一种拭子样本保存液

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域。更具体地，涉及一种拭子样本保存液。

背景技术

拭子采样是病原检测采样的常用手段，如新型冠状病毒肺炎疫情下感染者的检测与筛查工作，需要采集大量的拭子样本进行检测。拭子样本的保存和运输就需要用到拭子样本保存液，即病毒保存液，适用于新型冠状病毒、流感病毒、手足口病毒等常见病毒样本的采集保存运输工作，是采样管内浸没采样拭子病毒样本的一种保护病毒的被检测物质的液体，可保存采集的咽拭子、鼻拭子或特定部位组织样本，储存的样本可用于后续的核酸提取、酶切、PCR等分子生物学实验。

中国专利CN 111925941A公开了一种病毒保存液及其应用，在该病毒保存液中，病毒核酸虽最长能保存21天，但该保存液不具备病毒灭活功能，不能有效防止操作员的二次感染。中国专利CN 111718908A公开了一种病毒样本保存液及其制备方法和应用，该病毒样本保存液10min可灭活病毒，在37℃条件下病毒核酸保存时间为7～14天，在2～8℃条件的保存时间为1～2月，在-20℃条件下即可实现长期保存，但该保存液未曾用于COVID-19的保存，其对于新冠病毒的灭活和保存效果未知。

鉴于当前新冠防疫背景，提供一种能快速灭活病毒且保存效果好的拭子样本保存液具有重要意义。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是为进一步优化上述现有保存液产品的不足，提供一种能快速灭活病毒并能长期保持病毒DNA和RNA完整的保存液。样本采集后，将样本与保存液混合10min即可灭活病毒，病毒核酸可在37℃保存16天不被降解，进行核酸提取后即可进行分子生物学实验，操作简便，使用安全，保存效果好。

本发明的目的是提供一种拭子样本保存液。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

通常，病毒样本保存液中需要含有蛋白裂解液和酶抑制液，使病毒灭活的同时保护核酸不被降解。本发明经多番实验后发现，在保存液中添加异山梨醇二甲醚、蔗糖脂肪酸酯和聚醚NPE-108可快速有效的灭活病毒，并且能保护病毒核酸16天不被降解，安全有效，保存效果好。

优选地，所述保存液中异山梨醇二甲醚的浓度为0.1％～10％(v/v)。

优选地，所述保存液中蔗糖脂肪酸酯的浓度为1％～15％(w/w)。

优选地，所述保存液中聚醚NPE-108的浓度为1％～10％(w/w)。

优选地，所述保存液的pH值为6～9。

进一步优选地，所述保存液的pH值为6.5～7.5。

优选地，所述保存液中还含有盐酸胍、NP40、Proclin300和NaCl。

优选地，所述保存液的溶剂为ddH

优选地，所述保存液中异山梨醇二甲醚浓度为0.1％～10％(v/v)，蔗糖脂肪酸酯浓度为1％～15％(w/w)，聚醚NPE-108浓度为1％～10％(w/w)，盐酸胍浓度为20％～60％(w/w)，NP40浓度为0.1％～10％(v/v)，Proclin300浓度为0.1％～3％(v/v)，NaCl浓度为2％～24％(w/w)

进一步优选地，所述保存液中异山梨醇二甲醚浓度为0.1％～2％(v/v)，蔗糖脂肪酸酯浓度为2％～6％(w/w)，聚醚NPE-108浓度为2％～4％(w/w)，盐酸胍浓度为30％～48％(w/w)，NP40浓度为1％～2％(v/v)，Proclin300浓度为0.3％～1％(v/v)，NaCl浓度为5％～12％(w/w)。

更进一步优选地，所述保存液中异山梨醇二甲醚浓度为1％(v/v)，蔗糖脂肪酸酯浓度为4％(w/w)，聚醚NPE-108浓度为3％(w/w)，盐酸胍浓度为40％(w/w)，NP40浓度为1.5％(v/v)，Proclin300浓度为0.8％(v/v)，NaCl浓度为8％(w/w)。

本发明具有以下有益效果：

本保存液是灭活型，添加有适宜浓度的裂解盐和表面活性剂，能够迅速高效地使待测样本里的病毒蛋白裂解失活，10min即可对保存的病毒样本快速灭活，可以有效防止操作员二次感染。

同时本保存液又含有酶变性剂，能保护核酸不被降解；因此可裂解蛋白失活病毒而保护核酸不被降解，可用于后续核酸的提取和检测，安全有效，保存效果好。

本保存液配伍合理稳定，即能够快速灭活病毒，又能在37℃保存病毒核酸16天，2～8℃保存60天，同时保护核酸不被降解，不影响后续核酸的提取和检测，安全有效，保存效果好。

附图说明

图1为新冠假病毒用保存液稀释至10

图2为新冠假病毒用保存液稀释至10

图3为新冠假病毒用保存液稀释至10

图4为新冠假病毒用保存液稀释至10

图5为新冠假病毒用保存液稀释至100copies/mL后在37℃保存0天后提取病毒核酸的检测结果。

图6为新冠假病毒用保存液稀释至100copies/mL后在37℃保存8天后提取病毒核酸的检测结果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

以下实施例中，保存液的各组分，盐酸胍、聚醚NPE-108、NaCl、蔗糖脂肪酸酯为固体，浓度单位w/w；Proclin300、NP40、异山梨醇二甲醚为液体，浓度单位v/v。

实施例1保存液的配制

1、本发明经过了大量的探索和尝试，得到病毒灭活效果好、核酸保存时间长的保存液配方，固将该配方作为正式配方使用。

保存液1配方如表1(正式配方)，各组分溶于ddH

表1保存液1(正式配方，1000mL)

注：浓度计算方式固体为w/w，液体为v/v。

此外，以下展示了部分失败配方作为对比。

保存液2配方(如表2，失败配方)：此配方与正式配方的区别在于将聚醚NPE-108、蔗糖脂肪酸酯、异山梨醇二甲醚替换成曲拉通、SDS和山梨醇，配制方法均相同。

表2保存液2配方(失败配方)

注：浓度计算方式固体为w/w，液体为v/v。

保存液3配方(如表3，失败配方)：此配方与正式配方的区别在于将聚醚NPE-108、蔗糖脂肪酸酯替换成甘露醇和聚六亚甲基双胍盐酸盐，配制方法均相同。

表3保存液3配方(失败配方)

注：浓度计算方式固体为w/w，液体为v/v。

保存液4配方(如表4，失败配方)：此配方与正式配方的区别在于将蔗糖脂肪酸酯、异山梨醇二甲醚替换成山梨醇和尿素，配制方法均相同。

表4保存液4配方(失败配方)

注：浓度计算方式固体为w/w，液体为v/v。

实施例2保存液对新冠假病毒保存时长和保存效果的考察

1、以实施例1中的四个保存液配方作为实验材料验证其对病毒的保存时长。

(1)37℃保存时间考察

检测样本：将新冠假病毒分别用上述保存液稀释至10

检测结果如表5所示，本发明保存液1在37℃下保存16天的样本仍可用新冠试剂盒检出，而其余保存液保存16天的样本未能用凯普新型冠状病2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)检出，表明这些配方达不到长期稳定保存的效果。

表5

注：+代表检出，-代表未检出。

(2)4℃保存时间考察

检测样本：将新冠假病毒分别用上述保存液稀释至10

检测结果如表6所示，本发明保存液1在4℃条件下保存60天的样本仍可用新冠试剂盒检出，而其余保存液保存60天后的样本未能用新冠检测试剂盒检出，表明这些配方达不到长期稳定保存的效果。

表6

注：+代表检出，-代表未检出。

2、以保存液1作为实验材料验证其对病毒的保存效果

将新冠假病毒用保存液1分别稀释至10

检测结果如表7和图1～6(新冠N基因检测所用试剂盒为凯普新型冠状病2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法))；新冠ORF1ab基因检测所用试剂盒为凯普新型冠状病2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法))所示，本发明保存液1在37℃条件下保存0天和8天后的样本可用新冠检测试剂盒检出，用ORF1ab基因检测时的检测限为10

表7

综上结果表明，在样本保存方面，本发明样本保存液显著优于对比配方，37℃条件下下保存时间可达16天；利用新冠N基因检测时，检测限可以达到100copies/mL。

实施例3拭子样本的收集保存与检测

1、鼻咽拭子采集

1)患者头部后仰(约70度)，保持不动。

2)用拭子棒估测耳根到鼻孔距离。

3)自鼻孔垂直面部方向插入，深入距离最少应达耳垂部位到鼻尖长度的一半。遇到阻力后即到达后鼻咽，应停留数秒吸取分泌物(一般要求15～30s)，应旋转拭子3～5次，宜轻轻旋转取出拭子，拭子头浸入装有保存液液的收集管中。

4)顶端处折断无菌拭子杆，尾部弃去，旋紧管盖并用封口膜封闭。

2、口腔咽拭子采集

1)嘱患者先用生理盐水或清水漱口。

2)将拭子放入无菌生理盐水中湿润。

3)瞩患者坐下，头后倾，张大嘴，并发“啊”音。

4)用压舌板固定舌头，拭子越过舌根到咽后壁及扁桃体隐窝、侧壁等处。

5)应先用拭子适度用力来回擦拭双侧咽扁桃体至少3次，然后再咽后壁至少3次，3～5次为宜。

6)取出拭子，避免触及舌头、悬垂体、口腔粘膜和唾液。

7)将拭子头浸入含样本保存液中。

8)靠近顶端处折断无菌拭子杆，尾部弃去，旋紧管盖并用封口膜封闭。

3、拭子样本的保存与检测

(1)参考实施例2的方法，将样本由新冠假病毒换为上述采集的拭子样本。

测试结果如表8所示。

表8

注：+代表检出，-代表未检出。

结果表明，37℃条件下对拭子样本的保存时间依然可达16天。

(2)采集的新冠阳性鼻咽拭子样本用本发明保存液分别在37℃条件下保存16天，然后用凯普自研的核酸提取或纯化试剂磁珠法核酸提取试剂盒(磁珠法NO-R-AⅠ型)提取核酸，提取的核酸用于新冠病毒的检测；表9为凯普新型冠状病2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)内标的Ct值；

表9

结果表明，保存液1在37℃条件下对新冠病毒的保存效果良好，在第0天和第16天的效果无显著差异，适合鼻咽拭子样本的保存。

实施例4保存液配比的优化

我们对本发明拭子样本保存液的各组分配比进行了大量的考察实验，方法参考实施例2。结果显示，本发明保存液的配方浓度如表10所示：

表10

注：所用溶剂为ddH

注：浓度计算方式固体为w/w，液体为v/v。

以下展示部分配方的检测结果(如表11和表12)

表11

注：浓度计算方式固体为w/w，液体为v/v。

参考实施例2的方法，将新冠假病毒分别用组1～5的保存液保存一定时间后，提取核酸进行检测，如表12所示。

表12

注：+代表检出。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。