一种特异性识别T-2毒素的适配体亲和柱及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及食品安全生物技术领域，特别涉及一种特异性识别T-2毒素的适配体亲和柱及其制备方法和应用。

背景技术

T-2毒素(T-2toxin)是主要由三线镰刀菌、枝孢镰刀菌和梨孢镰刀菌筝镰刀菌属产生的有毒次级代谢产物，是类单端孢霉烯族真菌毒素中毒性最强的一种。T-2毒素是一种四环的倍半萜烯化合物，化学名4β-15-乙酰氧基-3α-羟基-8α-(3-甲基丁酰氧)-12，13-环氧单端孢霉-9-烯，分子式为C24H34O9，相对分子质量为466.2。T-2毒素广泛分布于自然界，主要污染玉米、燕麦、小麦、大麦、稻米等谷物产品。T-2毒素是非挥发性的，室温放置6～7年或在100～120℃下加热1h，其毒性依然不减。因此，T-2毒素对人畜健康的危害尤其严重，其毒性作用主要包括急性毒性作用、亚急性毒性、慢性毒性、三致作用、免疫毒性以及对血液系统和软组织的损害。

目前，实际样品中的T-2毒素检测与精准分析多需要借助大型仪器，而为了保证结果的准确，也为了保护仪器延长其使用寿命，需要进行样品前处理，且对前处理要求较高。通常情况下，样品前处理需要通过免疫亲和柱等净化步骤进行毒素的分离与提纯，去除样品中的固体杂质与其他干扰离子。免疫亲和柱(Immunoaffinity column，IAC)以抗体为作用主体，特异性结合样品中真菌毒素。因其高特异性、高灵敏度及净化效果好等优势，是目前使用最多、富集效能较强的真菌毒素样品前处理技术。目前，国内外多采用溴化氰活化的琼脂糖凝胶为载体，以随机偶联的方式将抗体分子固定在层析介质上制备亲和柱。然而由于抗体分子属于蛋白质类物质，对使用环境要求敏感。因此在实际检测过程中，若样品成分复杂则会干扰抗体的效能，从而降低免疫亲和柱的富集纯化效能。为了克服传统免疫亲和柱中存在的问题，以适配体为抗体代替物的适配体亲和柱愈益受到关注。

核酸适配体(Aptamer)是从体外合成的随机寡核苷酸文库中通过指数富集配体的系统进化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)技术筛选得到的与靶物质特异性结合的小分子DNA或RNA片段。核酸适配体能够识别与之对应的任何类型的蛋白和低分子等靶物质，并与靶物质具有高度亲和力。与抗体相比较，核酸适配体有诸多优点，比如体外合成周期短、制备成本低、无需动物实验、稳定性好、对温度不敏感和易于修饰等等。

本发明获得的T-2毒素适配体亲和柱可用于富集纯化复杂食品样品中的T-2毒素，有助于提高后续检测方法的准确度和灵敏度。克服了传统免疫亲和柱对使用环境要求敏感的缺点，具有良好的稳定性。对于被T-2毒素污染的普通食品、饲料以及珍贵药材等，可通过适配体亲和柱净化分离实现去污染的目的，使污染品恢复其使用价值。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种特异性识别T-2毒素的适配体亲和柱及其制备方法和应用。本发明制备的适配体亲和柱采用链霉亲和素琼脂糖凝胶作为载体，可负载大量适配体从而具有极高柱容量，具有稳定性好、成本低、保质期长和易于修饰等优点。

本发明的技术方案如下：

一种特异性识别T-2毒素的适配体，所述适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

T-2毒素适配体的核苷酸序列：

5'-biotin-CAGCTCAGAAGCTTGATCCTGTATATCAAGCATCGCGTGTTTACACATGCGAGAGGTGAAGACTCGAAGTCGTGCATCTG-3'。

一种用上述适配体组装的适配体亲和柱，所述适配体亲和柱包含载体和T-2毒素适配体，所述载体为链霉亲和素琼脂糖凝胶，所述T-2毒素适配体通过化学键偶联在载体上。

一种适配体亲和柱的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(1)将链霉亲和素琼脂糖凝胶用结合缓冲液洗涤活化；

(2)取步骤(1)活化的链霉亲和素琼脂糖凝胶1mL，加入适配体溶液，孵育即得偶联产物；

(3)用结合缓冲液洗涤步骤(2)制备的偶联产物，加入2％的牛血清白蛋白溶液反应封闭剩余活性基团，得到链霉亲和素琼脂糖凝胶与适配体的偶联胶体；

(4)将步骤(3)所得的偶联胶体洗涤后，用结合缓冲溶液重悬，装柱，于4℃保存备用。

进一步地，步骤(1)中，所述链霉亲和素琼脂糖凝胶的质量浓度为1mg/mL，所述链霉亲和素琼脂糖凝胶为1mL；所述结合缓冲液洗涤的方法为：每次2mL，重复洗涤3～8次。

进一步地，步骤(1)、(3)、(4)中，所述结合缓冲液为20mM NaH2PO4与150mM NaCl配成的pH 7.4的缓冲液。

进一步地，步骤(2)中，所述适配体溶液的摩尔浓度为2μM，适配体溶液体积为2mL；所述孵育方法为25℃下孵育器孵育10min。

进一步地，步骤(3)中，所述洗涤是使用结合缓冲液反复洗涤3～8次，每次2mL；所述反应的时间为12h。

进一步地，步骤(4)中所述洗涤为分别使用结合缓冲液和甘氨酸-盐酸缓冲液先后交替洗涤3～8次，以除去未偶联的适配体及多余的牛血清白蛋白；所述结合缓冲液与甘氨酸-盐酸缓冲液的体积比为1：1；所述甘氨酸-盐酸缓冲液的摩尔浓度为100mM，pH为3.0。

一种适配体亲和柱的应用，所述适配体亲和柱可用于富集和纯化待测物中的T-2毒素。

进一步地，所述待测物为粮食、坚果、饲料、乳及乳制品、水产、中药、体液、水中一种或多种。

本发明有益的技术效果在于：

(1)本发明选用了以高亲和力和特异性识别、结合靶标，具有稳定性好、成本低、保质期长和易于修饰等独特优势的适配体作为识别元件。

(2)本发明采用链霉亲和素琼脂糖凝胶作为载体，可负载大量适配体，从而具有极高柱容量，最大柱容量为200ng。

(3)本发明富集得到的靶标经洗脱可进一步定量分析。

(4)本发明实际样品检测的加标验证，对巴旦木加标回收率在78.61％～92.54％之间，对花生的加标回收率在77.49％～93.28％。

(5)本发明制备的T-2毒素适配体亲和柱在上样过程中对T-2毒素的结合率以及洗脱过程中的洗脱回收率均接近100％，对其他真菌毒素则基本不被此适配体亲和柱结合，结合率与洗脱率均接近零。

附图说明

图1为本发明所制备的T-2毒素适配体亲和柱结构示意图。

图中：1、进样口堵塞；2、亲和柱柱体；3、上筛板；4、偶联胶载体；5、下筛板；6、出样口堵塞。

图2为本发明实施例1所制备的T-2毒素适配体亲和柱特异性验证。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。

本发明包括但不限于以下实施例，凡在本发明的精神和原则下进行的任何等同替换或者拒不改进，都将视为在本发明的保护范围之内。

生物素修饰适配体的合成由生工生物工程(上海)有限公司完成。

适配体溶液的配制：

(1)向生物素修饰的适配体中加入640μL的结合缓冲液，配制10μM的适配体溶液；

(2)取200μL步骤(1)制备的适配体溶液和800μL的结合缓冲液于另一离心管中，制成2μM的适配体溶液。

实施例1

一种特异性识别的T-2毒素的适配体亲和柱，所述适配体亲和柱的制备包括以下步骤：

(1)链霉亲和素琼脂糖凝胶的活化：取1mL质量浓度为1mg/mL的链霉亲和素琼脂糖凝胶，用2mL的结合缓冲液(20mM NaH

(2)链霉亲和素琼脂糖凝胶和适配体的偶联：取步骤(1)活化的链霉亲和素琼脂糖凝胶1mL，加入2mL浓度为2μM的适配体溶液，并于25℃下置于孵化器中孵育10min即得偶联产物；

(3)封闭：用2mL的结合缓冲液洗涤步骤(2)制备的偶联产物，重复洗涤3次，然后加入2mL2％的牛血清蛋白(BSA)溶液，25℃震荡反应12h，以封闭剩余活性基团，得到链霉亲和素琼脂糖凝胶与适配体的偶联胶体；

(4)洗涤：将步骤(3)所得到的偶联胶体用结合缓冲溶液和甘氨酸-盐酸缓冲液(100mM，pH 3.0)先后交替洗涤3次，每次洗涤所用的结合缓冲液和甘氨酸-盐酸缓冲液的量为2mL，以除去未偶联的适配体及剩余的BSA溶液；洗涤后的偶联胶体用2mL的结合缓冲溶液重悬后于4℃保存，并准备装柱。

(5)偶联胶体填充装柱：取容积为5mL空的固相萃取管，垫好孔径为10μm的下筛板，加入1mL结合缓冲液，使其自然流干；堵塞下方出样口，用步骤(4)洗涤的偶联胶体悬液装柱，静置5min，使偶联胶体在重力作用下自然下落，形成均匀的胶床，至胶床高度为1cm；放置孔径为10μm的上筛板，轻缓按压筛板，使其到达偶联胶体上方，防止后续上样冲坏胶床；拔掉出样口的堵塞，以1mL/min的速度将5mL结合缓冲液缓慢注入亲和柱中；堵塞下方出样口，加入3mL结合缓冲液，并堵塞上方进样口，于4℃冰箱保存备用。

实施例2

一种特异性识别的T-2毒素的适配体亲和柱，所述适配体亲和柱的制备包括以下步骤：

(1)链霉亲和素琼脂糖凝胶的活化：取1mL质量浓度为1mg/mL的链霉亲和素琼脂糖凝胶，用2mL的结合缓冲液(20mM NaH

(2)链霉亲和素琼脂糖凝胶和适配体的偶联：取步骤(1)活化的链霉亲和素琼脂糖凝胶1mL，加入2mL浓度为2μM的适配体溶液，并于25℃下置于孵化器中孵育10min即得偶联产物；

(3)封闭：用2mL的结合缓冲液洗涤步骤(2)制备的偶联产物，重复洗涤8次，然后加入2mL2％的牛血清蛋白(BSA)溶液，25℃震荡反应12h，以封闭剩余活性基团，得到链霉亲和素琼脂糖凝胶与适配体的偶联胶体；

(4)洗涤：将步骤(3)所得到的偶联胶体用结合缓冲溶液和甘氨酸-盐酸缓冲液(100mM，pH 3.0)先后交替洗涤5次，每次洗涤所用的结合缓冲液和甘氨酸-盐酸缓冲液的量为2mL，以除去未偶联的适配体及剩余的BSA溶液；洗涤后的偶联胶体用2mL的结合缓冲溶液重悬后于4℃保存，并准备装柱。

(5)偶联胶体填充装柱：取容积为5mL空的固相萃取管，垫好孔径为10μm的下筛板，加入1mL结合缓冲液，使其自然流干；堵塞下方出样口，用步骤(4)洗涤的偶联胶体悬液装柱，静置5min，使偶联胶体在重力作用下自然下落，形成均匀的胶床，至胶床高度为1cm；放置孔径为10μm的上筛板，轻缓按压筛板，使其到达偶联胶体上方，防止后续上样冲坏胶床；拔掉出样口的堵塞，以1mL/min的速度将5mL结合缓冲液缓慢注入亲和柱中；堵塞下方出样口，加入3mL结合缓冲液，并堵塞上方进样口，于4℃冰箱保存备用。

实施例3

一种特异性识别的T-2毒素的适配体亲和柱，所述适配体亲和柱的制备包括以下步骤：

(1)链霉亲和素琼脂糖凝胶的活化：取1mL质量浓度为1mg/mL的链霉亲和素琼脂糖凝胶，用2mL的结合缓冲液(20mM NaH

(2)链霉亲和素琼脂糖凝胶和适配体的偶联：取步骤(1)活化的链霉亲和素琼脂糖凝胶1mL，加入2mL浓度为2μM的适配体溶液，并于25℃下置于孵化器中孵育10min即得偶联产物；

(3)封闭：用2mL的结合缓冲液洗涤步骤(2)制备的偶联产物，重复洗涤5次，然后加入2mL 2％的牛血清蛋白(BSA)溶液，25℃震荡反应12h，以封闭剩余活性基团，得到链霉亲和素琼脂糖凝胶与适配体的偶联胶体；

(4)洗涤：将步骤(3)所得到的偶联胶体用结合缓冲溶液和甘氨酸-盐酸缓冲液(100mM，pH 3.0)先后交替洗涤5次，每次洗涤所用的结合缓冲液和甘氨酸-盐酸缓冲液的量为2mL，以除去未偶联的适配体及剩余的BSA溶液；洗涤后的偶联胶体用2mL的结合缓冲溶液重悬后于4℃保存，并准备装柱。

(5)偶联胶体填充装柱：取容积为5mL空的固相萃取管，垫好孔径为10μm的下筛板，加入1mL结合缓冲液，使其自然流干；堵塞下方出样口，用步骤(4)洗涤的偶联胶体悬液装柱，静置5min，使偶联胶体在重力作用下自然下落，形成均匀的胶床，至胶床高度为1cm；放置孔径为10μm的上筛板，轻缓按压筛板，使其到达偶联胶体上方，防止后续上样冲坏胶床；拔掉出样口的堵塞，以1mL/min的速度将5mL结合缓冲液缓慢注入亲和柱中；堵塞下方出样口，加入3mL结合缓冲液，并堵塞上方进样口，于4℃冰箱保存备用。

测试例：

利用本申请实施例1制备的T-2毒素适配体亲和柱纯化和检测坚果样品(巴旦木)中的T-2毒素。通过向正常购买的巴旦木样品中定量加入不同浓度的T-2毒素标准品，然后用本申请实施例1制备的T-2毒素适配体亲和柱进行净化后，用超高效液相色谱-荧光检测器检测，测定加标回收率，并验证亲和柱效能。

具体步骤如下：

(1)样品处理

将巴旦木样品粉碎，然后分别按照每kg巴旦木样品0.5μg、5μg、50μg的标准向巴旦木样品中分别加入T-2毒素标准品，得到不同加标量的巴旦木样品。

(2)称取5g加标后的巴旦木试样(精确到0.01g)置于50mL塑料离心管中，加入25mLPBS溶液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na

(3)将本申请实施例1制备的T-2毒素适配体亲和柱与10mL玻璃注射器连接，准确移取50mL提取液B，以每秒1～2滴的流速全部通过亲和柱，直至空气流经亲和柱；然后将20mL PBS溶液以每秒1～2滴的流速通过亲和柱，直至空气流经亲和柱；之后准确移取5mL提取液A以每秒1～2滴的速度全部通过亲和柱，直至空气流经亲和柱；再将20mL超纯水以每秒1～2滴的流速淋洗柱子，直至空气流经亲和柱，弃去全部流出液。将1.5mL甲醇以每秒1滴的流速洗脱亲和柱，将洗脱液收集于玻璃试管中，当甲醇大部分过柱后，不要完全过柱，停止加压，静置5min，再将1.5mL甲醇以每秒1滴的流速洗脱亲和柱，将全部洗脱液收集于同一玻璃试管中。

(4)将上述收集于玻璃试管中的洗脱液用50℃下氮气吹干，加入0.5mL水-乙腈(体积比1:1)，在涡旋振荡器涡旋混合2min，过0.22μm有机滤膜，收集滤液于进样瓶中以备进样。

(5)步骤(4)收集的滤液用超高效液相色谱-荧光检测器检测，检测结果如下表1所示：

表1

由表1可知，当巴旦木样品经T-2毒素适配体亲和柱后，用超高效液相色谱可以检测到。从检测结果可以看出，本申请实施例1所制备的T-2毒素适配体亲和柱对巴旦木中T-2毒素的加标回收率在78.61％～92.54％之间，RSD为1.2％～2.3％之间。

利用本申请实施例3制备的T-2毒素适配体亲和柱纯化和检测花生中的T-2毒素。通过向购买的花生样品中定量加入T-2毒素标准品，然后用本申请实施例3制备的适配体亲和柱进行净化，最后用超高效液相色谱-荧光检测器检测，测定加标回收率以验证亲和柱效能。

具体步骤如下：

(1)样品处理

粉碎花生样品，分别按照每千克样品0.5μg、5μg、50μg的标准向花生样品中加入T-2毒素标准品。

后续操作同对巴旦木的加标回收率测试中的步骤(2)、(3)、(4)、(5)。

检测结果如下表2所示。

表2

可见，花生样品经T-2毒素适配体亲和柱后，用超高效液相色谱可以检测到。从检测结果可以看出，本申请实施例3所制备的T-2毒素适配体亲和柱回收率在77.49％～93.28％之间，RSD为1.4％～2.4％之间。

本发明制备的T-2毒素适配体亲和柱的特异性测试：

为了验证本申请制备的T-2毒素适配体亲和柱只针对T-2毒素进行截留富集，而不对其他真菌毒素进行截留，以1mL/min的速度分别将0.1μg/mL的DON、ZEN、OTA、AFB

虽然，上文中已经用具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种特异性识别T-2毒素的适配体亲和柱及其制备方法和应用

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cagctcagaa gcttgatcct gtatatcaag catcgcgtgt ttacacatgc gagaggtgaa 60

gactcgaagt cgtgcatctg 80