后是无效的，并且保护在治疗停止之后不久终止。疫苗目前不可用于RSV。候选减毒RSV疫苗由于在婴儿中的次最优免疫原性和导致针对不希望的野生型序列的遗传回复的次最优稳定性而已经失败。参见腾(Teng)，传染性病症——药物靶标(Infectious Disorders–Drug Targets)，2012，12(2):129-3。因此，需要发现为适当免疫源性的、足够稳定的且安全用于婴儿的一种减毒RSV疫苗。

由于遗传密码的冗余性，单个氨基酸由密码子的多重序列编码，这些密码子有时被称为同义密码子。在不同物种中，同义密码子或多或少频繁地被使用，有时被称为密码子偏爱。将出现频率过低的同义密码子遗传工程化成一种基因的编码序列已显示导致降低的蛋白质翻译速率，而无蛋白质的氨基酸序列的变化。米勒(Mueller)等人报道通过密码子偏爱的变化进行病毒减毒。参见科学(Science)，2008，320:1784。还参见WO/2008121992、WO/2006042156、伯恩斯(Burns)等人，病毒学杂志(J Virology)，2006，80(7):3259以及米勒等人，病毒学杂志，2006，80(19):9687。

卢昂戈(Luongo)等人报道通过反向遗传学提高一种候选减毒活呼吸道合胞病毒疫苗的遗传和表型稳定性。参见病毒学杂志，2012，86(19):10792。

道丘(Dochow)等人报道副粘液病毒聚合酶蛋白中的独立结构域。生物化学杂志(JBiol Chem)，2012，287:6878–91。

美国专利8,580,270报道RSV F多肽序列。美国专利7,951,384报道它涵盖一种VLPRSV疫苗。

在此引用的参考文献并非对现有技术的承认。

概述

在某些实施例中，本披露涉及呼吸道合胞病毒(RSV)的多核苷酸序列。在某些实施例中，本披露涉及包含在此披露的所希望的核酸序列和突变体的分离或重组的核酸和多肽。在某些实施例中，还提供包含在此披露的核酸和多肽的分离或重组的RSV(例如，减毒重组RSV)，还提供适合用作疫苗的包含这类核酸、多肽和RSV基因组的免疫原性组合物。还涵盖含有呈拷贝的核酸(例如，cDNA)形式的这些核酸和突变体的减毒或灭活的RSV。

在某些实施例中，本披露涉及分离的核酸、具有密码子去优化的重组呼吸道合胞病毒(RSV)、由其产生的疫苗以及与其相关的疫苗接种方法。在某些实施例中，重组RSV病毒包含A2株系的基因NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2、以及L，品系19，或其Long株系或变体。在某些实施例中，密码子去优化是在非结构基因NS1和NS2中并且任选地在一种基因G中且任选地在一种基因L中。在其他实施例中，基因SH被缺失。在其他实施例中，基因F被突变，例如，对应于RSV株系19F蛋白的残基557的一种I至V突变。

在某些实施例中，本披露涉及编码去优化的基因NS1和/或NS2以及一种野生型人RSV或变体的任选地基因G和任选地基因L的分离的核酸，其中这些核苷酸被取代，这样使得用于产生Gly的密码子是GGT，用于产生Asp的密码子是GAT，用于产生Glu的密码子是GAA，用于产生His的密码子是CAT，用于产生Ile的密码子是ATA，用于产生Lys的密码子是AAA，用于产生Leu的密码子是CTA，用于产生Asn的密码子是AAT，用于产生Gln的密码子是CAA，用于产生Val的密码子是GTA，用于产生Tyr的密码子是TAT或其组合。在某些实施例中，分离的核酸中的一种基因进一步包含这些单独密码子中的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或全部的一种组合。在某些实施例中，分离的核酸中的一种基因包含这些密码子中的至少20个、30个、40个或50个或更多个。

在某些实施例中，本披露涉及如在此披露的分离的核酸，其中核苷酸被取代，这样使得用于产生Ala的密码子是GCG，用于产生Cys的密码子是TGT，用于产生Phe的密码子是TTT，用于产生Pro的密码子是CCG，用于产生Arg的密码子是CGT，用于产生Ser的密码子是TCG，或用于产生Thr的密码子是ACG或其组合。在某些实施例中，含有该核酸的一种基因包含这些单独密码子中的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个或全部的一种组合。在某些实施例中，分离的核酸中的一种基因进一步包含这些密码子中的至少20个、30个、40个或50个或更多个。

在某些实施例中，本披露涉及在此披露的核酸，这些核酸编码具有SEQ ID NO:5MGX

在某些实施例中，本披露涉及在此披露的核酸，这些核酸编码RSV的NS1，如以NCBI登录号NP_044589.1、NP_056856.1、P04544.1、AEQ63513.1、AFM55237.1、AFV32554.1、Q86306.1、AFV32528.1、AFM55248.1、AFM95358.1、AFV32568.1、ACY68428.1、CBW45413.1、ACO83290.1、AFM55347.1、CBW45433.1、AEQ63459.1、AFM55204.1、AFV32572.1、AFV32558.1、CBW45429.1、CBW45445.1、AFV32596.1、CBW45481.1、CBW47561.1、P24568.1、AAR14259.1、CBW45451.1、CBW45447.1、CBW45471.1、BAE96914.1、CBW45463.1、CBW45473.1或CBW45467.1提供的；或包含一个、两个或三个氨基酸插入、缺失、取代或保守取代的变体。

在某些实施例中，本披露涉及一种分离的核酸，该分离的核酸包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或与其具有60％、70％、80％、90％、95％或更大序列一致性的一个序列。

在某些实施例中，本披露涉及在此披露的核酸，这些核酸编码具有SEQ ID NO:8，MX

其中X

在某些实施例中，本披露涉及在此披露的核酸，这些核酸编码具有如以NCBI登录号

NP_044590.1、NP_056857.1、CBW45420.1、AFM95337.1、CBW45416.1、CBW45430.1、AFV32529.1、Q86305.1、AEQ63383.1、CBW45424.1、AFM55546.1、CBW45444.1、P04543.2、AFM55326.1、AFM55425.1、AFM55381.1、AFM55458.1、AFM55216.1、AAB59851.1、AEQ63372.1、AFM55337.1、CBW45426.1、AFV32515.1、AFV32519.1、AAR14260.1、CBW47562.1、AFV32643.1、P24569.1、AFV32657.1、AFI25256.1、CBW45480.1、AFV32605.1、AEQ63580.1、AFV32627.1、AFV32665.1、CBW45482.1、CBW45478.1、CBW45462.1、AEQ63635.1、CBW45448.1、CBW45464.1、CBW45484.1或CBW45474.1提供的RSV的NS2的NS1；或包含一个、两个或三个氨基酸插入、缺失、取代或保守取代的变体。

在某些实施例中，本披露涉及一种分离的核酸，该分离的核酸包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10或与其具有60％、70％、80％、90％、95％或更大序列一致性的一个序列。

在某些实施例中，本披露涉及包含在此披露的核酸的重组载体。

在某些实施例中，本披露涉及包含在此披露的核酸的一种减毒重组RSV。

在某些实施例中，本披露涉及包含在此披露的载体或在此披露的一种减毒重组RSV的表达系统。

在某些实施例中，本披露涉及包含在此披露的减毒重组RSV的疫苗。

在某些实施例中，本披露涉及疫苗接种方法，这些方法包括向处于RSV感染风险的受试者给予有效量的在此披露的疫苗。

在某些实施例中，受试者年龄小于2个月或6个月、在1岁以下、早产、患有先天性心脏病或肺病，经受化学疗法或移植，或被诊断患有哮喘、充血性心力衰竭或慢性阻塞性肺病、白血病或HIV/AIDS。

在某些实施例中，疫苗与莫维珠单抗、帕利珠单抗或针对RSV的F蛋白的抗原位点II中的表位的另一种人源化单克隆抗体组合给予。

在某些实施例中，本披露涉及在此披露的载体，这些载体包含一种细菌人工染色体(BAC)和包含呼吸道合胞病毒(RSV)的一种核酸序列，并且该BAC含有对于在一种宿主细胞中产生一种感染性病毒颗粒来说必需的所有基因。该核酸序列可以是与一种调控元件可操作的组合的一种病毒基因组或反基因组。典型地，该细菌人工染色体包含与一种选择性标志物(例如提供对一种抗生素的抗性的一种基因)可操作的组合的一种或更多种基因，该一种或更多种基因选自下组，该组由以下各项组成：因子F的oriS、repE、parA和parB基因。

该核酸序列可以是如在此所提供任选地突变的病毒(例如，任选地突变的RSV株系)的基因组或反基因组序列。在某些实施例中，表达载体是包含MluI、ClaI、BstBl、SacI限制性核酸内切酶切割位点和任选地位于野生型病毒序列的区域外部或位于编码病毒基因的序列外部或位于病毒基因组或反基因组外部的一个AvrII限制性核酸内切酶切割位点的一种质粒。在某些实施例中，该核酸序列进一步包含与其可操作地组合的一种选择性标志物或报道基因，例如，编码一种荧光蛋白的一种基因。

在某些实施例中，本披露涉及包含在此披露的一种或更多种载体的分离的细菌，并且在其他实施例中，本披露涉及一种包含在此披露的一种或更多种载体的分离的细胞。在某些实施例中，该载体包含一个RSV反基因组和选自下组的一种或更多种载体，该组由以下各项组成：编码RSV的N蛋白的一种载体、编码RSV的P蛋白的一种载体、编码RSV的L蛋白的一种载体、以及编码RSV的M2-1蛋白的一种载体。典型地，该载体包含一种调控元件(例如，启动子)，并且分离的真核细胞表达活化该调控元件的一种核酸或多肽，例如，编码活化该启动子下游的转录的一种多肽。在某些实施例中，该启动子是T7，并且活化该启动子下游的转录的多肽是T7 RNA聚合酶。

在某些实施例中，本披露涉及产生呼吸道合胞病毒(RSV)颗粒的方法，这些方法包括将具有一种BAC基因的一种载体和一个RSV反基因组插入一种分离的真核细胞中，并且在使得形成RSV病毒粒子的条件下将选自下组的一种或更多种载体插入该细胞中，该组由以下各项组成：编码RSV的N蛋白的一种载体、编码RSV的P蛋白的一种载体、编码RSV的L蛋白的一种载体、以及编码RSV的M2-1蛋白的一种载体。将一种载体插入一种细胞中可通过物理注入、电穿孔或在使得该载体进入该细胞的条件下将该细胞与该载体进行混合来发生。

在某些实施例中，本披露涉及相较于其他株系，品系19F557突变体病毒的稳定性，以及使得表达品系19F的RSV甚至更热稳定的在557处的val。其他株系中在557位的Val也可能稳定；因此557位对于热稳定性来说是重要的。在某些实施例中，本披露涵盖在任何F株系背景下，品系19F或其他RSV株系中在改进RSV病毒的热稳定性的557位(任何氨基酸，例如，丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸)的其他突变。

在某些实施例中，本披露涵盖包含557位的丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸(例如，SEQ IDNO:17的557位中的丙氨酸或亮氨酸)的RSV F多肽。

在某些实施例中，本披露涉及RSV F多肽的某一所希望的序列，例如包含557位的缬氨酸的品系19序列，例如SEQ ID NO:17；以及编码这些多肽的重组核酸。在某些实施例中，本披露涵盖包含编码这些多肽的核酸的重组载体和包含所述载体的细胞。

在某些实施例中，本披露涉及免疫原性组合物，这些组合物包含免疫有效量的在此披露的重组呼吸道合胞病毒(RSV)、RSV多肽、RSV颗粒、RSV病毒样颗粒和/或核酸。在某些实施例中，本披露涉及用于刺激个体的免疫系统产生针对RSV的保护性免疫应答的方法。在某些实施例中，在一种生理学上可接受的载体中向该个体给予免疫有效量的在此披露的一种RSV、多肽和/或核酸。

在某些实施例中，本披露涉及用于在此披露的用途的包含在此披露的核酸的药物和疫苗产品。

在某些实施例中，本披露涉及在此披露的核酸或载体用于制造用于在此披露的用途的一种药物的用途。

附图简要说明

图1示出具有在人基因中和特定RSV株系中最少使用的密码子的一个表。

图2示出BEAS-2B(顶部)和Vero细胞系(底部)中kRSV-dNS1h的生长数据。kRSV-A2(空心圆圈)和kRSV-dNSh(实心圆圈)在37℃下以0.01的MOI感染的HEp-2(A)、Vero细胞(B)和BEAS-2B细胞(C)中以及在以0.2(D)或2.0(E)的MOI感染的分化NHBE/ALI细胞中的生长曲线。

图3示出关于使用在此披露的某些实施例的病毒载量实验的数据。在0.2的MOI下NHBE细胞感染的时间进程图像，这些图像示出由重组病毒产生的mKate2荧光。*P<0.05

图4示出在通过重组工程将galK操纵子插入BAC-RSV中之后的凝胶。MluI消化。泳道1，梯度标志物。微量制备BAC DNA(泳道2至7)。泳道8，亲本BAC-RSV“C2”克隆。泳道9，含galK质粒。galK操纵子具有充当用于通过同源重组引入galK的标志物的一个Mlu I限制位点。

图5示出在通过重组工程使galK操纵子从BAC-RSV中缺失之后的凝胶。含galK质粒(泳道2)、BAC微量制备DNA(泳道3-7)以及亲本BAC-RSV克隆C2(泳道8)的MluI消化。

图6A-6E示意性地示出用于产生BAC-RSV的步骤。产生具有RSV区段的三种质粒(参见实验)；图6A将pKBS3在BstBl和Mlul位点处切割以便线性化，并且连接至一个寡核苷酸衔接子，从而提供pKBS5；图6B将具有Sacl和Clal的pSynRSV#2切割且连接至pKBS5，从而提供pKBS5-2；图6C将具有Avrll和Mlul的pSynRSV#3切割且连接至pKBS5_2，从而提供pKBS5_2_3；图6D将具有BstBl和Sacl的pSynRSV#1切割且连接至pKBS5_2_3，从而提供pKBS5_1_2_3；图6E。重组工程用于使两个Clal位点之间的核苷酸缺失，从而产生pSynRSV-品系19F。

图7A和图7B示出显示指示具有F基因I557至V突变的一种RSV株系的免疫源性的数据。将小鼠用指示剂量的A2-K-品系19F、A2-品系19F-I557 V或A2-K-A2GF感染并且在29天之后用RSV株系12-35激发。在激发后第4天测量肺病毒载量。虚线指示检测限。

图8示出指示具有A2-品系19F基因I557至V突变(SEQ ID NO:17)的RSV株系的优异热稳定性的数据。在所指示的温度下孵育病毒并且每天测量病毒滴度持续6天。在4℃下的结果在病毒之间是统计学上显著的(P<0.01)。在37℃下的结果展示相同表型。

图9示出株系19，I557 V突变(SEQ ID NO:17)(询问序列)与典型RSV株系19序列(目标序列)的RSV序列比较。

图10示出株系19，I557 V突变(SEQ ID NO:17)(询问序列)与来自专利US 7,951,384的序列61(目标序列)的RSV序列比较。

图11示出株系19，I557 V突变(SEQ ID NO:17)(询问序列)与来自专利US 8,580,270的序列12(目标序列)的RSV序列比较。

图12示出关于在此披露的实施例的减毒、功效和免疫源性的数据。(A)将6-8周龄BALB/c小鼠(n＝5/组)用1.6×105FFU的kRSV-A2(空心圆圈)或kRSV-dNSh(实心圆圈)鼻内感染并且在感染后第1天、第2天、第4天、第6天和第8天测定肺病毒滴度。数据表示具有相似结果的两个重复实验中的一个。*P<0.05。(B)将BALB/c小鼠用不同剂量(105FFU、104FFU和103FFU)的kRSV-A2(空心圆圈)或kRSV-dNSh(实心圆圈)鼻内疫苗接种，或模拟感染，并且在疫苗接种之后100天将小鼠用1.6×106PFU RSV 12-35株系激发。在激发后第4天测量肺峰值病毒载量。每个符号表示一只小鼠。虚线(A和B)表示用于噬斑测定的检测限。低于检测限的滴度被分配检测限的值的一半。(C)将BALB/c小鼠(n＝5/组)模拟感染或用105FFU的kRSV-A2抑或kRSV-dNSh感染，并且在感染后所指示的天数测量血清nAb滴度。*P<0.05。

图13示出关于用于在此披露的某些实施例的疫苗功效的数据。将6-8周龄BALB/c小鼠(n＝5/组)模拟感染或用不同指示剂量的kRSV-A2(空心圆圈)或kRSV-dNSh(实心圆圈)疫苗接种。28天之后将小鼠用(A)2X106 PFU RSV A2-品系19株系或(B)5X105 PFU RSV 12-35激发。在激发后第4天测量肺病毒载量。每个符号表示一只小鼠。虚线表示用于噬斑测定的检测限。低于检测限的滴度被分配检测限的值的一半。

图14示出关于在细胞系中RSV感染期间NS1和NS2蛋白质的表达的数据。将HEp-2(A)、BEAS-2B(B)和Vero(C)细胞模拟感染或用kRSV-A2、kRSV-dNSh抑或kRSV-dNSv以MOI 5感染。在感染后二十小时，通过蛋白质印迹法和密度测定法分析NS1和NS2蛋白质水平。代表性印迹在左侧示出。来自2-3个独立实验的密度测定在右侧示出。在标准化至RSV N蛋白质水平之后，将由每种病毒表达的NS1和NS2蛋白质水平标准化至在kRSV-A2感染期间的蛋白质水平并且表示为百分比±SEM。未填充的条表示kRSV-A2，灰色条表示kRSV-dNSv，并且黑色条表示kRSV-dNSh。

详细说明

在更详细地描述本披露之前，应理解的是本披露不限于所描述的具体实施例，因此这些当然可以改变。还应当理解，在此使用的术语仅是为了描述特定实施例的目的，而并不意图是限制性的，因为本披露的范围将仅由所附权利要求限定。

除非另外定义，在此所用的全部技术术语和科学术语具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。虽然与在此所述的那些方法和材料相似或等效的任何方法和材料也可以用于实施或测试本披露中，但现在描述优选的方法和材料。

在本说明书中引用的所有公开物和专利通过引用结合在此，就好像每个单独的公开物或专利被确切地并单独地指示为通过引用结合，并且通过引用结合在此从而结合引用的公开物披露和描述这些方法和/或材料。任何公开物的引用内容是针对在提交日之前的披露，并且不应理解为承认因为先前披露而本披露不能获得比这些公开物更早的申请日。此外，所提供的公开日期可能与实际的公开日期不同，实际的公开日期可能需要单独地确认。

如将对于本领域技术人员清楚的是，在阅读本披露时，在此描述和展示的单独实施例中的每一个具有离散的组成部分和特征，这些组成部分和特征可以在不偏离本披露的范围或精神的情况下易于与任何其他一些实施例的特征分离或组合。可以按照所叙述的事件的顺序或按照逻辑上可行的任何其他顺序来进行任何叙述的方法。

除非另外说明，本披露的实施例将采用免疫学、医学、有机化学、生物化学、分子生物学、药理学、生理学等的技术，这些技术是在本领域的技术之内。此类技术在文献中得到充分解释。

必须指出，如在说明书和所附权利要求书中所使用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“该(the)”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地规定。在本说明书和以下权利要求书中，将参考应定义为具有下列含义的大量术语，除非明显是相反的意图。

在描述各种实施例之前，提供以下定义并且应使用这些定义，除非另外指明。

术语“蛋白质”和“多肽”是指包含经由肽键连接的氨基酸的化合物并且可互换使用。

当关于蛋白质使用时，术语“部分”(如在“一种给定蛋白质的一部分”中)是指该蛋白质的片段。片段的大小可在四个氨基酸残基至整个氨基酸序列减去一个氨基酸的范围内。

当关于多肽使用时，术语“嵌合体”是指从不同基因获得的已经克隆在一起并且在翻译之后充当一个单一多肽序列的两个或更多个编码序列的表达产物。嵌合多肽还被称为“杂合”多肽。这些编码序列包括从相同或不同物种的生物体获得的那些。

当关于多肽使用时，术语“同源物”或“同源的”是指两个多肽之间的高度序列一致性，或是指三维结构之间的高度相似性或是指活性位点和作用机制之间的高度相似性。在一个优选实施例中，一种同源物与一个参考序列具有大于60％序列一致性，并且更优选地大于75％序列一致性，并且仍然更优选地大于90％序列一致性。

当应用于多肽时，术语“基本一致性”意指当使用默认空位权重如通过程序GAP或BESTFIT最佳比对时，两个肽序列共享至少80％序列一致性，优选至少90％序列一致性，更优选至少95％序列一致性或更大(例如，99％序列一致性)。优选地，不一致的残基位置因保守氨基酸取代而不同。

当关于多肽使用时，术语“变体”和“突变体”是指在一个或更多个氨基酸上彼此不同的氨基酸序列，通常为相关多肽。该变体可以具有“保守”变化，其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学特性。一种类型的保守氨基酸取代是指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、以及异亮氨酸；具有脂族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酸；具有芳族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、以及色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸、以及组氨酸；并且具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、以及天冬酰胺-谷氨酸。更为罕见的是，变体可具有“非保守”变化(例如，用色氨酸替代甘氨酸)。类似微小变异还可以包括氨基酸缺失或插入(换言之，添加)或两者。可以使用本领域中熟知的计算机程序(例如，DNAStar软件)发现确定哪些或多少氨基酸残基可以被取代、插入或缺失而不消除生物活性的指导。可在功能测定中测试变体。优选的变体具有小于10％、且优选地小于5％、且仍然更优选地小于2％的变化(取代、缺失等)。

术语“基因”是指包含产生RNA、或多肽或其前体(例如，胰岛素原)所必需的编码序列的核酸(例如，DNA或RNA)序列。功能性多肽可以由一个全长编码序列或由该编码序列的任何部分编码，只要保留了该多肽的所希望的活性或功能特性(例如，酶活性、配体结合、信号转导等)即可。当关于基因使用时，术语“部分”是指该基因的片段。片段的大小可在几个核苷酸至整个基因序列减去一个核苷酸的范围内。因此，“包含一个基因的至少一部分的核苷酸”可以包含该基因的片段或该整个基因。

术语“基因”还涵盖一个结构基因的编码区并且包括邻近于该编码区在5'和3'末端上距任一端约1kb距离定位以使得该基因对应于全长mRNA的长度的序列。位于编码区的5'并存在于mRNA上的序列被称为5'非翻译序列。定位在编码区的3'或下游并且存在于mRNA上的序列被称为3'非翻译序列。术语“基因”涵盖一种基因的cDNA形式和基因组形式两者。一种基因的基因组形式或克隆包含间杂有称为“内含子”或“插入区”或“插入序列”的非编码序列的编码区。内含子是转录成核RNA(mRNA)的基因的区段；内含子可以含有调控元件，如增强子。内含子被从核或初级转录物中移除或“剪切掉”；因此信使RNA(mRNA)转录物中不存在内含子。mRNA在翻译期间起到指明新生多肽中氨基酸的序列或次序的作用。

除了含有内含子之外，一种基因的基因组形式还可以包括RNA转录物上存在的定位在这些序列的5'和3'末端上的序列。这些序列被称为“侧翼”序列或区域(这些侧翼序列定位在mRNA转录物上存在的非翻译序列的5'或3')。5'侧翼区可以含有调控序列，如控制或影响该基因的转录的启动子和增强子。3'侧翼区可以含有指导转录的终止、转录后裂解和聚腺苷酸化的序列。

术语“异源基因”是指编码不处于其天然环境(即，通过人手改变过的)的因子的基因。例如，异源基因包括从一个物种引入到另一个物种中的基因。异源基因还包括已经以一些方式改变(例如，突变、加入多个拷贝、连接至非天然启动子或增强子序列等)的生物体天然具有的基因。异源基因与内源植物基因的区别在于异源基因序列典型地连接至包含调控元件如启动子的核苷酸序列，这些启动子未被发现与由该异源基因编码的蛋白质的基因或与染色体中的植物基因序列天然相关，或与未在自然中发现的染色体的部分相关(例如，在通常不表达基因的基因座中表达的基因)。

术语“多肽”是指包含两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸(优选多于三个且通常多于十个)的分子。确切大小将取决于许多因素，其进而取决于寡核苷酸的最终功能或用途。多核苷酸可以以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。术语“寡核苷酸”通常是指通常少于30个核苷酸长的较短长度的单链多核苷酸链，但是它也可以与术语“多核苷酸”互换使用。

术语“核酸”是指如上所述的核苷酸的聚合物或多核苷酸。该术语用于表示一个单个分子或多个分子的集合。核酸可以是单链或双链的，并且可以包括编码区和各种控制元件的区域，如以下所述。

术语“具有编码基因的核苷酸序列的多核苷酸”或“编码指定多肽的核酸序列”是指包括基因的编码区的核酸序列或换言之编码基因产物的核酸序列。编码区可以按cDNA、基因组DNA或RNA形式存在。当以DNA形式存在时，寡核苷酸、多核苷酸或核酸可以是单链的(即正义链)或双链的。如果需要允许适当地启动原始RNA转录物的转录和/或正确的加工，则可以紧邻基因的编码区放置适合的控制元件，如增强子/启动子、剪接点、多腺苷酸化信号等。可替代地，在本披露的表达载体中使用的编码区可以包含内源性增强子/启动子、剪接点、间插序列、多腺苷酸化信号等或内源性和外源性的两种控制元件的组合。

当就核酸分子而言时，术语“重组”是指包含通过分子生物学技术而连接在一起的核酸区段的核酸分子。当就蛋白质或多肽而言时，术语“重组”是指使用重组核酸分子表达的蛋白质分子。

术语“互补”和“互补性”是指通过碱基配对规则相关联的多核苷酸(即，一个核苷酸序列)。例如，序列“A-G-T”与序列“T-C-A”互补。互补性可以是“部分的”，其中仅一些核酸的碱基根据碱基配对规则是匹配的。或者，在多个核酸之间可以存在“完全”或“全部”的互补性。核酸链之间的互补性程度对于核酸链之间杂交的效率和强度具有显著影响。这在扩增反应以及取决于核酸之间的结合的检测方法中特别重要。

当关于核酸使用时，术语“同源性”是指一定程度的互补性。可能存在部分同源性或完全同源性(即，一致性)。“序列一致性”是指两个或更多个核酸或蛋白质之间相关性的量度，并且给出为相对于总比较长度的百分比。一致性计算考量一致的或在它们各自的较大序列中处于相同的相对位置的那些核苷酸或氨基酸残基。一致性的计算可通过计算机程序内包含的算法来进行，这些程序如“GAP”(遗传学计算机组(Genetics Computer Group)，威斯康星州麦迪逊(Madison,Wis.))和“ALIGN”(DNAStar，威斯康星州麦迪逊)。部分互补序列是至少部分抑制(或与其竞争)完全互补序列与靶核酸杂交的序列-使用功能性术语称为“基本上同源的”。完全互补序列与靶序列杂交的抑制可在具有低严格性的条件下使用杂交测定(Southern或Northern印迹、溶液杂交等)来检验。基本上同源的序列或探针在具有低严格性的条件下将竞争且抑制与靶标完全同源的序列的结合(即，杂交)。这并不是说具有低严格性的条件是这样的允许非特异性结合；低严格性条件要求两个序列彼此之间的结合为特异性(即，选择性)相互作用。非特异性结合的缺乏可通过使用甚至缺少部分程度的互补性(例如，小于约30％一致性)的第二靶标来测试；在缺乏非特异性结合的情况下，探针将不与第二非互补性靶标杂交。

下列术语用来描述两种或更多种多核苷酸之间的序列关系：“参考序列”、“序列一致性”、“序列一致性百分比”、以及“基本一致性”。“参考序列(reference sequence)”是用作序列比较基础的限定序列；参考序列可以是较大序列的子集，例如，作为序列表中给定的全长cDNA序列的区段或可包含完整的基因序列。一般地，参考序列的长度为至少20个核苷酸，常为至少25个核苷酸长，且通常为至少50个核苷酸长。因为两条多核苷酸各自可以(1)包含在两个多核苷酸之间类似的序列(即，完整的多核苷酸序列的一部分)，以及(2)可进一步包含与两条多核苷酸相去甚远的序列，典型地通过在“比较窗”上比较两个多核苷酸的序列进行两个(或更多个)多核苷酸间的序列比较以鉴定和比较具有序列相似性的局部区域。如在此所使用，“比较窗”是指概念上至少20个连续核苷酸位置的区段，其中多核苷酸序列可以与至少20个连续核苷酸的参考序列进行比较，并且其中在该比较窗中的该多核苷酸序列部分与参考序列(其不包含添加或缺失)相比可以包含20％或更少的添加或缺失(即，缺口)，从而对这两条序列进行最佳比对。用于比对比较窗的序列的最佳比对可通过史密斯和沃特曼(Smith and Waterman)的局部同源性算法(史密斯和沃特曼,先进应用数学(Adv.Appl.Math.)2:482(1981))，通过尼德曼和翁施(Needleman and Wunsch)的同源性比对算法(尼德曼和翁施,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443(1970))，通过皮尔森和李普曼(Pearson and Lipman)的相似性研究方法(皮尔森和李普曼,美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.))85:2444(1988))，通过这些算法的计算机实现(GAP、BESTFIT、FASTA、以及TFASTA，威斯康星遗传学软件包，发布7.0(Wisconsin GeneticsSoftware Package Release 7.0)，遗传学计算机小组(Genetics Computer Group),575Science Dr.,威斯康星州麦迪逊)，或者通过检查来进行，并且选择通过各种方法产生的最佳比对(即，产生比较窗上的最高同源性百分比)。术语“序列一致性”意指在比较窗上两个多核苷酸序列是一致的(即，在核苷酸紧接核苷酸的基础上)。

在某些实施例中，术语“序列一致性百分比”是通过比较在该比较窗上的两条最佳比对序列，确定在两条序列中出现一致的核酸碱基(例如，A、T、C、G、U或I)位置的数目，从而获得匹配位置的数目，用匹配位置的数目除以在该比较窗(即，窗口大小)中的总位置数目，并将该结果乘以100从而得到序列一致性百分比来计算的。

在某些实施例中，序列“一致性”是指在序列比对中比对的两个序列之间的精确配对氨基酸的数目(表示为百分比)，该数目使用一致位置的数目除以最短序列中的较大序列或排除突出端的等效位置的数目来计算，其中内部缺口计为等效位置。例如，多肽GGGGGG和GGGGT具有五分之四或80％的序列一致性。例如，多肽GGGPPP和GGGAPPP具有七分之六或85％的序列一致性。在某些实施例中，在此表述的序列一致性的任何引用可以被替代为序列相似性。“相似性”百分数用来量化比对的两个序列之间的相似性。该方法与测定一致性相同，不同的是，某些氨基酸不必须是一致的，以具有匹配。氨基酸可被归为匹配物，如果它们在根据以下氨基酸组的具有相似特性的一个组中：芳香族-F Y W；疏水性-AV I L；带正电荷：RK H；带负电荷-D E；Polar-S T NQ。

如在此使用的术语“基本一致性”指示多核苷酸序列的特征，其中多核苷酸包含在至少20个核苷酸位置的比较窗上，时常在至少25-50个核苷酸的比较窗上与参考序列相比具有至少85％序列一致性，优选至少90％至95％序列一致性的序列，其中序列一致性百分比通过将参考序列与多核苷酸序列比较来计算，该多核苷酸序列可包含总数达比较窗上参考序列的20％或更少的缺失或添加。参考序列可以是较大序列的子集，例如，作为本披露中要求保护的组合物的全长序列的区段。

当关于双链核酸序列如或cDNA或基因组克隆使用时，术语“基本上同源的”是指在如上所述的具有低至高严格性的条件下可与该双链核酸序列的一个链或两个链杂交的任何探针。

当关于单链核酸序列使用时，术语“基本上同源的”是指在如上所述的具有低至高严格性的条件下可与该单链核酸序列杂交(即，为该单链核酸序列的补体)的任何探针。

术语“可操作组合”、“以可操作顺序”和“可操作地连接”是指核酸序列的键，其方式使得产生能够指导给定基因的转录和/或所期望蛋白分子的合成的核酸分子。该术语还指氨基酸序列的键，其方式使得产生功能蛋白。

术语“调控元件”是指控制核酸序列的表达的一些方面的遗传元件。例如，启动子是有利于可操作地连接的编码区的转录的起始的调控元件。其他调控元件是剪接信号、聚腺苷酸化信号、终止信号等。

真核生物中的转录控制信号包括“启动子”和“增强子”元件。启动子和增强子由与涉及转录的细胞蛋白特异性地相互作用的DNA序列的短阵列组成(马尼亚蒂斯(Maniatis)等人，科学236:1237，1987)。已从多种真核来源包括酵母、昆虫、哺乳动物或植物细胞中的基因中分离了启动子和增强子元件。还已从病毒中分离了启动子和增强子元件，并且存在于原核生物中。具体启动子和增强子的选择取决于表达目标蛋白所用的细胞类型。一些真核启动子和增强子具有广泛的宿主范围，而其他真核启动子和增强子在有限的细胞类型子集中是有功能的(综述参见沃斯(Voss)等人，生化科技的趋势(Trends Biochem.Sci.)，11:287，1986；以及马尼亚蒂斯等人，同上，1987)。

如在此所使用的术语“启动子元件”、“启动子”、或“启动子序列”是指定位在DNA聚合物的蛋白质编码区的5'末端(之前)的DNA序列。自然界中已知的大多数启动子的位置在转录区之前。启动子用作开关，激活基因的表达。如果基因被激活，那么称为它被转录、或参与转录。转录涉及来自该基因的mRNA的合成。因此，启动子充当转录调控元件并且还提供用于起始基因至mRNA的转录的位点。

启动子可以是组织特异性或细胞特异性的。当用于启动子时术语“组织特异性”是指在不同组织类型(例如，叶子)中相对不存在相同的目标核苷酸序列的表达的情况下，能够指导目标核苷酸序列针对特定组织类型(例如，种子)的选择性表达的启动子。启动子的组织特异性可以通过例如以下方式来评估：将一种报道基因可操作地连接至该启动子序列以产生一种报道构建体，将该报道构建体引入一种植物的基因组中，这样使得该报道构建体被整合到所得转基因植物的每个组织中，并且检测在该转基因植物的不同组织中该报道基因的表达(例如，检测mRNA、蛋白、或由该报道基因编码的蛋白的活性)。检测到该报道基因在一种或更多种组织中的表达水平高于该报道基因在其他组织中的表达水平表明该启动子对其中检测到更大表达水平的组织具有特异性。如用于启动子的术语“细胞类型特异性”是指在相同组织中的不同细胞类型中相对不存在相同的目标核苷酸序列的表达的情况下，能够指导目标核苷酸序列在特定细胞类型中的选择性表达的启动子。当用于启动子时“细胞类型特异性”也意指能够促进目标核苷酸序列在单个组织中的一个区内的选择性表达的启动子。启动子的细胞类型特异性可以使用本领域众所周知的方法，例如免疫组织化学染色来评定。简言之，将组织切片包埋在石蜡中，并且使石蜡切片与特异于由目标核苷酸序列编码的多肽产物的第一抗体反应，该目标核苷酸序列的表达由该启动子控制。使特异于该第一抗体的标记的(例如，过氧化酶偶联的)第二抗体结合切开的组织并且通过显微镜检查法进行特异性结合检测(例如，使用亲和素/生物素)。

启动子可为组成型或可调控的。当就启动子而言时，术语“组成型”是指启动子能够在不存在刺激(例如，热休克、化学品、光照等)的情况下指导可操作地连接的核酸序列的转录。典型地，组成型启动子能够在基本上任何细胞和任何组织中指导转基因的表达。

相比之下，“可调节的”或“诱导型”启动子是能够在刺激(例如，热休克、化学品、光照等)的存在下指导可操作地连接的核酸序列的一定水平的转录的启动子，该水平不同于在不存在刺激的情况下该可操作地连接的核酸序列的转录的水平。

增强子和/或启动子可为“内源性的”或“外源性的”或“异源的”。“内源性”增强子或启动子是在基因组中与给定基因天然连接的增强子或启动子。“外源性”或“异源”增强子或启动子是通过遗传操纵的方法(即，分子生物学技术)与一个基因毗邻放置，使得该基因的转录由所连接的增强子或启动子指导的增强子或启动子。例如，与第一基因可操作组合的内源性启动子可被分离、移除、并且被放置与一个第二基因可操作组合，从而将其制备成与该第二基因可操作组合的“异源启动子”。涵盖多种此类组合(例如，第一基因和第二基因可以来自相同物种，或来自不同物种)。

重组DNA序列在真核细胞中的有效表达通常需要指导所得转录物的有效终止和聚腺苷酸化的信号的表达。转录终止信号通常存在于聚腺苷酸化信号下游并且长度为几百个核苷酸。如在此所使用的术语“poly(A)位点”或“poly(A)序列”表示指导新生RNA转录物的终止和聚腺苷酸化的DNA序列。重组转录物的有效聚腺苷酸化是希望的，因为缺乏poly(A)尾巴的转录物是不稳定的并且被快速降解。表达载体中利用的poly(A)信号可以是“异源的”或“内源性的”。内源性poly(A)信号在基因组中天然存在于给定基因的编码区的3'末端。异源poly(A)信号是从一个基因中分离出来且放置到另一个基因3'的poly(A)信号。一种常用的异源poly(A)信号是SV40 poly(A)信号。该SV40 poly(A)信号包含在237bpBamHI/BclI限制片段上并且指导终止和聚腺苷酸化。

术语“载体”是指将一个或更多个DNA区段从一个细胞转移至另一个细胞的核酸分子。术语“媒介物”有时与“载体”互换使用。

术语“表达载体”或“表达盒”是指含有所希望的编码序列或用于可操作地连接的编码序列在特定宿主生物体中的表达的适当核酸序列的重组核酸。用于在原核生物中的表达的核酸序列通常包括启动子、操纵子(任选的)以及核糖体结合位点，经常连同其他序列。已知真核细胞利用启动子、增强子和终止以及聚腺苷酸化信号。

术语“宿主细胞”是指能够复制和/或转录和/或翻译异源基因的任何细胞。因此，“宿主细胞”是指任何真核生物或原核生物细胞(例如，细菌细胞如大肠杆菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、鸟类细胞、两栖动物细胞、植物细胞、鱼类细胞以及昆虫细胞)，不论是位于体外还是体内。例如，宿主细胞可以位于转基因动物中。

术语“选择性标志物”是指编码具有活性的酶的基因，该活性给在其中表达选择性标志物的细胞赋予抗生素或药物抗性，或赋予可被检测的性状(例如，发光或荧光)的表达。选择性标志物可以是“阳性的”或“阴性的”。阳性选择性标志物的例子包括赋予对G418和卡那霉素的抗性的新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因，以及赋予对抗生素潮霉素的抗性的细菌潮霉素磷酸转移酶基因(hyg)。阴性选择性标志物编码酶活性，当在适当的选择性培养基中生长时，该酶活性的表达对细胞是细胞毒性的。例如，HSV-tk基因通常用作阴性选择性标志物。HSV-tk基因在于更昔洛韦或阿昔洛韦存在下生长的细胞中的表达是细胞毒性的；因此，细胞在含有更昔洛韦或阿昔洛韦的选择性培养基中的生长选择出能够表达功能性HSV TK酶的细胞。

术语“报道基因”是指编码可被测定的蛋白质的基因。报道基因的实例包括但不限于修饰的katushka、mkate和mkate2(参见，例如梅尔兹利亚克(Merzlyak)等人,自然方法(Nat.Methods),2007,4,555–557和谢尔博(Shcherbo)等人,生物化学杂志(Biochem.J.),2008,418,567–574)、荧光素酶(参见，例如德韦(deWet)等人,分子细胞生物(Mol.Cell.Biol.)7:725(1987)和美国专利号6,074,859；5,976,796；5,674,713及5,618,682；这些全部通过引用结合在此)、绿色荧光蛋白(例如，Genbank登录号U43284；多种GFP变体可商购自克隆技术实验室，加利福尼亚州帕罗奥图(ClonTech Laboratories,PaloAlto,Calif.)、氯霉素乙酰转移酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酯酶以及辣根过氧化物酶。

当就基因而言时，术语“野生型”是指具有从天然发生的来源分离的基因的特征的基因。当就基因产物而言时，术语“野生型”是指具有从天然发生的来源分离的基因产物的特征的基因产物。如在此使用的用于物体的术语“天然发生的”是指物体可以在自然中发现的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中的可以从天然来源分离并且还未被人在实验室中故意修饰的多肽或多核苷酸序列是天然发生的。野生型基因是在群体中最经常观察到的基因，并且因此被任意地称为基因的“正常”或“野生型”形式。相比之下，当就基因或基因产物而言时，术语“修饰的”或“突变的”分别是指当与野生型基因或基因产物比较时显示出序列和/或功能特性中的修改(即，改变的特征)的基因或基因产物。应注意，天然发生的突变体可以是分离的；这些突变体通过当与野生型基因或基因产物比较时它们具有改变的特征这一事实得到鉴定。

术语“反义”或“反基因组”是指相对于正义链的核苷酸残基序列，其核苷酸残基序列处于相反的5'至3'取向的核苷酸序列。DNA双链体的“正义链”是指DNA双链体中的由细胞以其天然状态转录成“正义mRNA”的链。因此“反义”序列是与DNA双链体中的非编码链具有相同序列的序列。

术语“分离的”是指如病毒、核酸或蛋白质的生物物质，它基本上不具有在其天然发生的环境中通常与其伴随或与其相互作用的组分。分离的物质任选地包含未在其自然环境例如细胞中与其一起发现的物质。例如，如果物质处于其自然环境如细胞中，那么该物质已被放置在细胞中的对于在该环境中发现的物质不是天然的位置(例如，基因组或遗传因子)中。例如，天然发生的核酸(例如，编码序列、启动子、增强子等)变为分离的，如果通过非天然发生的手段将它引入对于该核酸不是天然的基因组(例如，载体，如质粒或病毒载体，或扩增子)的基因座中。此类核酸也被称为“异源”核酸。分离的病毒是处于例如野生型病毒的自然环境(例如，感染个体的鼻咽)之外的环境中(例如，细胞培养系统，或从细胞培养物中纯化)。

RSV的“免疫有效量”是足以增强个体(例如人)的对于随后暴露于RSV的自身免疫应答的量。诱导的免疫水平可以例如通过测量中和性分泌抗体和/或血清抗体的量来监测(例如通过噬菌斑中和、补体固定、酶联免疫吸附或微量中和测定)。

针对RSV的“保护性免疫应答”是指当个体(例如人)随后暴露于和/或被野生型RSV感染时由个体展现的针对严重的下呼吸道疾病(例如，肺炎和/或细支气管炎)的保护性免疫应答。

在非结构基因中具有密码子使用沉默突变的重组呼吸道合胞病毒(RSV)

候选减毒活RSV疫苗具有两个主要障碍，即，在婴儿中的次最优免疫原性和导致针对野生型的遗传回复和接种者的回复体脱落的次最优稳定性。病毒非结构(NS)蛋白NS1和NS2是独特的并且抑制I型干扰素和T细胞应答。针对疫苗使NS1/NS2突变增强免疫原性。然而，先前开发的NS1和NS1/NS2缺失/空突变体重组RSV株系被过度减毒，并且NS2空突变体在体内减毒不足。

在此披露的突变体克服过度减毒和不稳定性的限制。产生具有部分NS1和NS2功能的突变体以桥接减毒免疫原性间隙用于儿科疫苗。通过改变NS1和NS2基因上的密码子使用利用基因合成和RSV BAC拯救系统产生NS1/NS2突变体。密码子去优化通过多种机制(例如，tRNA浓度和mRNA结构)降低翻译效率。在此披露的一种突变体(“dNSh”)中NS1的84/420nt突变和NS2的82/375nt突变，减小人密码子偏好且不改变氨基酸序列。这种病毒产生了大约25％的wt NS1水平、25％的wt NS2水平、100％的wt核蛋白水平，并且在维洛细胞中复制了类似的wt病毒，即常用于在GMP条件下产生减毒活RSV的细胞系(图2)。除了减少NS表达之外，此方法同样解决了遗传稳定性问题，因为存在很多突变用于回复。

在某些实施例中，本披露涉及疫苗、重组RSV基因组或编码RSV NS1、NS2、N、P、M、G、F、M2-1、M2-2的分离的重组核酸、以及包含NS1和NS2基因的密码子去优化的L基因，其中密码子去优化被配置成使得产生Gly的至少一个密码子是GGT，产生Asp的密码子是GAT，产生Glu的至少一个密码子是GAA，产生His的至少一个密码子是CAT，产生Ile的至少一个密码子是ATA，产生Lys的至少一个密码子是AAA，产生Leu的至少一个密码子是CTA，产生Asn的至少一个密码子是AAT，产生Gln的至少一个密码子是CAA，产生Val的至少一个密码子是GTA，或者产生Tyr的至少一个密码子是TAT，其中大于25％的Asp、Glu、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Gln、Val、以及Tyr氨基酸是密码子去优化的。在某些实施例中，相比野生型序列例如RSV A2品系19，大于75％的氨基酸是密码子去优化的。

在某些实施例中，NS1基因包含(SEQ ID NO:6)或与其具有大于70％、80％、90％、95％、97％、98％或99％或更大序列一致性的其变体。

在某些实施例中，NS2基因包含(SEQ ID NO:9)或与其具有大于70％、80％、90％、95％、97％、98％或99％或更大序列一致性的其变体。

在某些实施例中，RSV小疏水(SH)糖蛋白基因缺失。

在某些实施例中，核酸具有G基因的进一步密码子去优化，其中密码子去优化被配置成使得产生Gly的至少一个密码子是GGT，产生Asp的密码子是GAT，产生Glu的至少一个密码子是GAA，产生His的至少一个密码子是CAT，产生Ile的至少一个密码子是ATA，产生Lys的至少一个密码子是AAA，产生Leu的至少一个密码子是CTA，产生Asn的至少一个密码子是AAT，产生Gln的至少一个密码子是CAA，产生Val的至少一个密码子是GTA，或者产生Tyr的至少一个密码子是TAT，其中大于25％的Asp、Glu、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Gln、Val、以及Tyr氨基酸是密码子去优化的。

在某些实施例中，该G基因包含SEQ ID NO:18ATGTCGAAAAACAAAGACCAACGTACCGCGAAGACGTTAGAACGTACCTGGGATACTCTAAATCATTTACTATTCATATCGTCGTGCCTATATAAGCTAAATCTTAAATCGGTAGCACAAATAACACTATCCATACTGGCGATAATAATCTCGACTTCGCTTATAATAGCAGCGATCATATTTATAGCCTCGGCGAACCATAAAGTCACGCCAACGACTGCGATCATACAAGATGCGACATCGCAGATAAAGAATACAACGCCAACGTACCTAACCCAAAATCCTCAACTTGGTATCTCGCCCTCGAATCCGTCTGAAATAACATCGCAAATCACGACCATACTAGCGTCAACGACACCGGGAGTAAAGTCGACCCTACAATCCACGACAGTAAAGACGAAAAACACGACAACGACTCAAACGCAACCCTCGAAGCCGACCACGAAACAACGCCAAAATAAACCACCGAGCAAACCGAATAATGATTTTCACTTTGAAGTATTCAATTTTGTACCCTGTAGCATATGTAGCAATAATCCAACGTGCTGGGCGATCTGTAAAAGAATACCGAACAAAAAACCGGGAAAAAAAACCACGACCAAACCCACGAAAAAACCAACGCTCAAAACAACGAAAAAAGATCCCAAACCGCAAACCACGAAATCAAAAGAAGTACCCACGACCAAACCCACGGAAGAGCCGACCATAAACACGACCAAAACGAACATAATAACTACGCTACTCACGTCCAATACCACGGGAAATCCGGAACTCACGAGTCAAATGGAAACGTTTCACTCGACTTCGTCCGAAGGTAATCCATCGCCTTCGCAAGTCTCGACAACGTCCGAATACCCGTCACAACCGTCATCGCCACCGAACACGCCACGTCAGTAG或与其具有大于70％、80％、90％、95％、97％、98％或99％或更大序列一致性的其变体。

在某些实施例中，该G基因包含SEQ ID NO:19ATGTCGAAAAATAAAGACCAACGTACGGCGAAGACGCTAGAACGTACCTGGGATACGCTAAATCATTTACTATTTATATCGTCGTGCCTATATAAACTAAATCTTAAATCGGTAGCGCAAATAACACTATCGATACTGGCGATAATAATATCGACTTCGCTAATAATAGCAGCGATAATATTTATAGCCTCGGCGAATCATAAAGTCACGCCGACGACTGCGATAATACAAGATGCGACATCGCAAATAAAGAATACGACGCCAACGTATCTAACCCAAAATCCGCAACTTGGTATATCGCCCTCGAATCCGTCGGAAATAACATCGCAAATAACGACCATACTAGCGTCGACGACACCGGGTGTAAAGTCGACGCTACAATCCACGACGGTAAAGACGAAAAATACGACAACGACGCAAACGCAACCGTCGAAACCGACCACGAAACAACGTCAAAATAAACCACCGTCGAAACCGAATAATGATTTTCACTTTGAAGTATTTAATTTTGTACCCTGTTCGATATGTAGCAATAATCCGACGTGCTGGGCGATATGTAAAAGAATACCGAATAAAAAACCGGGAAAAAAAACGACGACCAAACCGACGAAAAAACCAACGCTAAAAACAACGAAAAAAGATCCGAAACCGCAAACCACGAAATCGAAAGAAGTACCCACGACGAAACCCACGGAAGAACCGACCATAAATACGACCAAAACGAATATAATAACTACGCTACTAACGTCCAATACGACGGGAAATCCGGAACTAACGAGTCAAATGGAAACGTTTCATTCGACTTCGTCGGAAGGTAATCCATCGCCGTCGCAAGTCTCGACGACTTCCGAATATCCGTCACAACCGTCGTCGCCACCGAATACGCCACGTCAATAG或与其具有大于70％、80％、90％、95％、97％、98％或99％或更大序列一致性的其变体。

在某些实施例中，该G基因包含SEQ ID NO:20ATGTCGAAAAATAAAGATCAACGTACGGCGAAAACGCTAGAACGTACGTGGGATACGCTAAATCATCTACTATTTATATCGTCGTGTCTATATAAACTAAATCTAAAATCGGTAGCGCAAATAACGCTATCGATACTAGCGATAATAATATCGACTTCGCTAATAATAGCGGCGATAATATTTATAGCGTCGGCGAATCATAAAGTAACGCCGACGACGGCGATAATACAAGATGCGACTTCGCAAATAAAAAATACGACGCCGACGTATCTAACGCAAAATCCGCAACTAGGTATATCGCCGTCGAATCCGTCGGAAATAACGTCGCAAATAACGACGATACTAGCGTCGACGACGCCGGGTGTAAAATCGACGCTACAATCGACGACGGTAAAAACGAAAAATACGACGACGACGCAAACGCAACCGTCGAAACCGACGACGAAACAACGTCAAAATAAACCGCCGTCGAAACCGAATAATGATTTTCATTTTGAAGTATTTAATTTTGTACCGTGTTCGATATGTTCGAATAATCCGACGTGTTGGGCGATATGTAAACGTATACCGAATAAAAAACCGGGTAAAAAAACGACGACGAAACCGACGAAAAAACCGACGCTAAAAACGACGAAAAAAGATCCGAAACCGCAAACGACGAAATCGAAAGAAGTACCGACGACGAAACCGACGGAAGAACCGACGATAAATACGACGAAAACGAATATAATAACGACGCTACTAACGTCGAATACGACGGGTAATCCGGAACTAACGTCGCAAATGGAAACGTTTCATTCGACtTCGTCGGAAGGTAATCCGTCGCCGTCGCAAGTATCGACGACtTCGGAATATCCGTCGCAACCGTCGTCGCCGCCGAATACGCCGCGTCAATAG或与其具有大于70％、80％、90％、95％、97％、98％或99％或更大序列一致性的其变体。

在某些实施例中，F基因编码位置557处的缬氨酸和位置66处的赖氨酸。在某些实施例中，F基因编码位置557处的缬氨酸并且F基因包含编码以下氨基酸序列中的一个或更多个的序列。F基因包含以下氨基酸序列中的两个、三个、四个、五个或全部：TTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCK(SEQ ID NO:11)、

ARSTPVPILKANAITTILAAVTFCFA(SEQ ID NO:12)、AVTFCFASSQNITEEFYQST(SEQ IDNO:13)、QSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKK(SEQ ID NO:14)、IKKNKCNGTDAKVKLMKQELDKYKNAV(SEQ ID NO:15)、以及FPQAEKCKVQSNRVFC DTMYSLTLPSEVNLCNV(SEQ ID NO:16)。

在某些实施例中，F基因包含以下氨基酸序列中的两个、三个、四个、五个或全部：(SEQ ID NO:11)、(SEQ ID NO:12)、(SEQ ID NO:13)、(SEQ ID NO:14)、(SEQ ID NO:15)、以及(SEQ ID NO:16)。

在某些实施例中，F基因编码位置557处的缬氨酸并且F基因编码以下氨基酸中的一个或更多个：位置8处的天冬酰胺、位置20处的苯丙氨酸、位置35处的丝氨酸、位置66处的赖氨酸、位置79处的甲硫氨酸、位置124处的赖氨酸、位置191处的精氨酸、位置213处的精氨酸、位置354处的谷氨酸、位置357处的赖氨酸、位置371处的酪氨酸、位置384处的缬氨酸、位置115处的天冬酰胺、以及位置523处的苏氨酸。

在某些实施例中，F基因编码位置557处的缬氨酸和位置66处的赖氨酸以及位置79处的甲硫氨酸。

在某些实施例中，F基因编码位置557处的缬氨酸和位置66处的赖氨酸以及位置191处的精氨酸。

在某些实施例中，F基因编码位置557处的缬氨酸、位置66处的赖氨酸、位置191处的精氨酸以及位置357处的赖氨酸。

在某些实施例中，F基因编码位置557处的缬氨酸、位置66处的赖氨酸、位置79处的甲硫氨酸以及位置115处的天冬酰胺。

在某些实施例中，F基因编码SEQ ID NO:17MELPILKANAITTILAAVTFCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKKNKCNGTDAKVKLMKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPAANNRARRELPRFMNYTLNNTKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSRVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCRISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAEKCKVQSNRVFCDTMYSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN或含有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸取代的变体，其条件是F基因编码位置557处的缬氨酸。在某些实施例中，氨基酸取代是保守取代。

在某些实施例中，本披露涉及一种分离的重组核酸，该重组核酸包含编码(SEQ IDNO:17)或含有一个或两个氨基酸取代的变体的F基因，其条件是F基因编码位置557处的缬氨酸和位置66处的赖氨酸。

在某些实施例中，F基因编码位置557处的缬氨酸和位置66处的赖氨酸。

在某些实施例中，F基因编码位置557处的缬氨酸和位置66处的赖氨酸以及位置79处的甲硫氨酸。

在某些实施例中，F基因编码位置557处的缬氨酸、位置66处的赖氨酸、位置191处的精氨酸以及位置357处的赖氨酸。

在某些实施例中，F基因编码位置557处的缬氨酸、位置66处的赖氨酸、位置79处的甲硫氨酸以及位置115处的天冬酰胺。

在某些实施例中，本披露涉及一种包含在此披露的一种核酸的重组载体。在某些实施例中，本披露涉及一种包含在此披露的重组载体、重组RSV或减毒重组RSV的细胞。

在某些实施例中，本披露涉及编码(SEQ ID NO:17)或含有一个氨基酸取代的变体的F基因，其条件是F基因编码位置557处的缬氨酸。

在某些实施例中，本披露涉及一种编码MELPILKANAITTILAAVTFCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLMKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPAANNRARRELPRFMNYTLNNTKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSRVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCRISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAEKCKVQSNRVFCDTMYSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN(SEQ ID NO:21)的F基因。在某些实施例中，F基因编码位置557处的缬氨酸和位置66处的谷氨酸以及位置191处的精氨酸。

在某些实施例中，本披露涉及包含在此披露的一种RSV F蛋白序列的重组多肽。在某些实施例中，本披露涉及通过重组方法产生的包含在此披露的一种RSV F蛋白序列的病毒颗粒或病毒样颗粒。

在某些实施例中，本披露涉及一种分离的重组核酸，该核酸包含SEQ ID NO:1或与其具有大于70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大序列一致性的变体的一个RSV基因组OE1。

在某些实施例中，本披露涉及一种分离的重组核酸，该核酸包含SEQ ID NO:2或与其具有大于70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大序列一致性的变体的一个RSV基因组OE2。

在某些实施例中，本披露涉及一种分离的重组核酸，该核酸包含SEQ ID NO:3或与其具有大于70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大序列一致性的变体的一个RSV基因组OE3。

在某些实施例中，本披露涉及一种分离的重组核酸，该核酸包含SEQ ID NO:4或与其具有大于70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大序列一致性的变体的一个RSV基因组OE4。

在某些实施例中，本披露涵盖包含RSV基因组OE1、OE2、OE3和OE4的分离的重组核酸，其中缺失NS1基因和NS2基因中的一者或两者。在细菌人工染色体中培育RSV

在大肠杆菌中培育RSV可以通过利用细菌人工染色体(BAC)来完成。披露了含有呼吸道合胞病毒(RSV)株系A2的除F基因以外的完整反基因组序列的BAC，该F基因是RSV株系19的反基因组序列。连同辅助质粒，它可以在反向遗传学系统中用于恢复感染病毒。质粒上的反基因组序列可以在病毒恢复之前突变以产生具有所希望的突变的病毒。

出于若干原因，质粒是对当前RSV反基因组质粒的改进。各RSV侧接有限制性内切核酸酶切割位点以允许容易地操纵任何基因。作为用于病毒诱变的基础，此质粒可以用于设计减毒病毒以便在疫苗中使用。在第一RSV基因之前一种编码单体katushka 2、mKate2蛋白的额外基因已被包括在反基因组内。mKate2蛋白是一种远红外荧光蛋白，其将与其他RSV基因一齐表达并且将充当病毒复制的可视性证据。还对侧接RSV反基因组的核糖核酸酶序列进行改变并且通过反向遗传学在感染病毒产生中起作用。

所披露的载体允许通过重组工程有效诱变。这种诱变方法需要很少乃至不需要连接克隆，但是依赖于存在于携有来自噬菌体的某些基因的细菌中的重组机制。因为RSVcDNA通常在主要用于克隆的细菌(如大肠杆菌(E.coli)内的中至高拷贝数的克隆载体中不稳定，细菌人工染色体的单数位拷贝性质减小了该不稳定性，并且该减小的不稳定性被认为是由于该单拷贝性质限制了大肠杆菌识别RSV cDNA中的隐藏性启动子(crypticpromoters)并且产生毒性蛋白的能力而出现。

呼吸道合胞病毒(RSV)

典型地，RSV颗粒含有位于螺旋形核壳内的病毒基因组，该螺旋形核壳被基质蛋白和含包膜的病毒糖蛋白围绕。野生型RSV的基因组编码蛋白NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2-1、M2-2以及L。G、F以及SH是糖蛋白。F基因已被并入多种病毒疫苗中。RSV聚合酶活性由大蛋白(L)和磷蛋白(P)组成。病毒M2-1蛋白在转录过程中使用并且可能是转录酶复合体的组分。病毒N蛋白用于使新生RNA壳体化。

基因组在宿主细胞的细胞质中转录并复制。宿主细胞转录通常引起甲基化和聚腺苷酸化mRNA的合成。反基因组是复制过程中产生的基因组的正义RNA补体，其进而充当基因组合成的模板。病毒基因侧接保守的基因起始(GS)和基因末端(GE)序列。基因组的3'和5'末端是前导核苷酸和尾随核苷酸。野生型前导序列含有在3'末端的启动子。当病毒聚合酶到达GE信号时，该聚合酶使mRNA聚腺苷酸化并释放并且在下一个GS信号处重新启始RNA合成。据信L-P复合体负责启动子的识别、RNA合成、mRNA的5'末端的封端和甲基化以及它们的3'末端的聚腺苷酸化。据信聚合酶有时从接点处的基因解离。因为聚合酶在基因组的3'末端处启始转录，所以这产生一个表达梯度，其中基因组的3'末端处的基因比5'末端处的基因更频繁地转录。

为了复制基因组，聚合酶不响应于顺式作用的GE和GS信号并且产生基因组的正义RNA补体，即反义基因组。在反义基因组的3'末端处的是含有启动子的尾随序列的补体。聚合酶使用此启动子来产生基因组正义RNA。不像作为裸RNA释放的mRNA，反基因组和基因组RNA在合成时被病毒核蛋白(N)壳体化。

在某些实施例中，本披露涉及含有一种或更多种RSV基因如野生型基因组或反基因组的载体和核酸。RSV反基因组的一个实例提供在美国专利号6,790,449中，该专利通过引用特此结合。提及RSV基因和基因组预期包括某些突变、缺失或变体组合，如RSV的冷传代(cp)和温度敏感(ts)衍生物cpRSV，如rA2cp248/404/1030ΔSH。rA2cp248/404ΔSH含有4种独立的减毒遗传因子：cp，其基于N和L蛋白以及F糖蛋白中的5错义突变，这些蛋白一起赋予cpRSV的非ts减毒表型；ts248，L蛋白中的错义突变；ts404，M2基因的基因起始转录信号中的核苷酸取代；ΔSH，SH基因的完全缺失。rA2cp248/404/1030ΔSH含有5种独立的减毒遗传因子：存在于rA2cp248/404ΔSH中的那些以及ts1030，其为L蛋白中的另一种错义突变。参见卡伦(Karron)等人,传染病杂志(J Infect Dis.),2005,191(7):1093-1104，其通过引用特此结合。在某些实施例中，预期RSN反基因组可以含有非必要基因(例如，SH、NS1、NS2、以及M2-2基因)的缺失或突变或其组合。

细菌人工染色体(BAC)

在某些实施例中，本披露涉及含有细菌人工染色体的载体和核酸。用于复杂基因组的基因作图和分析的细菌克隆系统已在Shizuya等人,美国科学院院刊,1992,89:8794-8797中披露。BAC系统(用于细菌人工染色体)是基于大肠杆菌及其单拷贝质粒F因子，据描述它们可用于克隆大片段的人DNA。F因子编码调控其自身复制的基因，包括oriS、repE、parA、以及parB。oriS和repE基因介导F因子的单向复制，而parA和parB典型地维持每大肠杆菌基因组中一个或两个水平上的拷贝数。预期基因和染色体可以含有突变、缺失或具有所希望的功能属性的变体。BAC载体(pBAC)典型地含有这些基因以及抗性标志物和含有用于通过连接到限制性内切酶位点中而并入目标核酸区段的启动子的克隆区段。示例性BAC系统包括Shizuya和Kouros-Hehr,Keio医学杂志(Keio J Med),2001,50(1):26-30中描述的那些，其通过引用特此结合。

人们可从在此披露的RSV BAC质粒中重新构成感染性RSV病毒。BAC载体可以通过电穿孔转染至如大肠杆菌的细菌。在此披露的RSV-BAC可以稳定地维持在细菌中，从细菌重新分离，并且连同表达N、P、L、以及M2-1蛋白的一个或更多个载体插入真核细胞中。这些细胞产生感染性RSV颗粒。感染性RSV的产生是由在T7启动子的控制下将编码N、P、L及M2-1蛋白以及反基因组的质粒共转染到表达T7 RNA聚合酶的BHK-21细胞(BSR细胞)中所引起的。参见巴克霍尔兹(Buchholz)等人,病毒学杂志(J Virol.),2000,74(3):1187-1199，其通过引用特此结合。

疫苗

作为用于鼻内给药的候选疫苗的多种减毒RSV株系已使用多轮次的化学诱变来发展以将多重突变引入病毒中。在啮齿动物、黑猩猩、成人和婴儿中的评估指示这些候选疫苗中的某些是免疫原性的，并且可以被减毒。对这些减毒病毒中的一些的核苷酸序列分析指示每个水平的增加减毒典型地与两个或更多个新核苷酸和氨基酸取代相关联。

本披露提供了通过单独地和以各种组合将突变引入感染RSV的基因组和反基因组中来区分偶然沉默突变与造成表型差异的那些突变的能力。此过程鉴定造成表型如减毒、温度敏感性、冷适应、小空斑大小、宿主范围限制等的突变。然后可以各种组合引入来自此选单的突变以便如所希望的将疫苗病毒调整到适当的减毒水平。此外，本披露提供将来自不同病毒株系的突变组合到一个株系中的能力。

本披露还提供减毒的方法。例如，RSV的单个内部基因可被它们的牛、鼠或其他RSV对应物置换。这可包括NS1、NS2、N、P、M、SH、M2-1、M2-2以及L基因中的一个或更多个的部分或全部，或者G和F基因的部分。相互地，提供通过将人减毒基因插入牛RSV基因组或反基因组背景中而产生减毒活牛RSV的手段。携牛RSV糖蛋白的人RSV提供对于人疫苗制剂有利的宿主范围限制。可用于本披露的牛RSV序列在例如派斯提(Pastey)等人,遗传病毒学杂志(J.Gen.Viol.)76:193-197(1993)；派斯提等人,病毒研究(Virus Res.)29:195-202(1993)；萨莫拉(Zamora)等人,遗传病毒学杂志73:737-741(1992)；玛利帕蒂(Mallipeddi)等人,遗传病毒学杂志74:2001-2004(1993)；玛利帕蒂等人,遗传病毒学杂志73:2441-2444(1992)；以及萨莫拉等人,病毒研究24:115-121(1992)中描述，这些文献各自通过引用结合在此。

本披露还提供了分析其他类型的减毒突变并且将它们并入感染RSV中用于疫苗或其他用途的能力。例如，小鼠肺炎病毒(RSV的鼠对应物)的适应组织培养的不致病株系缺少G蛋白的胞质尾区(兰德哈瓦(Randhawa)等人,病毒学(Virology)207:240-245(1995))。同样，RSV糖蛋白F、G以及SH各自的胞质和跨膜结构域可以缺失或修饰以实现减毒。

用于本发明的感染RSV的其他突变包括在RSV微型基因组的突变分析过程中鉴定的顺式作用信号中的突变。例如，前导序列和尾随序列以及侧翼序列的插入和缺失分析鉴定了病毒启动子和转录信号，并且提供一系列与不同程度的RNA复制或转录降低相关联的突变。这些顺式作用信号的饱和诱变(借此每个位置依次被修饰成各核苷酸替代物)还鉴定了降低(或在一种情况下增加)RNA复制或转录的许多突变。可以将这些任何突变插入如在此描述的完整反基因组或基因组中。其他突变涉及将基因组的3'末端用其来自反基因组的对应物置换，该对应物与RNA复制和转录中的变化相关联。另外，基因区间(柯林斯(Collins)等人,美国科学院院刊83:4594-4598(1986)，通过引用特此结合)可以被缩短或加长或改变序列内容物，并且天然发生的基因重叠(柯林斯等人,美国科学院院刊84:5134-5138(1987)，通过引用特此结合)可以通过在此描述的方法去除或改变成不同的基因区间。

在另一个实施例中，可用于疫苗制剂的RSV可以被方便地修饰以适应循环病毒(包括抗原亚组A和B)中的抗原变异以及这些亚组内的变异。典型地，修饰将是在G和/或F蛋白中。将整个G或F基因或其编码特定免疫原性区的区段通过置换感染性克隆中的相对应区域或通过添加一个或更多个基因拷贝而并入RSV基因组或反基因组cDNA中使得表现出若干抗原形式。由修饰的RSV cDNA产生的子代病毒然后可用于针对新型株系的疫苗接种方案。另外，包含RSV亚组B的G蛋白将增宽对覆盖感染人群的相对多样性亚组A和B的更宽光谱的应答。

本披露的感染性RSV克隆还可以被工程化以增强其免疫原性并且诱导相比由自然感染提供的更大水平的保护，或反之亦然，以便鉴定并且消除与不希望的免疫病理学反应相关联的表位。通过本披露产生的疫苗的增强的免疫原性解决了控制RSV的最大障碍中的一个，即由自然感染诱导的免疫性的不完整性质。可将另外的基因插入受一组独立的转录信号控制的RSV基因组或反基因组中。目标基因包括编码细胞因子(例如，L-2到IL-15，尤其是IL-3、IL-6和IL-7等)、γ-干扰素、以及富集T辅助细胞表位的蛋白的那些。另外的蛋白可以作为单独的蛋白或作为从RSV蛋白之一如SH的第二拷贝工程化得到的嵌合体来表达。这提供了定量地和定性地修改和提高对RSV的免疫应答的能力。

对于疫苗用途，根据本公开产生的病毒可以直接在疫苗制剂中使用，或如所希望的使用技术人员众所周知的冻干方案来冻干。冻干的病毒将典型地维持在约4摄氏度下。当准备使用时，在稳定液(例如，盐水或包含SPG、Mg和HEPES)中，在有无佐剂的情况下重新构成冻干病毒，如在下文进一步描述的。

因此本披露的RSV疫苗含有作为活性成分的免疫遗传学上有效量的如在此所述制备的RSV。修饰的病毒可以利用生理学上可接受的载体和/或佐剂引入宿主中。有用的载体在本领域中是众所周知的，并且包括例如水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘胺酸、透明质酸等。所得的水溶液可以被包装以供原样使用，或者被冻干，如上文所提及的在给药前将该冻干制剂与无菌溶液组合。组合物可以含有如接近生理条件所需要的药学上可接受的辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺等等。可接受的佐剂包括不完全弗氏佐剂、磷酸铝、氢氧化铝或明矾，这些是本领域众所周知的材料。

当通过气溶胶、滴剂、口服、局部或其他途径用在此所述的RSV组合物进行免疫接种时，宿主的免疫系统通过产生特异于RSV病毒蛋白例如F和G糖蛋白的抗体而响应于疫苗。由于该疫苗接种，宿主变得对RSV感染至少部分地或完全地免疫，或对发展中度或严重的RSV感染，特别是下呼吸道RSV感染具有抗性。

给予疫苗的宿主可以是易感于RSV感染或紧密相关的病毒感染的任何哺乳动物，并且宿主能够产生针对接种株系的抗原的保护性免疫应答。因而，适合的宿主包括人、非人灵长类动物、牛、马的、猪、绵羊、山羊、兔、啮齿目动物等。因此，本披露提供了用于产生用于各种人用和兽用的疫苗的方法。

将含有本披露的RSV的疫苗组合物给予易感于RSV感染或以其他方式有RSV感染风险的宿主以便增强该宿主的自身免疫应答能力。这样的量被定义为“免疫原性有效剂量”。在此用途中，精确的量同样取决于宿主的健康状态和体重、给药方式、制剂性质。疫苗制剂应提供足以有效保护宿主患者免患严重的或威胁生命的RSV感染的量的本披露的修饰的RSV。

根据本披露产生的RSV可以与其他亚组或株系的病毒组合以实现针对多种RSV亚组或株系的保护，或者这些株系的保护性表位可以被工程化到如在此所述的一种病毒中。典型地，不同的病毒将呈混合物并且同时给予，但还可以单独给予。例如，因为这两个RSV亚组的F糖蛋白在氨基酸序列上的差异仅为约11％，这种相似性是如在用RSV或F抗原免疫并且用异源株系激发的动物中观察到的交叉保护性免疫应答的基础。因此，用一种株系免疫可以防御相同或不同亚组的不同株系。

在一些情况下，可能希望将本披露的RSV疫苗与诱导针对其他抗原，特别是其他儿童病毒的保护性应答的疫苗组合。例如，本披露的RSV疫苗可以与例如描述在通过引用结合在此的克莱门特(Clements)等人,临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)29:1175-1182(1991)中的副流感病毒疫苗同时给予。在本披露的另一方面，RSV可以用作用于其他呼吸道病原体如副流感病毒的保护性抗原的载体，其方式为将编码这些保护性抗原的序列并入用于产生如在此所述的感染性RSV的RSV基因组或反基因组中。

可以执行本披露的疫苗组合物的单次或多次给药。在新生儿和婴儿中，可能需要多次序贯给药以引发足够的免疫性水平。可以在生命的第一个月内开始给药，或者在约两个月大时之前，典型地不晚于六个月大时，并且在整个童年时期间隔地，如间隔两个月、六个月、一年或两年给药，如维持足够的天然(野生型)RSV感染防御水平所必需的。同样，特别易感于重复的或严重的RSV感染的成年人，例如像卫生保健工作者、日常护理工人、幼儿的家庭成员、老年人(超过55、60、或65岁)、心肺功能受损的个体，可能需要多次免疫以建立和/或维持保护性免疫应答。诱导免疫性的水平可以通过测量中和分泌和血清抗体的量进行监测，并且在必要时调整剂量或重复疫苗接种以维持所希望的保护水平。另外，不同的疫苗病毒可能有利于不同的受者组。例如，表达富集T细胞表位的额外蛋白的工程化RSV株系相比婴儿可能特别有利于成人。

在本披露的又一个方面，RSV被用作用于呼吸道的瞬时基因治疗的载体。根据本实施例，重组RSV基因组或反基因组并入能够编码目标基因产物的序列。目标基因产物受相同或不同启动子的控制，该启动子控制RSV表达。将通过共表达重组RSV基因组或反基因组与N、P、L和M2-1蛋白并且包含编码目标基因产物的序列而产生的感染性RSV给予患者。给药典型地是通过气溶胶、喷雾器或其他局部施用给予正在接受治疗的患者的呼吸道。以足以引起所希望基因产物的治疗或预防水平的表达的量给予重组RSV。以此方法给予的代表性基因产物的实例包括那些编码例如特别适合于瞬时表达的那些的那些基因产物，例如白介素-2、白介素-4、γ-干扰素、GM-CSF、G-CSF、促红细胞生成素、和其它细胞因子、葡糖脑苷脂酶、苯丙氨酸羟化酶、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、细胞毒素、肿瘤抑制基因、反义RNA、以及疫苗抗原。

在某些实施例中，本披露涉及免疫原性组合物(例如，疫苗)，该免疫原性组合物包含免疫有效量的本发明的重组RSV(例如，减毒的活重组RSV或灭活的非复制型RSV)、免疫有效量的在此披露的多肽、和/或免疫有效量的在此披露的核酸。

在某些实施例中，本披露涉及用于刺激个体的免疫系统产生针对RSV的保护性免疫应答的方法。在这些方法中，免疫有效量的在此披露的重组RSV、免疫有效量的在此披露的多肽、和/或免疫有效量的在此披露的核酸以生理学上可接受的载体给予个体。

典型地，载体或赋形剂是药学上可接受的载体或赋形剂，如无菌水、盐水溶液、缓冲盐水溶液、葡萄糖水溶液、甘油水溶液、乙醇、或其组合。根据本领域确立的方案实现确保无菌性、pH、等渗性以及稳定性的此类溶液的制备。总体上，载体或赋形剂经选择，以便最小化过敏和其他不良效应，并且以便适合具体给药途径，例如皮下、肌内、鼻内、口服、局部等。所得的水溶液可以例如被包装以供原样使用，或者被冻干，在给药前将该冻干制剂与无菌溶液组合。

在某些实施例中，给予足以刺激特异于一种或更多种株系的RSV的免疫应答的量的RSV(或RSV组分)(例如，给予免疫有效量的RSV或RSV组分)。优选地，RSV的给予引发保护性免疫应答。用于引发保护性抗病毒免疫应答的剂量和方法可调适来产生针对RSV的保护性免疫应答，这些剂量和方法是本领域技术人员已知。参见，例如，美国专利号5,922,326；赖特(Wright)等人(1982)感染免疫学(Infect.Immun.)37:397-400；吉姆(Kim)等人(1973)儿科学(Pediatrics)52:56-63；以及赖特等人(1976)儿科学杂志(J.Pediatr.)88:931-936。例如，病毒可在每给予剂量约103-106pfu(噬斑形成单位)的范围内来提供(例如，每给予剂量104-105pfu)。典型地，剂量将根据例如年龄、身体状况、体重、性别、饮食、给药方式和时间、以及其他临床因素来调整。预防性疫苗制剂可以例如通过使用针和注射器或无针注射装置进行皮下或肌内注射来全身给予。优选地，疫苗制剂例如通过滴剂、气溶胶(例如，大颗粒气溶胶(大于约10微米))，或喷入上呼吸道而鼻内给药。虽然任何上述递送途径都引起保护性全身免疫应答，但鼻内给药赋予在病毒进入位点处引发粘膜免疫性的额外益处。对于鼻内给药，减毒活病毒疫苗通常是优选的，例如减毒的、冷适应的和/或温度敏感的重组RSV，例如嵌合重组RSV。作为替代或补充的减毒活病毒疫苗，例如可以使用杀死的病毒疫苗、核酸疫苗、和/或多肽亚单位疫苗，如沃尔什(Walsh)等人(1987)传染病杂志(J.Infect.Dis.)155:1198-1204和墨菲等人(1990)疫苗(Vaccine)8:497-502所建议的。

在某些实施例中，减毒重组RSV如在疫苗中那样使用并且是充分减毒的，这样使得感染的症状，或至少严重感染的症状不会发生在用减毒RSV免疫(或以其他方式感染)的大多数个体中-在其中病毒组分(例如，在此的核酸或多肽)用作疫苗或免疫原性组分的实施例中。然而，毒力典型地被充分废止，这样使得轻度或严重的下呼吸道感染通常不发生在已经接种疫苗的宿主或偶见宿主中。

虽然用单剂量刺激保护性免疫应答是优选的，但可以通过相同或不同的途径给予额外的剂量，以达到所希望的预防效果。在新生儿和婴儿中，例如可能需要多次给药以引发足够的免疫性水平。可以在整个童年时期间隔地给药，如维持足够的野生型RSV感染防御水平所必需的。同样，特别易感于重复的或严重的RSV感染的成年人，例如像卫生保健工作者、日常护理工人、幼儿的家庭成员、老年人、以及心肺功能受损的个体，可能需要多次免疫以建立和/或维持保护性免疫应答。诱导免疫性的水平可以通过测量病毒中和分泌和血清抗体的量进行监测，并且在必要时调整剂量或重复疫苗接种以维持所希望的保护水平。

可替代地，免疫应答可通过用病毒活体外或体内靶向树突细胞来刺激。例如，将增殖树突细胞以足够的量并持续足够的时间段暴露于病毒，以允许树突细胞捕获RSV抗原。然后将细胞转移到待通过标准静脉内移植方法进行疫苗接种的受试者中。

任选地，用于RSV的预防性给药的制剂还含有用于增强对RSV抗原的免疫应答的一种或更多种佐剂。适合的佐剂包括，例如：完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、皂苷、矿物凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、普卢兰尼克多聚醇、聚阴离子、肽、油或烃乳剂、卡介苗(BCG)、短小棒状杆菌、以及合成佐剂QS-21。

如果需要的话，RSV预防性疫苗给予可以与一种或更多种免疫刺激分子的给予相结合来进行。免疫刺激分子包括具有免疫刺激、免疫增强以及促炎活性的各种细胞因子、淋巴因子和趋化因子，如白介素(例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13)；生长因子(例如，粒细胞-巨噬细胞(GM)-集落刺激因子(CSF))；以及其他免疫刺激分子，如巨噬细胞炎性因子、Flt3配体、B7.1；B7.2等等。免疫刺激分子可以在与RSV相同的制剂中给予，或者可以单独给予。可以给予蛋白质或编码该蛋白质的表达载体来产生免疫刺激效应。

虽然用特定亚组的特定株系的减毒RSV对个体进行疫苗接种可以诱导针对不同株系和/或亚组的RSV的交叉保护，但如果需要的话，可以通过用来自至少两种株系的减毒RSV(例如，每一种代表一个不同的亚组)对该个体进行疫苗接种来增强交叉保护。类似地，减毒RSV疫苗可任选地与诱导针对其他感染性因子的保护性免疫应答的疫苗组合。

实验

A2-品系19F-I557V病毒在BALB/c小鼠中是免疫原性的

这在图7中显示，其示出该病毒相比RSV A2和RSV A2-品系19F诱导更高水平的RSV中和血清抗体。图7B显示，即使是低输入剂量，当在初次感染后29天激发时，这种病毒也提供针对RSV异源株系激发的全面保护。对于RSV的其他两个株系，A2-K-品系19F和A2-K-A2GF，没有看到这种低剂量免疫下的全面保护，这允许突破再感染。这两种病毒类似于A2-品系19F-I557V，除了F蛋白，表明由该病毒编码的I557V F蛋白对于该表型是重要的。

除了是免疫原性的(图7A)，在A2-品系19F-I557V病毒是热稳定的。病毒的热稳定性被测量为病毒在4℃或37℃下孵育时在多天内保持滴度的能力。结果表明，该病毒在两个测试温度下比A2-K-A2GF病毒更热稳定，在4℃下比A2-品系19F更稳定。如上所述，F基因是这两种病毒之间的唯一差异，表明这种独特的F蛋白造成该表型。

A2-品系19F RSV株系比A2株系更稳定，在19F蛋白的背景中557处的Val使该病毒甚至更稳定。其他株系中557位的Val也可能稳定-557位和稳定性。在某些实施例中，本披露涵盖在任何F株系背景下，影响病毒的热稳定性的557位(任何氨基酸，例如，丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸)的其他突变。

具有NS1和NS2密码子沉默突变的重组RSV的产生和生长衰减

将在人类中罕见的密码子用于制备具有NS1和NS2基因的重组RSV，下文称为dNS1h和dNS2h。将在RSV中罕见的密码子用于制备具有NS1和NS2基因的重组RSV，下文称为dNS1v和dNS2v。图1提供了用于确定最优序列的表。重组RSV用针对NS1和NS2基因的以下核苷酸序列来制备。重要的是要注意，在测试密码子之前，这是不可预测的，如果罕见人类密码子或罕见密码子将产生所希望的候选RSV疫苗。使用RSV序列罕见的密码子的实验具有表达增加这种非预期和不良影响。使用人类序列罕见的密码子具有表达增加这种期望的影响。比较人类序列罕见的NS密码子和RSV序列罕见的NS密码子的实验表明，人类序列罕见的的密码子对于疫苗开发是优先的。

dNS1h核苷酸系列(SEQ ID NO:6)相比野生型A2中的NS1，420个核苷酸中84个不同(20％)且140个密码子中68个不同(48％)

SEQ ID NO:6

ATGGGTTCGAATTCGCTATCGATGATAAAAGTACGTCTACAAAATCTATTTGATAATGATGAAGTAGCGCTACTAAAAATAACGTGTTATACGGATAAACTAATACATCTAACGAATGCGCTAGCGAAAGCGGTAATACATACGATAAAACTAAATGGTATAGTATTTGTACATGTAATAACGTCGTCGGATATATGTCCGAATAATAATATAGTAGTAAAATCGAATTTTACGACGATGCCGGTACTACAAAATGGTGGTTATATATGGGAAATGATGGAACTAACGCATTGTTCGCAACCGAATGGTCTACTAGATGATAATTGTGAAATAAAATTTTCGAAAAAACTATCGGATTCGACGATGACGAATTATATGAATCAACTATCGGAACTACTAGGTTTTGATCTAAATCCGTAA

dNS1v核苷酸系列(SEQ ID NO:7)相比野生型A2中的NS1，420个核苷酸中145个不同(34％)且140个密码子中122个不同(87％)

SEQ ID NO:7

ATGGGGTCGAACTCGCTCTCGATGATCAAGGTCCGCCTCCAGAATCTCTTCGACAACGACGAGGTCGCGCTCCTCAAGATCACGTGTTACACGGACAAGCTCATCCACCTCACGAACGCGCTCGCGAAGGCGGTCATCCACACGATCAAGCTCAACGGGATCGTCTTCGTCCACGTCATCACGTCGTCGGACATCTGTCCGAACAACAACATCGTCGTCAAGTCGAACTTCACGACGATGCCGGTCCTCCAGAACGGGGGGTACATCTGGGAGATGATGGAGCTCACGCACTGTTCGCAGCCGAACGGGCTCCTCGACGACAACTGTGAGATCAAGTTCTCGAAGAAGCTCTCGGACTCGACGATGACGAACTACATGAACCAGCTCTCGGAGCTCCTCGGGTTCGACCTCAACCCGTAA

dNS2h核苷酸系列(SEQ ID NO:9)相比野生型A2中的NS1，420个核苷酸中82个不同(21％)且140个密码子中73个不同(58％)

SEQ ID NO:9

ATGGATACGACGCATAATGATAATACGCCGCAACGTCTAATGATAACGGATATGCGTCCGCTATCGCTAGAAACGATAATAACGTCGCTAACGCGTGATATAATAACGCATAAATTTATATATCTAATAAATCATGAATGTATAGTACGTAAACTAGATGAACGTCAAGCGACGTTTACGTTTCTAGTAAATTATGAAATGAAACTACTACATAAAGTAGGTTCGACGAAATATAAAAAATATACGGAATATAATACGAAATATGGTACGTTTCCGATGCCGATATTTATAAATCATGATGGTTTTCTAGAATGTATAGGTATAAAACCGACGAAACATACGCCGATAATATATAAATATGATCTAAATCCGTAA

dNS2v核苷酸系列(SEQ ID NO:10)相比野生型A2中的NS1，420个核苷酸中103个不同(27％)且140个密码子中92个不同(73％)

SEQ ID NO:10

ATGGACACGACGCACAACGACAACACGCCGCAGCGCCTCATGATCACGGACATGCGCCCGCTCTCGCTCGAGACGATCATCACGTCGCTCACGCGCGACATCATCACGCACAAGTTCATCTACCTCATCAACCACGAGTGTATCGTCCGCAAGCTCGACGAGCGCCAGGCGACGTTCACGTTCCTCGTCAACTACGAGATGAAGCTCCTCCACAAGGTCGGGTCGACGAAGTACAAGAAGTACACGGAGTACAACACGAAGTACGGGACGTTCCCGATGCCGATCTTCATCAACCACGACGGGTTCCTCGAGTGTATCGGGATCAAGCCGACGAAGCACACGCCGATCATCTACAAGTACGACCTCAACCCGTAA

将60-70％汇合的BEAS-2B细胞系用如上所述的重组病毒以0.01的MOI(感染复数)感染(即，对于每100个细胞，存在一个感染性病毒颗粒)。这通过首先对感染前细胞计数，计算各孔中的细胞总数，然后计算每个病毒的感染量来进行。在室温下进行感染1小时，然后洗去。将感染的细胞留在37℃孵育器中5％CO2下持续多达96小时。在孵育和冷冻12、24、48、72以及96小时之后，取样品。在收集所有时间点的样品后，通过根据标准方案对Vero细胞系滴定来确定各样本中病毒的量，并且对于各样品计算低度(FFU/mL，这意味着每毫升的荧光焦点形成单位)。因为所用的病毒在基因组中具有红色荧光基因，在荧光显微镜下对感染的细胞计数，从而提供荧光焦点形成单位。每个数据点表示来自两个独立实验的一式两份样品。

如图2所示，kRSV-dNS1h(人去优化NS1+NS2病毒)的生长在感染后72和96小时在BEAS-2B细胞系中衰减。据信，这是由于NS1和NS2蛋白比野生型病毒降低。

为低拷贝数设计的质粒中的RSV的表达

感染性重组RSV(rRSV)可从转染的质粒中回收。RSV N、P、L和M 21蛋白以及全长反基因组RNA的共表达足以用于RSV复制。感染性RSV可以通过在T7启动子控制下将编码N、P、L及M2-1蛋白以及反基因组cDNA的质粒共转染到表达T7 RNA聚合酶的BHK-21细胞(BSR细胞)中来产生。当前研究实验室通常使用在质粒pBR322中克隆的RSV反基因组cDNA(中等拷贝数，每个大肠杆菌15-20个拷贝)。为了维持该质粒中的反基因组cDNA，使细菌在30℃和低通气下生长。然而，经常经历质粒重排和克隆损失。

发现包含病毒的附着糖蛋白(G)和融合(F)基因的RSV cDNA的级分不可在基于pUC的质粒中克隆(大肠杆菌中500-700个质粒拷贝)。将该片段在称为pLG338-30.5的低拷贝数(每大肠杆菌约5个拷贝)质粒中克隆。质粒pLG338-30被开发来增加克隆的慢病毒糖蛋白的稳定性。坎宁安(Cunningham)等人，基因(Gene),1993,124,93-98。假设大肠杆菌中的cDNA不稳定性源于病毒糖蛋白序列中隐藏性大肠杆菌转录子启动子的存在。因此，细菌中“无启动子”质粒内的cDNA不稳定性可能会出现，因为异常蛋白质从隐藏性启动子表达，导致毒性因质粒拷贝数加剧。

生成含有其中A2 F基因被株系19F基因代替的RSV株系A2基因组的反基因组质粒。它来源于首次在柯林斯等人,美国科学院院刊,1995,92(25):11563–11567和美国专利号6,790,449(通过引用特此结合)中的反基因组质粒。该反基因组被消化掉质粒载体并且连接到pKBS3 BAC中。

GalK重组工程试剂获自NCI并且成功建立了BAC-RSV反向遗传学方案(图4和5)。参见http://web.ncifcrf.gov/research/brb/recombineeringInformation.aspx，其通过引用特此结合。通过BAC重组工程的RSV cDNA的突变增强了操纵RSV用于产生突变体的能力。该系统的另外一个益处是增强了BAC载体中全长反基因组cDNA的稳定性。

基于BAC的RSV反基因组载体在32℃和250RPM下增殖，在大肠杆菌中没有观察到任何载体重排或克隆损失。因此，BAC-RSV不仅能够通过重组工程进行操纵，而且总体上由于基因不稳定性的消除而促进RSV反向遗传学。

BAC载体中的RSV反基因组(pSynkRSV_品系19F构建)

RSV-BAC pSynkRSV_品系19F含有修饰的katushka基因(mKate2，荧光蛋白)以及用于方便的标准克隆方法的限制性位点。为了建立pSynkRSV，通过基因技术公司(Gene Art，合成DNA的公司)合成三个核酸片段。随后必须将这三个片段一起放在细菌人工染色体(BAC)中。这三个片段被称为pSynkRSV-BstBI_SacI(#1)、pSynkRSV-SacI_ClaI(#2)、以及pSynkRSV-ClaI_MluI(#3)。使用质粒pKBS3作为用于构建pSynkRSV的骨架。参见图6A-E。pSynkRSV含有调节细菌中的拷贝数和分区所需的细菌人工染色体序列。

为了插入三个合成区段，将寡核苷酸衔接子放到pKBS3中的两个现有限制性内切酶切割位点BstBI和MluI之间。

设计突出物，使得衔接子将连接到在BstBI和MluI位点的pKBS3中。下划线序列指示限制性位点：从右至左分别为SacI、ClaI、以及AvrII。这产生了含有限制性位点BstBI、SacI、ClaI、AvrII、以及MluI(以该顺序)的多克隆位点，以及称为pKBS5的质粒。参见图6A。一人将来自基因技术公司的SacI_ClaI区段(#2)切割并连接到pKBS5中。参见图6B。下一位使用酶AvrII和MluI(由于pSynkRSV-ClaI_MluI中的灭活ClaI限制性位点，不能再次使用ClaI)切割并连接#3区段。参见图6C。在这点上，质粒pKBS5含有从SacI到ClaI的基因技术公司序列、一些居间核苷酸(小于10个)、以及从AvrII到MluI的基因技术公司序列。一人使用BstBI和SacI切割并连接#1区段。参见图6D。此RSV BAC含有两个ClaI位点之间的约10个不期望的核苷酸(从区段#2和区段#3)。重组工程用来缺失那些核苷酸，从而产生pSynkRSV_品系19F。参见图6E。这三个区段应以此顺序连接，以避免来自多个限制性位点的潜在干扰。

作为减毒活疫苗(LAV)的重组呼吸道合胞病毒(RSV)

生成四个表达质粒，一个表达RSV核蛋白(N)，一个表达RSV磷蛋白(P)，一个表达RSV基质2ORF1蛋白(M2-1)，并且一个表达RSV大聚合酶(L)-pA2-Nopt、pA2-Popt、pA2-M2-1opt、以及pA2-Lopt。该术语反映的事实是，这些基因是RSV的A2株系，并且这些cDNA针对人密码子偏倚性优化以便增加在哺乳动物细胞中的表达水平。从cDNA回收重组RSV包括五个部件：全长RNA(例如由pSynk-RSVl19F提供)、以及RSV N、P、M2-1及L蛋白。四种辅助质粒pA2-Nopt、pA2-Popt、pA2-M2-1opt、以及pA2-Lopt可用于驱动RSV拯救。

产生了重组呼吸道合胞病毒株系A2-品系l9F，其中点突变产生在残基F557处，在此处异亮氨酸改变为缬氨酸(病毒名称：A2-品系l9F-I557V)。还产生了蛋白表达质粒，其编码品系19F蛋白，其中在位置557处发生同样的亮氨酸至缬氨酸突变(蛋白质名称–品系19F-I557V)。比起A2-品系l9F亲本病毒，在4℃和37℃下A2-品系19F-I557V具有更高的热稳定性。这种增加的稳定性可能有助于使得相对于A2-品系19F，A2-品系19F-I557V所致的中和抗体诱导和保护增加。

减毒活RSV疫苗的发展因婴幼儿(构成目标群体)中低的RSV免疫原性以及有限的基因组稳定性而受到阻碍。一种理想的疫苗是免疫原性的并且对于婴幼儿疫苗接种是基因和热稳定且安全的。

RSV的非结构(NS)蛋白1和2(NS1和NS2)与宿主细胞干扰素通路的抑制相关联，并因此潜在地限制了病毒的免疫原性。小疏水(SH)糖蛋白在膜中形成阳离子孔隙，调整宿主凋亡通路并且抑制肿瘤坏死因子-a(TNF-a)信号传导。SH、NSl和NS2对于病毒复制是可有可无的。然而，NS1和NS2缺失一起导致过度减毒。SH蛋白的缺失对目前正在评估的实验候选疫苗的衰减没有明显的影响。然而，SH缺失增强体外RSV复制并且可能增强下游基因，如抗原性G和F基因的表达。

在此所披露的候选RSV疫苗结合多种技术来克服在安全的候选病毒疫苗中免疫原性差以及遗传性和热稳定性有限的难题。RSV LAV OEl组合了免疫抑制蛋白NS1和NS2(通过密码子去优化)和SH蛋白(通过缺失)的有限表达，而无在稳定且具免疫原性的病毒背景中快速反向的可能性。

利用非结构(NS)基因NSl和NS2与含有残基557处的突变的A2-品系19F基因的基于BAC的RSV反向遗传学密码子去优化、以及RSV小疏水(SH)糖蛋白的缺失产生候选疫苗。

OE1病毒基因组(SEQ ID NO：1)

候选RSV疫苗基因型：

A2-mKate2-dNSh-ΔSH-A2G-品系19F-I557V(加标签的)

以及A2-dNSh-ΔSH-A2G-品系19F-I557V(未加标签的)

RSV附着糖蛋白(G)是一种高度糖基化蛋白，其存在两种变体形式：膜结合的和分泌的。评估RSV G的功能作用的研究表明，它在抑制toll样受体活化中起作用并且其

分泌形式可能作为免疫抗原诱饵。除了RSV F之外，G蛋白

也是免疫原性的，然而部分由于其广泛的糖基化作用，它是

用于产生中和抗体的差的抗原。RSV G对于病毒复制是不可缺少的，但

缺失导致过度衰减。因此，G可被认为是一种非必需的毒力基因。

RSV A2 G蛋白序列被取代，其含有M48I突变并且50％的密码子去优化[dGm(50％)]到RSV LAV OE1病毒基因组的背景中。OE2病毒背景包括非结构(NS)基因NS1和NS2与含有氨基酸残基557处的突变的A2-品系19F基因的密码子去优化、以及RSV小疏水(SH)糖蛋白的缺失。

OE2病毒基因组(SEQ ID NO:2)

候选RSV疫苗基因型：

A2-mKate2-dNSh-ΔSH-dGm(50％)-品系19F-I557V(加标签的)以及A2-dNSh-ΔSH-dGm(50％)-品系19F-I557V(未加标签的)

RSV LAV OE2通过密码子的50％密码子去优化、免疫调节蛋白NS1和NS2的100％密码子去优化、以及SH蛋白的缺失组合了免疫抑制糖蛋白G的降低表达，而无在稳定且具免疫原性的病毒背景中快速反向的可能性。

在第三个候选疫苗中，RSV A2 G蛋白序列被取代，其中一个含有M48I突变并且75％的密码子去优化[dGm(75％)]到RSV LAV OE1病毒基因组的背景中。OE3病毒背景包括非结构(NS)基因NS1和NS2与含有残基557处的突变的A2-品系19F基因的密码子去优化、以及RSV小疏水(SH)糖蛋白的缺失。

OE3病毒基因组(SEQ ID NO:3)

候选RSV疫苗基因型：

A2-mKate2-dNSh-ΔSH-dGm(75％)-品系19F-I557V(加标签的)

以及A2-dNSh-ΔSH-dGm(75％)-品系19F-I557V(未加标签的)

RSV LAV OE3通过密码子的75％密码子去优化、免疫调节蛋白NS1和NS2的100％密码子去优化、以及SH蛋白的缺失组合了免疫抑制糖蛋白G的降低表达，而无在稳定且具免疫原性的病毒背景中快速反向的可能性。

产生了RSV A2 G蛋白序列，其含有M48I突变并且100％的密码子去优化[dGm(100％)]到RSV LAV OE1病毒基因组的背景中。OE4病毒背景包括非结构(NS)基因NS1和NS2与含有残基557处的突变的A2-品系19F基因的密码子去优化、以及RSV小疏水(SH)糖蛋白的缺失。

OE4病毒基因组(SEQ ID NO：4)

候选RSV疫苗基因型：

A2-mKate2-dNSh-ΔSH-dGm(100％)-品系19F-I557V(加标签的)

以及A2-dNSh-ΔSH-dGm(100％)-品系19F-I557V(未加标签的)。

序列表

<110> 爱默蕾大学

亚特兰大儿童医疗保健公司

<120> 具有沉默突变的重组RSV、其相关疫苗和方法

<130> 13070 PCT

<150> US 61/781,228

<151> 2013-03-14

<160> 21

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 15573

<212> DNA

<213> 呼吸道合胞病毒

<400> 1

acgcgaaaaa atgcgtacaa caaacttgca taaaccaaaa aaatggggca aataagaatt 60

tgataagtac cacttaaatt taactccctt gcttagcgat ggtgagcgag ctgattaagg 120

agaacatgca catgaagctg tacatggagg gcaccgtgaa caaccaccac ttcaagtgca 180

catccgaggg cgaaggcaag ccctacgagg gcacccagac catgagaatc aaggcggtcg 240

agggcggccc tctccccttc gccttcgaca tcctggctac cagcttcatg tacggcagca 300

aaaccttcat caaccacacc cagggcatcc ccgacttctt taagcagtcc ttccccgagg 360

gcttcacatg ggagagagtc accacatacg aagacggggg cgtgctgacc gctacccagg 420

acaccagcct ccaggacggc tgcctcatct acaacgtcaa gatcagaggg gtgaacttcc 480

catccaacgg ccctgtgatg cagaagaaaa cactcggctg ggaggcctcc accgagaccc 540

tgtaccccgc tgacggcggc ctggaaggca gagccgacat ggccctgaag ctcgtgggcg 600

ggggccacct gatctgcaac ttgaagacca catacagatc caagaaaccc gctaagaacc 660

tcaagatgcc cggcgtctac tatgtggaca gaagactgga aagaatcaag gaggccgaca 720

aagagaccta cgtcgagcag cacgaggtgg ctgtggccag atactgcgac ctccctagca 780

aactggggca cagatgagta ttcaattata gttattaaaa acttaacaga agacaaaaat 840

ggggcaaata agaatttgat aagtaccact taaatttaac tcccttgctt agcgatgggt 900

tcgaattcgc tatcgatgat aaaagtacgt ctacaaaatc tatttgataa tgatgaagta 960

gcgctactaa aaataacgtg ttatacggat aaactaatac atctaacgaa tgcgctagcg 1020

aaagcggtaa tacatacgat aaaactaaat ggtatagtat ttgtacatgt aataacgtcg 1080

tcggatatat gtccgaataa taatatagta gtaaaatcga attttacgac gatgccggta 1140

ctacaaaatg gtggttatat atgggaaatg atggaactaa cgcattgttc gcaaccgaat 1200

ggtctactag atgataattg tgaaataaaa ttttcgaaaa aactatcgga ttcgacgatg 1260

acgaattata tgaatcaact atcggaacta ctaggttttg atctaaatcc gtaaattata 1320

attaatatca actagcaaat caatgtcact aacaccatta gttaatataa aacttaacag 1380

aagacaaaaa tggggcaaat aaatcaattc agccaaccca accatggata cgacgcataa 1440

tgataatacg ccgcaacgtc taatgataac ggatatgcgt ccgctatcgc tagaaacgat 1500

aataacgtcg ctaacgcgtg atataataac gcataaattt atatatctaa taaatcatga 1560

atgtatagta cgtaaactag atgaacgtca agcgacgttt acgtttctag taaattatga 1620

aatgaaacta ctacataaag taggttcgac gaaatataaa aaatatacgg aatataatac 1680

gaaatatggt acgtttccga tgccgatatt tataaatcat gatggttttc tagaatgtat 1740

aggtataaaa ccgacgaaac atacgccgat aatatataaa tatgatctaa atccgtaaat 1800

ttcaacacaa tattcacaca atctaaaaca acaactctat gcataactat actccatagt 1860

ccagatggag cctgaaaatt atagtaattt aaaattaagg agagatataa gatagaagat 1920

ggggcaaata caaagatggc tcttagcaaa gtcaagttga atgatacact caacaaagat 1980

caacttctgt catccagcaa atacaccatc caacggagca caggagatag tattgatact 2040

cctaattatg atgtgcagaa acacatcaat aagttatgtg gcatgttatt aatcacagaa 2100

gatgctaatc ataaattcac tgggttaata ggtatgttat atgcgatgtc taggttagga 2160

agagaagaca ccataaaaat actcagagat gcgggatatc atgtaaaagc aaatggagta 2220

gatgtaacaa cacatcgtca agacattaat ggaaaagaaa tgaaatttga agtgttaaca 2280

ttggcaagct taacaactga aattcaaatc aacattgaga tagaatctag aaaatcctac 2340

aaaaaaatgc taaaagaaat gggagaggta gctccagaat acaggcatga ctctcctgat 2400

tgtgggatga taatattatg tatagcagca ttagtaataa ctaaattagc agcaggggac 2460

agatctggtc ttacagccgt gattaggaga gctaataatg tcctaaaaaa tgaaatgaaa 2520

cgttacaaag gcttactacc caaggacata gccaacagct tctatgaagt gtttgaaaaa 2580

catccccact ttatagatgt ttttgttcat tttggtatag cacaatcttc taccagaggt 2640

ggcagtagag ttgaagggat ttttgcagga ttgtttatga atgcctatgg tgcagggcaa 2700

gtgatgttac ggtggggagt cttagcaaaa tcagttaaaa atattatgtt aggacatgct 2760

agtgtgcaag cagaaatgga acaagttgtt gaggtttatg aatatgccca aaaattgggt 2820

ggtgaagcag gattctacca tatattgaac aacccaaaag catcattatt atctttgact 2880

caatttcctc acttctccag tgtagtatta ggcaatgctg ctggcctagg cataatggga 2940

gagtacagag gtacaccgag gaatcaagat ctatatgatg cagcaaaggc atatgctgaa 3000

caactcaaag aaaatggtgt gattaactac agtgtactag acttgacagc agaagaacta 3060

gaggctatca aacatcagct taatccaaaa gataatgatg tagagctttg agttaataaa 3120

aaatggggca aataaatcat catggaaaag tttgctcctg aattccatgg agaagatgca 3180

aacaacaggg ctactaaatt cctagaatca ataaagggca aattcacatc acccaaagat 3240

cccaagaaaa aagatagtat catatctgtc aactcaatag atatagaagt aaccaaagaa 3300

agccctataa catcaaattc aactattatc aacccaacaa atgagacaga tgatactgca 3360

gggaacaagc ccaattatca aagaaaacct ctagtaagtt tcaaagaaga ccctacacca 3420

agtgataatc ccttttctaa actatacaaa gaaaccatag aaacatttga taacaatgaa 3480

gaagaatcca gctattcata cgaagaaata aatgatcaga caaacgataa tataacagca 3540

agattagata ggattgatga aaaattaagt gaaatactag gaatgcttca cacattagta 3600

gtggcaagtg caggacctac atctgctcgg gatggtataa gagatgccat gattggttta 3660

agagaagaaa tgatagaaaa aatcagaact gaagcattaa tgaccaatga cagattagaa 3720

gctatggcaa gactcaggaa tgaggaaagt gaaaagatgg caaaagacac atcagatgaa 3780

gtgtctctca atccaacatc agagaaattg aacaacctat tggaagggaa tgatagtgac 3840

aatgatctat cacttgaaga tttctgatta gttaccactc ttcacatcaa cacacaatac 3900

caacagaaga ccaacaaact aaccaaccca atcatccaac caaacatcca tccgccaatc 3960

agccaaacag ccaacaaaac aaccagccaa tccaaaacta accacccgga aaaaatctat 4020

aatatagtta caaaaaaagg aaagggtggg gcaaatatgg aaacatacgt gaacaagctt 4080

cacgaaggct ccacatacac agctgctgtt caatacaatg tcttagaaaa agacgatgac 4140

cctgcatcac ttacaatatg ggtgcccatg ttccaatcat ctatgccagc agatttactt 4200

ataaaagaac tagctaatgt caacatacta gtgaaacaaa tatccacacc caagggacct 4260

tcactaagag tcatgataaa ctcaagaagt gcagtgctag cacaaatgcc cagcaaattt 4320

accatatgcg ctaatgtgtc cttggatgaa agaagcaaac tagcatatga tgtaaccaca 4380

ccctgtgaaa tcaaggcatg tagtctaaca tgcctaaaat caaaaaatat gttgactaca 4440

gttaaagatc tcactatgaa gacactcaac cctacacatg atattattgc tttatgtgaa 4500

tttgaaaaca tagtaacatc aaaaaaagtc ataataccaa catacctaag atccatcagt 4560

gtcagaaata aagatctgaa cacacttgaa aatataacaa ccactgaatt caaaaatgct 4620

atcacaaatg caaaaatcat cccttactca ggattactat tagtcatcac agtgactgac 4680

aacaaaggag cattcaaata cataaagcca caaagtcaat tcatagtaga tcttggagct 4740

tacctagaaa aagaaagtat atattatgtt accacaaatt ggaagcacac agctacacga 4800

tttgcaatca aacccatgga agattaacct ttttcctcta catcagtgtg ttaattcata 4860

caaactttct acctacattc ttcacttcac catcacaatc acaaacactc tgtggttcaa 4920

ccaatcaaac aaaacttatc tgaagtccca gatcatccca agtcattgtt tatcagatct 4980

agtactcaaa taagttaata aaaaatatac acatggacgt ccatggggca aatgcaaaca 5040

tgtccaaaaa caaggaccaa cgcaccgcta agacattaga aaggacctgg gacactctca 5100

atcatttatt attcatatca tcgtgcttat ataagttaaa tcttaaatct gtagcacaaa 5160

tcacattatc cattctggca atgataatct caacttcact tataattgca gccatcatat 5220

tcatagcctc ggcaaaccac aaagtcacac caacaactgc aatcatacaa gatgcaacaa 5280

gccagatcaa gaacacaacc ccaacatacc tcacccagaa tcctcagctt ggaatcagtc 5340

cctctaatcc gtctgaaatt acatcacaaa tcaccaccat actagcttca acaacaccag 5400

gagtcaagtc aaccctgcaa tccacaacag tcaagaccaa aaacacaaca acaactcaaa 5460

cacaacccag caagcccacc acaaaacaac gccaaaacaa accaccaagc aaacccaata 5520

atgattttca ctttgaagtg ttcaactttg taccctgcag catatgcagc aacaatccaa 5580

cctgctgggc tatctgcaaa agaataccaa acaaaaaacc aggaaagaaa accactacca 5640

agcccacaaa aaaaccaacc ctcaagacaa ccaaaaaaga tcccaaacct caaaccacta 5700

aatcaaagga agtacccacc accaagccca cagaagagcc aaccatcaac accaccaaaa 5760

caaacatcat aactacacta ctcacctcca acaccacagg aaatccagaa ctcacaagtc 5820

aaatggaaac cttccactca acttcctccg aaggcaatcc aagcccttct caagtctcta 5880

caacatccga gtacccatca caaccttcat ctccacccaa cacaccacgc cagtagttac 5940

ttaaaaacat attatcacaa aaggccttga ccaaccgcgg agaatcaaaa taaactctgg 6000

ggcaaataac aatggagttg ccaatcctca aagcaaatgc aattaccaca atcctcgctg 6060

cagtcacatt ttgctttgct tctagtcaaa acatcactga agaattttat caatcaacat 6120

gcagtgcagt tagcaaaggc tatcttagtg ctctaagaac tggttggtat actagtgtta 6180

taactataga attaagtaat atcaagaaaa ataagtgtaa tggaacagat gctaaggtaa 6240

aattgatgaa acaagaatta gataaatata aaaatgctgt aacagaattg cagttgctca 6300

tgcaaagcac accagcagca aacaatcgag ccagaagaga actaccaagg tttatgaatt 6360

atacactcaa caataccaaa aaaaccaatg taacattaag caagaaaagg aaaagaagat 6420

ttcttggttt tttgttaggt gttggatctg caatcgccag tggcattgct gtatctaagg 6480

tcctgcactt agaaggagaa gtgaacaaga tcaaaagtgc tctactatcc acaaacaagg 6540

ccgtagtcag cttatcaaat ggagttagtg tcttaaccag cagagtgtta gacctcaaaa 6600

actatataga taaacaattg ttacctattg tgaataagca aagctgcaga atatcaaata 6660

tagaaactgt gatagagttc caacaaaaga acaacagact actagagatt accagggaat 6720

ttagtgttaa tgcaggtgta actacacctg taagcactta catgttaact aatagtgaat 6780

tattgtcatt aatcaatgat atgcctataa caaatgatca gaaaaagtta atgtccaaca 6840

atgttcaaat agttagacag caaagttact ctatcatgtc cataataaaa gaggaagtct 6900

tagcatatgt agtacaatta ccactatatg gtgtgataga tacaccttgt tggaaattac 6960

acacatcccc tctatgtaca accaacacaa aagaagggtc aaacatctgt ttaacaagaa 7020

ctgacagagg atggtactgt gacaatgcag gatcagtatc tttcttccca caagctgaaa 7080

aatgtaaagt tcaatcgaat cgagtatttt gtgacacaat gtacagttta acattaccaa 7140

gtgaagtaaa tctctgcaat gttgacatat tcaatcccaa atatgattgt aaaattatga 7200

cttcaaaaac agatgtaagc agctccgtta tcacatctct aggagccatt gtgtcatgct 7260

atggcaaaac taaatgtaca gcatccaata aaaatcgtgg aatcataaag acattttcta 7320

acgggtgtga ttatgtatca aataaagggg tggacactgt gtctgtaggt aacacattat 7380

attatgtaaa taagcaagaa ggcaaaagtc tctatgtaaa aggtgaacca ataataaatt 7440

tctatgaccc attagtattc ccctctgatg aatttgatgc atcaatatct caagtcaatg 7500

agaagattaa ccagagttta gcatttattc gtaaatccga tgaattatta cataatgtaa 7560

atgctggtaa atcaaccaca aatatcatga taactactat aattatagtg attatagtaa 7620

tattgttatc attaattgct gttggactgc tcctatactg taaggccaga agcacaccag 7680

tcacactaag caaggatcaa ctgagtggta taaataatat tgcatttagt aactgaataa 7740

aaatagcacc taatcatgtt cttacaatgg tttactatct gctcatagac aacccatcta 7800

tcattggatt ttcttaaaat ctgaacttca tcgaaactct tatctataaa ccatctcact 7860

tacactattt aagtagattc ctagtttata gttatataaa acacaattga atgccagtcg 7920

accttaccat ctgtaaaaat gaaaactggg gcaaatatgt cacgaaggaa tccttgcaaa 7980

tttgaaattc gaggtcattg cttaaatggt aagaggtgtc attttagtca taattatttt 8040

gaatggccac cccatgcact gcttgtaaga caaaacttta tgttaaacag aatacttaag 8100

tctatggata aaagtataga taccttatca gaaataagtg gagctgcaga gttggacaga 8160

acagaagagt atgctcttgg tgtagttgga gtgctagaga gttatatagg atcaataaac 8220

aatataacta aacaatcagc atgtgttgcc atgagcaaac tcctcactga actcaatagt 8280

gatgatatca aaaagctgag ggacaatgaa gagctaaatt cacccaagat aagagtgtac 8340

aatactgtca tatcatatat tgaaagcaac aggaaaaaca ataaacaaac tatccatctg 8400

ttaaaaagat tgccagcaga cgtattgaag aaaaccatca aaaacacatt ggatatccat 8460

aagagcataa ccatcaacaa cccaaaagaa tcaactgtta gtgatacaaa tgaccatgcc 8520

aaaaataatg atactacctg acaaatatcc ttgtagtata acttccatac taataacaag 8580

tagatgtaga gttactatgt ataatcaaaa gaacacacta tatttcaatc aaaacaaccc 8640

aaataaccat atgtactcac cgaatcaaac attcaatgaa atccattgga cctctcaaga 8700

attgattgac acaattcaaa attttctaca acatctaggt attattgagg atatatatac 8760

aatatatata ttagtgtcat aacactcaat tctaacactc accacatcgt tacattatta 8820

attcaaacaa ttcaagttgt gggacaaaat ggatcccatt attaatggaa attctgctaa 8880

tgtttatcta accgatagtt atttaaaagg tgttatctct ttctcagagt gtaatgcttt 8940

aggaagttac atattcaatg gtccttatct caaaaatgat tataccaact taattagtag 9000

acaaaatcca ttaatagaac acatgaatct aaagaaacta aatataacac agtccttaat 9060

atctaagtat cataaaggtg aaataaaatt agaagaacct acttattttc agtcattact 9120

tatgacatac aagagtatga cctcgtcaga acagattgct accactaatt tacttaaaaa 9180

gataataaga agagctatag aaataagtga tgtcaaagtc tatgctatat tgaataaact 9240

agggcttaaa gaaaaggaca agattaaatc caacaatgga caagatgaag acaactcagt 9300

tattacgacc ataatcaaag atgatatact ttcagctgtt aaagataatc aatctcatct 9360

taaagcagac aaaaatcact ctacaaaaca aaaagacaca atcaaaacaa cactcttgaa 9420

gaaattgatg tgttcaatgc aacatcctcc atcatggtta atacattggt ttaacttata 9480

cacaaaatta aacaacatat taacacagta tcgatcaaat gaggtaaaaa accatgggtt 9540

tacattgata gataatcaaa ctcttagtgg atttcaattt attttgaacc aatatggttg 9600

tatagtttat cataaggaac tcaaaagaat tactgtgaca acctataatc aattcttgac 9660

atggaaagat attagcctta gtagattaaa tgtttgttta attacatgga ttagtaactg 9720

cttgaacaca ttaaataaaa gcttaggctt aagatgcgga ttcaataatg ttatcttgac 9780

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aataaaagag gtagagggat ttattatgtc tctaatttta aatataacag aagaagatca 9900

attcagaaaa cgattttata atagtatgct caacaacatc acagatgctg ctaataaagc 9960

tcagaaaaat ctgctatcaa gagtatgtca tacattatta gataagacag tgtccgataa 10020

tataataaat ggcagatgga taattctatt aagtaagttc cttaaattaa ttaagcttgc 10080

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attttacttg ttaagcagtc tgagtatgtt aagaggtgcc tttatatata gaattataaa 10260

agggtttgta aataattaca acagatggcc tactttaaga aatgctattg ttttaccctt 10320

aagatggtta acttactata aactaaacac ttatccttct ttgttggaac ttacagaaag 10380

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tagtttccct agaaattaca tgccatcaca catacaaaac tatatagaac atgaaaaatt 10560

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attcaatgaa tgtgatttat acaactgtgt agttaatcaa agttatctca acaaccctaa 10680

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cattagtaag tgctctatca tcacagatct cagcaaattc aatcaagcat ttcgatatga 10980

aacgtcatgt atttgtagtg atgtgctgga tgaactgcat ggtgtacaat ctctattttc 11040

ctggttacat ttaactattc ctcatgtcac aataatatgc acatataggc atgcaccccc 11100

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atatcacatg ggtggcatcg aagggtggtg tcaaaaactg tggaccatag aagctatatc 11220

actattggat ctaatatctc tcaaagggaa attctcaatt actgctttaa ttaatggtga 11280

caatcaatca atagatataa gcaaaccaat cagactcatg gaaggtcaaa ctcatgctca 11340

agcagattat ttgctagcat taaatagcct taaattactg tataaagagt atgcaggcat 11400

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accgtggata aacactatac ttgatgattt caaagtgagt ctagaatcta taggtagttt 11580

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atggttatat aatcagattg ctctacaatt aaaaaatcat gcattatgta acaataaact 11700

atatttggac atattaaagg ttctgaaaca cttaaaaacc ttttttaatc ttgataatat 11760

tgatacagca ttaacattgt atatgaattt acccatgtta tttggtggtg gtgatcccaa 11820

cttgttatat cgaagtttct atagaagaac tcctgacttc ctcacagagg ctatagttca 11880

ctctgtgttc atacttagtt attatacaaa ccatgactta aaagataaac ttcaagatct 11940

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gcaaaatata gaacctacat atcctcatgg gctaagagtt gtttatgaaa gtttaccctt 12240

ttataaagca gagaaaatag taaatcttat atcaggtaca aaatctataa ctaacatact 12300

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atcaatacca gcttatagaa caacaaatta tcactttgac actagcccta ttaatcgcat 12960

attaacagaa aagtatggtg atgaagatat tgacatagta ttccaaaact gtataagctt 13020

tggccttagt ttaatgtcag tagtagaaca atttactaat gtatgtccta acagaattat 13080

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aggtattttt gaaaaagatt ggggagaggg atatataact gatcatatgt ttattaattt 13440

gaaagttttc ttcaatgctt ataagaccta tctcttgtgt tttcataaag gttatggcaa 13500

agcaaagctg gagtgtgata tgaacacttc agatcttcta tgtgtattgg aattaataga 13560

cagtagttat tggaagtcta tgtctaaggt atttttagaa caaaaagtta tcaaatacat 13620

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tcatccaaca catatgaaag caatattaac ttatatagat cttgttagaa tgggattgat 13800

aaatatagat agaatacaca ttaaaaataa acacaaattc aatgatgaat tttatacttc 13860

taatctcttc tacattaatt ataacttctc agataatact catctattaa ctaaacatat 13920

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tattaaatcg tctgcaatga ttagaaccaa ttacagcaaa caagatttgt ataatttatt 14160

ccctatggtt gtgattgata gaattataga tcattcaggc aatacagcca aatccaacca 14220

actttacact actacttccc accaaatatc tttagtgcac aatagcacat cactttactg 14280

catgcttcct tggcatcata ttaatagatt caattttgta tttagttcta caggttgtaa 14340

aattagtata gagtatattt taaaagatct taaaattaaa gatcccaatt gtatagcatt 14400

cataggtgaa ggagcaggga atttattatt gcgtacagta gtggaacttc atcctgacat 14460

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aagaaccaaa aatttcatca tgcctaagaa agctgataaa gagtctattg atgcaaatat 15000

taaaagtttg ataccctttc tttgttaccc tataacaaaa aaaggaatta atactgcatt 15060

gtcaaaacta aagagtgttg ttagtggaga tatactatca tattctatag ctggacgtaa 15120

tgaagttttc agcaataaac ttataaatca taagcatatg aacatcttaa aatggttcaa 15180

tcatgtttta aatttcagat caacagaact aaactataac catttatata tggtagaatc 15240

tacatatcct tacctaagtg aattgttaaa cagcttgaca accaatgaac ttaaaaaact 15300

gattaaaatc acaggtagtc tgttatacaa ctttcataat gaataatgaa taaagatctt 15360

ataataaaaa ttcccatagc tatacactaa cactgtattc aattatagtt attaaaaatt 15420

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tcttggagga ataaatttaa accctaatct aattggttta tatgtgtatt aactaaatta 15540

cgagatatta gtttttgaca ctttttttct cgt 15573

<210> 2

<211> 15573

<212> DNA

<213> 呼吸道合胞病毒

<400> 2