一种人胚胎干细胞体外扩增用添加剂及扩增方法

技术领域

本发明涉及一种生物制药技术领域，尤其涉及一种人胚胎干细胞体外扩增用添加剂及扩增方法。

背景技术

人胚胎干细胞(Human embryonic stem cells，hESCs)是来源于体外受精的囊胚内细胞团的多能性细胞。hESCs具有向外胚层、内胚层和中胚层分化的能力，如心肌细胞、神经元、胶质细胞、肝细胞、胰岛细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、脂肪细胞和内皮细胞等。因此胚胎干细胞可以提供一种理想的生物学平台，用于科学研究与临床应用，如药物筛选、细胞发育与分化的分子调节机制研究、组织工程种子细胞及基因治疗载体的建立、细胞治疗及再生医学等。

随着研究日益深入，人们对hESCs的了解迈入了一个新的阶段。胚胎干细胞最诱人的前景和用途是生产组织和细胞，用于“细胞疗法”，为细胞移植提供无免疫原性的材料。然而，在人胚胎干细胞的培养领域，一直存在成本高，体外培养不稳定，易受杂菌污染等，无法保证胚胎干细胞的质量和数量等问题，为胚胎干细胞的临床应用造成障碍。

传统的hESCs培养方法需要将hESCs置于丝裂霉素处理的饲养层细胞上(如胚胎成纤维细胞，MEFs)，这种方法虽然可以维持hESCs的生长和增殖，但是面临着饲养层细胞制备过程繁琐、不易分离饲养层细胞等问题。此外，饲养层细胞的质量也会对hESCs的生长造成影响，导致hESCs质量不一，批次性差异大，而且饲养层细胞也可能是动物病原体和支原体污染的来源。为了进一步提高hESCs体外培养时的质量，需要在不影响hESCs质量和数量的前提下开发完全无异源的培养体系。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种人胚胎干细胞体外扩增用添加剂，该添加剂成分明确，使用安全，有效提高胚胎干细胞的增殖效率。

本发明的目的之二在于提供一种人胚胎干细胞体外扩增方法。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种人胚胎干细胞体外扩增用添加剂，用于添加于胚胎干细胞体外扩增用基础培养基中，所述添加剂包括以下组分：芸苔素内酯、巯基丁二酸纳、豆甾醇、龙胆苦苷、卡那霉素、L-谷氨酰胺。

进一步地，以培养基终浓度计，所述添加剂中各组分的浓度为：芸苔素内酯1.5-4.5ng/mL、巯基丁二酸纳2.8-5.0ng/mL、豆甾醇13.3-17.5ng/ mL、龙胆苦苷10.0-14.5ng/mL、卡那霉素5-10ng/mL、L-谷氨酰胺15-20ng/mL。

进一步地，以培养基终浓度计，所述添加剂中各组分的浓度为：芸苔素内酯2.0ng/mL、巯基丁二酸纳3.5ng/mL、豆甾醇15.8 ng/mL、龙胆苦苷13.0 ng/mL、卡那霉素8ng/mL、L-谷氨酰胺16ng/mL。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

一种人胚胎干细胞体外扩增方法，包括以下步骤：

（1）将体外分离的人胚胎干细胞接种于基础培养基中，在包被纤维粘连蛋白的培养皿中预培养24h；

（2）取基础培养基加入权利要求1至3任一项所述的添加剂得到扩增用培养基，在所述扩增用培养基中接种步骤（1）的胚胎干细胞，在37℃，5%CO

进一步地，步骤（2）中每隔1天更换一次扩增用培养基。

进一步地，所述基础培养基为高糖DMEM培养基。

进一步地，步骤（2）中细胞的接种密度为5-8×10

相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供了一种人胚胎干细胞体外扩增用添加剂，添加剂中的芸苔素内酯、巯基丁二酸纳、豆甾醇、龙胆苦苷协同作用显著促进胚胎干细胞的增殖，缩短增殖周期，提高增殖效率。添加剂中的卡那霉素有效避免胚胎干细胞被杂菌污染。采用本发明的添加剂和基础培养基一起进行胚胎干细胞的体外扩增，短时间内可获得大量高质量的人胚胎干细胞，无需动物血清，安全性高，充分满足科研及临床的需求。

本发明还提供了一种人胚胎干细胞体外扩增的方法，在基础培养基中添加本发明的添加剂用于细胞的扩增，提高细胞扩增效率，操作简便，便于人胚胎干细胞的批量化生产。

具体实施方式

下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

下述实施例人胚胎干细胞来源为按照本领域技术人员已知的方法在体外分离得到的人胚胎干细胞，下述实施例主要用于证明对人胚胎干细胞增殖培养的有益效果，对人胚胎干细胞的来源和体外分离方法无关，采用了本领域技术人员已知的任意方法体外分离获得的人胚胎干细胞都可应用于下述实施例，产生几乎等同的增殖效果。

实施例1

一种人胚胎干细胞体外扩增用添加剂，用于添加于胚胎干细胞体外扩增用高糖DMEM培养基中，以培养基终浓度计，添加剂中各组分的浓度为：芸苔素内酯2.0ng/mL、巯基丁二酸纳3.5ng/mL、豆甾醇15.8ng/mL、龙胆苦苷13.0 ng/mL、卡那霉素8ng/mL、L-谷氨酰胺16ng/mL。

一种人胚胎干细胞体外扩增方法，包括以下步骤：

（1）将体外分离的人胚胎干细胞接种于高糖DMEM培养基中，在包被纤维粘连蛋白的培养皿中预培养24h；

（2）取高糖DMEM培养基加入上述添加剂得到扩增用培养基，在所述扩增用培养基中接种步骤（1）体外分离的人胚胎干细胞，接种密度为7×10

实施例2

一种人胚胎干细胞体外扩增用添加剂，用于添加于胚胎干细胞体外扩增用高糖DMEM培养基中，以培养基终浓度计，添加剂中各组分的浓度为：芸苔素内酯1.5ng/mL、巯基丁二酸纳2.8ng/mL、豆甾醇13.3ng/mL、龙胆苦苷10.0ng/mL、卡那霉素5ng/mL、L-谷氨酰胺15ng/mL。

一种人胚胎干细胞体外扩增方法，包括以下步骤：

（1）将体外分离的人胚胎干细胞接种于高糖DMEM培养基中，在包被纤维粘连蛋白的培养皿中预培养24h；

（2）取高糖DMEM培养基加入上述添加剂得到扩增用培养基，在所述扩增用培养基中接种步骤（1）体外分离的人胚胎干细胞，接种密度为5×10

实施例3

一种人胚胎干细胞体外扩增用添加剂，用于添加于胚胎干细胞体外扩增用高糖DMEM培养基中，以培养基终浓度计，添加剂中各组分的浓度为：芸苔素内酯4.5ng/mL、巯基丁二酸纳5.0ng/mL、豆甾醇17.5ng/mL、龙胆苦苷14.5ng/mL、卡那霉素10ng/mL、L-谷氨酰胺20ng/mL。

一种人胚胎干细胞体外扩增方法，包括以下步骤：

（1）将体外分离的人胚胎干细胞接种于高糖DMEM培养基中，在包被纤维粘连蛋白的培养皿中预培养24h；

（2）取高糖DMEM培养基加入上述添加剂得到扩增用培养基，在所述扩增用培养基中接种步骤（1）体外分离的人胚胎干细胞，接种密度为8×10

对比例1

对比例1提供一种人胚胎干细胞体外扩增用添加剂，和实施例1的区别为：省去芸苔素内酯，其余均和实施例1相同。

对比例2

对比例2提供一种人胚胎干细胞体外扩增用添加剂，和实施例1的区别为：省去巯基丁二酸纳，其余均和实施例1相同。

对比例3

对比例3提供一种人胚胎干细胞体外扩增用添加剂，和实施例1的区别为：省去巯基丁二酸纳，将芸苔素内酯的用量调整为5.5ng/mL，其余均和实施例1相同。

对比例4

对比例4提供一种人胚胎干细胞体外扩增用添加剂，和实施例1的区别为：省去芸苔素内酯，将巯基丁二酸纳的用量调整为5.5ng/mL，其余均和实施例1相同。

对比例5

对比例5提供一种人胚胎干细胞体外扩增用添加剂，和实施例1的区别为：省去豆甾醇，其余均和实施例1相同。

对比例6

对比例6提供一种人胚胎干细胞体外扩增用添加剂，和实施例1的区别为：省去龙胆苦苷，其余均和实施例1相同。

对比例7

对比例7提供一种人胚胎干细胞体外扩增用添加剂，和实施例1的区别为：省去龙胆苦苷，将豆甾醇的用量调整为28.8 ng/mL，其余均和实施例1相同。

对比例8

对比例8提供一种人胚胎干细胞体外扩增用添加剂，和实施例1的区别为：省去豆甾醇，将龙胆苦苷的用量调整为28.8 ng/mL，其余均和实施例1相同。

统计实施例1至3，对比例1至8中胚胎干细胞的增殖倍数及细胞存活率，其中增殖倍数=培养7天统计的细胞总数量/初始接种数量，细胞存活率=活细胞数量/总细胞数量×100%，细胞数量采用台盼蓝染色法统计，结果如表1所示。

表1

由表1可以看出实施例1至3中的细胞增殖倍数远高于对比例1至8，细胞存活率稍高于对比例1至8。对比例1至8中调整了添加剂的成分，从表1可以可以看出：本发明添加剂中的芸苔素内酯、巯基丁二酸纳、豆甾醇、龙胆苦苷协同作用显著促进胚胎干细胞的增殖，缩短增殖周期，大大提高细胞的增殖倍数，最终扩增获得的细胞数量较多，细胞存活率高。

采用本发明的添加剂和基础培养基一起进行胚胎干细胞的体外扩增，短时间内可获得大量高质量的人胚胎干细胞，无需动物血清，安全性高，充分满足科研及临床的需求。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。