富含血小板血浆的制备方法

技术领域

本发明涉及医药领域，尤其涉及一种本发明涉及医药领域，尤其是涉及一种富含血小板血浆的制备方法。

背景技术

富血小板血浆(PRP)是全血经过离心分离得到的血小板浓缩物，其制备原理是利用血液中各种成分沉降速度不同，通过离心将血液分层。全血经低速离心可分为三层，上层是贫血小板血浆层(PPP)、中间为富血小板血浆层(PRP)、下层为红细胞层，取中间层可得到高度浓缩的含血小板血浆。

现有的PRP制备方法分为一次离心法和二次离心法。其中，一次离心法，是指对血液样品采用一次分离后，去除下层红细胞，获得上层液，即得富含血小板血浆；二次离心法，是指对血液样品采用一次分离后，获得上层液，再对上层液进行二次离心，去除上层液，保留下层液，即得到富含血小板血浆。前一种方法，操作简单、效率高，但获得的富含血小板血浆的浓缩能力小，不适合临床应用；后一种方法，虽然获得的富含血小板血浆的浓缩能力提升了，但浓缩倍数还是小，且血小板易于破坏及存在黏连结块现象，难以垂悬均匀。

总之，上述两种富血小板血浆制备方法，其PRP收率不高，一般在55％左右，即浓缩倍数小。因此，现有的PRP制备方法仍有待改进。

发明内容

有鉴于此，针对上面常用的分离方法存在的结块和收率低的问题，本发明目的在于提供一种高浓缩倍数、且血小板自体形态表现良好的富含血小板血浆的制备方法。

本发明的目的是采用如下技术方案实现：

一种富含血小板血浆的制备方法，包括如下步骤：

室温下，用肝素钠采血管采集的血液样品；

将采集管放入离心机中进行低速离心处理，并收集上层液置于离心管中；

对收集后的上层液降温处理，随后升至室温；

往降温处理后的上层液中加入浓缩分离液进行浓缩分离，得到混合液；

将浓缩分离处理后的所述混合液置于离心机中，经高速离心处理后，去除高速离心后离心管中的上层液，保留下层液,即得到富含血小板血浆。

一实施例中，所述低速离心处理时，离心力为80g～150g且离心时间为10～15分钟。

一实施例中，所述降温处理时，温度由室温下降到2～8℃且维持降温处理时间为25～35分钟。

一实施例中，所述浓缩分离液包括乙二胺四乙酸钠、枸橼酸、枸橼酸钠、磷酸二氢钠、葡萄糖、腺嘌呤和人血白蛋白。

一实施例中，按照每1000ml浓缩分离液总体积计算，该浓缩分离液中:乙二胺四乙酸钠1.82～2.52g、枸橼酸3.0～3.5g、枸橼酸钠25.93～27.1g、磷酸二氢钠1.80～2.42g、葡萄糖30.1～32.9g、腺嘌呤0.20～0.32g、人血白蛋白45～55ml、余量为无菌去离子水。

较好地，乙二胺四乙酸钠2.22g、枸橼酸3.27g、枸橼酸钠26.3g、磷酸二氢钠2.22g、葡萄糖31.9g、腺嘌呤0.275g、人血白蛋白50ml、余量为无菌去离子水。

一实施例中，所述高速离心处理时，离心力为800g～1500g、离心时间为5～10分钟。

本发明提供的富含血小板血浆的制备方法中，具有如下有点：

1、对血液低速离心后收集到的上层液体进行了降温处理，为的是在不破坏血小板的前提下，让更多的血小板沉积下来，便于分离，避免黏连结块；

2、往降温处理后的上层液中加入浓缩分离液，为的是防止上层液中的血小板破裂，有效提升血小板的单位体积数量。

总之，在低速离心和高速离心处理过程中，增加降温和浓缩分离处理，使制得的富含血小板血浆的浓缩能力可以达到5倍以上，且血小板之间不存在黏连结块的现象，这种方法制得的富含血小板血浆适用于临床应用。

附图说明

图1为本发明提供的富含血小板血浆的制备工艺流程图；

图2a、2b分别为实施例1中富含血小板血浆与全血中血小板的计数结果图；

图2c、2d分别为实施例2中富含血小板血浆与全血中血小板的计数结果图；

图2e、2f分别为实施例3中富含血小板血浆与全血中血小板的计数结果图；

图2g、2h分别为对比例1中富含血小板血浆与全血中血小板的计数结果图；

图3a、3b、3c、3d分别为实施例1至3、及对比例1的富含血小板血浆中血小板的倍数图片；

图4a、4b分别为实施例和对比例1制得的富含血小板血浆形态图；

其中：

1)、血小板数量计数，采用深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司生产的全自动血液细胞分析仪，型号为BC-20S；

2)、富含血小板血浆倍数图拍摄，采用舜宇光学科技(集团)有限公司生产的倒置生物显微镜，型号为ICX41，拍摄放大倍数为800倍；

3)、富含血小板血浆形态图拍摄，采用广州明美光电技术有限公司生产的倒置生物显微镜，型号为MI52-CF，拍摄放大倍数为400倍。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的较佳实施例作进一步详细说明。

如图1所示，本发明提供的一种富含血小板血浆的制备方法，其工艺流程如下步骤：

S1、室温下，用肝素钠采血管采集的血液样品。

该步骤中，所述肝素钠为抗凝剂，起到防止新鲜血液凝固结块的作用；采血管的规格为10ml标准通用一次性采血管；在其他实施例中,对于血液样品的采集后的收集也可以离心管,其抗凝剂也可以是其他抗凝剂,如,乙二胺四乙酸及其盐、枸橼酸及其盐、枸橼酸葡萄糖溶液等中的任一种。

S2、将采血管放入离心机中进行低速离心处理，并收集上层液置于离心管中。

该步骤中，所述低速离心处理时，离心力为80g～150g且离心时间为10～15分钟，使血液里的组分分层。血液离心处理后，采集管的上层液体为血浆层、单个核细胞和血小板、密度梯度液等；采集管的下层液体为红细胞层、粒细胞、密度梯度液等。较好地，低速离心处理时，离心力为100g、离心时间为12分钟。

低速离心处理结束后，用巴氏吸管吸取上层不含红细胞的液体置于普通的一次性离心管中。

S3、对收集后的上层液进行降温处理后升至室温。

本步骤中，将收集到上层液的离心管置于温度为2～8℃的冷冻箱中维持降温处理25～35分钟，也即是相对于室温(25℃)下降到2～8℃，然后从冷冻箱中取出离心管，置于室温环境下的离心管架上静置30分钟左右，使离心管中的上层液温度达到室温温度。较好地，离心管中的上层液体降温处理时的温度为20℃、处理时间为30分钟。

本步骤中，对上层液进行降温处理的目的是在不破坏血小板的前提下，让更多的血小板沉积下来，便于分离，避免黏连结块。

S4、往降温处理后的上层液中加入浓缩分离液进行浓缩分离，得到混合液。

本步骤中，浓缩分离液选用乙二胺四乙酸钠、枸橼酸、枸橼酸钠、磷酸二氢钠、葡萄糖、腺嘌呤和人血白蛋白的混合液；其中，按照每1000ml所述浓缩分离液总体积计算，浓缩分离液中:按照每1000ml浓缩分离液总体积计算，该浓缩分离液中:乙二胺四乙酸钠1.82～2.52g、枸橼酸3.0～3.5g、枸橼酸钠25.93～27.1g、磷酸二氢钠1.80～2.42g、葡萄糖30.1～32.9g、腺嘌呤0.20～0.32g、人血白蛋白45～55ml、余量为无菌去离子水。

较好地，在一实施例中，按照每1000ml所述浓缩分离液总体积计算，浓缩分离液中:乙二胺四乙酸钠2.22g、枸橼酸3.27g、枸橼酸钠26.3g、磷酸二氢钠2.22g、葡萄糖31.9g、腺嘌呤0.275g、人血白蛋白50ml、余量为无菌去离子水。

加入浓缩分离液进行浓缩分离为的是防止液体中的血小板破裂，有效提升血小板的单位体积数量。

S5、将浓缩分离处理后得到的的所述混合液置于离心机中，经高速离心处理后，再次收集高速离心后离心管中的上层液，即得到富含血小板血浆。

本步骤中，对离心管进行高速离心处理时，离心力为800g～1500g、离心时间为5～10分钟。较好地，离心力为1200g、离心时间为8分钟。

浓缩分离处理后的液体，经高速离心处理后，在离心管中将出现组分分层，收集离心管的上层液，即富含血小板的血浆，去除下层液，主要是红细胞、粒细胞、密度梯度液等。此时，制得的富含血小板血浆的浓缩能力可以达到5倍以上，且血小板之间分散均匀、不存在黏连结块的现象；其中，富含血小板血浆的浓缩能力，即血小板浓缩倍数＝浓缩后的血小板浓度/全血的血小板浓度*100％。

下面两个实施例；其中，实施例1采用本发明工艺制备富含血小板血浆；对比例1则采用其他工艺制备富含血小板血浆。

实施例1

首先，室温下，10ml规格的肝素钠采血管采集的新鲜血液样品5ml；

其次，将采血管放入离心机中、以100g的离心力进行低速离心处理12分钟；拿出离心管置于离心管架上静置10分钟，然后用巴氏吸管收集采血管的上层液体置于另一支10ml规格的离心管中；

随后，将收集上层液的离心管置于温度为6℃的冷冻箱中进行降温处理30分钟，随后拿出离心管置于离心管架上于室温下静置60分钟，确保离心管中的液体温度与室温相一致；

接着，往降温处理后的液体中加入浓缩分离液5ml，实施浓缩分离处理，得到混合液；其中，按照每1000ml浓缩分离液总体积计算，该浓缩分离液中:乙二胺四乙酸钠2.22g、枸橼酸3.27g、枸橼酸钠26.3g、磷酸二氢钠2.22g、葡萄糖31.9g、腺嘌呤0.275g、人血白蛋白50ml、余量为无菌去离子水；

最后，将浓缩分离处理后的混合液置于离心机中，经1000g离心力的高速离心处理8分钟后；将离心管置于离心管架上静置10分钟；采用巴氏吸管吸除离心管中的上层液，保留下层液，即得到富含血小板血浆。

如图2a所示，富含血小板血浆中，血小板数量为1755*10

如图3a和4a所示，富含血小板血浆中，血小板之间分散均匀、不存在黏连结块的现象。

实施例2

首先，室温下，10ml规格的肝素钠采血管采集的新鲜血液样品5ml；

其次，将采血管放入离心机中、以150g的离心力进行低速离心处理15分钟；拿出离心管置于离心管架上静置10分钟，然后用巴氏吸管收集采血管的上层液体置于另一支10ml规格的离心管中；

随后，将收集上层液的离心管置于温度为2℃的冷冻箱中进行降温处理25分钟，随后拿出离心管置于离心管架上于室温下静置60分钟，确保离心管中的液体温度与室温相一致；

接着，往降温处理后的液体中加入浓缩分离液5ml，实施浓缩分离处理，得到混合液；其中，按照每1000ml浓缩分离液总体积计算，该浓缩分离液中:乙二胺四乙酸钠2.52g、枸橼酸3.5g、枸橼酸钠27.1g、磷酸二氢钠2.42g、葡萄糖32.9g、腺嘌呤0.32g、人血白蛋白55ml、余量为无菌去离子水；

最后，将浓缩分离处理后的混合液置于离心机中，经1500g离心力的高速离心处理10分钟后；将离心管置于离心管架上静置10分钟；采用巴氏吸管吸除离心管中的上层液，保留下层液，即得到富含血小板血浆。

如图2c所示，富含血小板血浆中，血小板数量为1548*10

如图3b所示，富含血小板血浆中，血小板之间分散均匀、不存在黏连结块的现象。

实施例3

首先，室温下，10ml规格的肝素钠采血管采集的新鲜血液样品5ml；

其次，将采血管放入离心机中、以80g的离心力进行低速离心处理10分钟；拿出离心管置于离心管架上静置10分钟，然后用巴氏吸管收集采血管的上层液体置于另一支10ml规格的离心管中；

随后，将收集上层液的离心管置于温度为8℃的冷冻箱中进行降温处理35分钟，随后拿出离心管置于离心管架上于室温下静置60分钟，确保离心管中的液体温度与室温相一致；

接着，往降温处理后的液体中加入浓缩分离液5ml，实施浓缩分离处理，得到混合液；其中，按照每1000ml浓缩分离液总体积计算，该浓缩分离液中:乙二胺四乙酸钠1.82g、枸橼酸3.0g、枸橼酸钠29.93g、磷酸二氢钠1.80g、葡萄糖30.1g、腺嘌呤0.20g、人血白蛋白45ml、余量为无菌去离子水；

最后，将浓缩分离处理后的混合液置于离心机中，经800g离心力的高速离心处理5分钟后；将离心管置于离心管架上静置10分钟；采用巴氏吸管吸除离心管中的上层液，保留下层液，即得到富含血小板血浆。

如图2e所示，富含血小板血浆中，血小板数量为1283*10

如图3c所示，富含血小板血浆中，血小板之间分散均匀、不存在黏连结块的现象。

对比例1

首先，室温下，10ml规格的肝素钠采血管采集的新鲜血液样品5ml；

其次，将采血管放入离心机中、以100g的离心力进行低速离心处理12分钟；拿出离心管置于离心管架上静置10分钟，然后用巴氏吸管收集采血管的上层液体置于另一支10ml规格的离心管中；

最后，将离心管置于离心机中，经1000g离心力的高速离心处理8分钟后；将离心管置于离心管架上静置10分钟；采用巴氏吸管吸除离心管中的上层液，保留下层液，即得到富含血小板血浆。

如图2g所示，富含血小板血浆中，血小板数量为779*10

如图3d和4b所示，富含血小板血浆中，血小板之间分散均匀较差且存在黏连结块的现象。

上述实施例1、2、3及对比例1中的测试数据及性能表述，详见表1。

表1

由表1可知，采用本发明工艺制得的富含血小板血浆，其浓缩能力均超过5倍以上，而对比例1中，富含血小板血浆，其浓缩能力仅为3.26，远低于实施例1至3任一富含血小板血浆的浓缩能力；说明往血液样品低速离心获得上层液经降温处理和浓缩分离处理，防止了上层液中血小板的破裂，有效提升血小板的单位体积数量。

图3a、3b、3c分别是实施例1至3对应的富含血小板血浆中血小板的倍数图片；图3d是对比例1对应的富含血小板血浆中血小板的倍数图片。由图3a、3b、3c和3d可知，实施例1制得的富含血小板血浆中，血小板富集倍数较高，表示其浓缩能力相对较强；对比例1制得的富含血小板血浆中，血小板富集倍数较低，表示其浓缩能力低。这与表1中各实施例及对比例中所测试计数获得的血小板基本保持一致，即富含血小板血浆的浓缩能力强，其血小板的富集倍数也就大。

图4a和4b分别表示实施例1和对比例1制得富含血小板血浆形态图，从图片可知，本发明实施例1制得的富含血小板血浆中，血小板分散均匀、呈悬垂分散状，而对比例1制得的富含血小板血浆中，血小板出现黏连结块现象，且血小板分均匀性较差。

通过对上述实施例和对比例的测试结果可知，实施例1、2、3制备富含血小板血浆工艺时，相对于对比例1而已，其在两次离心过程中增加了工艺步骤“对收集后的上层液降温处理，随后升至室温”和“往降温处理后的上层液中加入浓缩分离液进行浓缩分离,得到混合液”；其得到的技术效果如下：

1、对血液低速离心后收集到的上层液体进行了降温处理，为的是在不破坏血小板的前提下，让更多的血小板沉积下来，便于分离，避免黏连结块；

2、往降温处理后的上层液中加入浓缩分离液，为的是防止上层液中的血小板破裂，有效提升血小板的单位体积数量。

上述技术效果，是对比例2制备工艺无法获得的。因此，本发明工艺方法制得的富含血小板血浆，其浓缩能力超过5倍以上，血浆中血小板分散均匀且不黏连结块；而对比例1制得的富含血小板血浆中，其浓缩能力不超过3倍，血浆中血小板分散均匀差且出现黏连结块现象。根据临床应用的基本要求，血小板浓缩能力一般在5倍以上；因此，采用本发明制得的富含血小板血浆，可以广泛用于临床应用中。

应当理解的是，上述针对本发明较佳实施例的表述较为详细，并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制，本发明的专利保护范围应以所附权利要求为准。