基因组编辑方法与构建体

技术领域

本发明涉及将外源性DNA序列整合到细胞基因组中的方法，其包括令细胞接触供体核酸、与靶向序列同源的互补链寡核苷酸和识别靶向序列的核酸酶。本发明还涉及包含所述供体核酸和/或与靶向序列同源的互补链寡核苷酸和 /或核酸酶的载体以及其医药用途。

背景技术

孟德尔遗传疾病作为显性遗传病，由于传统基因治疗只能替代基因功能并且不能避免功能获得性(GOF)突变的退行性影响，给治疗带来了难题。在过去的几年中，基因组编辑已经成为治疗显性遗传疾病的一个可行的选择。基因组编辑使用内切核酸酶，通常是CRISPR/Cas9[1，2]。CRISPR-Cas9是这样的核糖核蛋白，其结合称为向导RNA(gRNA)的序列并通过沃森克里克碱基互补识别靶DNA序列。这个靶DNA序列必须邻近原型间隔子-邻近基序(PAM) 序列，其允许Cas9结合DNA并切割靶序列[3]。基于RNA的Cas9靶向有助于靶向不同基因座的设计，并且甚至允许通过将Cas9和2个不同的gRNA递送到同一细胞来靶向2个不同的序列。Cas9靶向基因组中的特定位置后，其产生双链制动(brake)(DSB)，其将通过以下两种修复机制之一修复：

非同源末端连接(NHEJ)是大多数细胞类型中最主要的机制，因为其在细胞周期的所有阶段都具有活性，并且包括在DSB位点插入或缺失随机碱基以修复DSB。这种随机插入或缺失(INDEL(插入缺失))常导致阅读框改变，从而敲除靶向的基因的表达[3]。等位基因特异性敲除GOF突变应当使得野生型拷贝不受影响，从而维持基因的正常功能，同时避免GOF等位基因的影响[4]。虽然该方法使用具有广泛活性的NHEJ修复途径，但是其应用受到这样的限制： GOF等位基因处gRNA/PAM组合的可用性以及其使用局限于特定突变，即各突变应具有其自己的一组治疗性AAV载体；

同源定向修复(HDR)是主要发生在细胞周期G期和S2期的过程，并且使用同源模板(其可以通过外部供体DNA或通过其他等位基因提供)，用于精确纠正DSB[3]。通过HDR的基因纠正已经在体外[5]和体内[6-9]，甚至是在没有Cas9的情况下[7]成功应用。然而，其在体内的效率受限于分化的细胞中同源重组途径的低活性[10]。因此，本领域需要替代的治疗性基因替换策略，以使未经历主动再生的组织和分化的细胞中的基因纠正成为可能。还需要非突变依赖性基因替换策略，其中突变型和野生型等位基因与基因的正确拷贝交换，从而允许同时沉默突变型等位基因和替换野生型序列。为了克服等位基因特异性敲除和通过HDR的基因纠正的局限性，最近发展了同源非依赖性靶向整合(HITI)[11，12]。HITI使用供体DNA，其侧接感兴趣的基因中相同的 gRNA靶序列(图2)。在Cas9切割基因和供体DNA后，细胞的NHEJ机制可以在切割修复中纳入供体DNA，并且在没有插入缺失的情况下，整合率令人惊讶的高(60-80％)。通过使其gRNA靶序列反转，避免了供体DNA可能的反向整合，因此如果发生反向整合时，Cas9可以识别并再次切割靶序列。因为 HITI使用NHEJ，所以其对终末分化细胞诸如神经元或组织诸如肝脏有效，并且不依赖于其再生潜能(例如在成人和儿童组织中)[12]。此外，HITI介导的野生型治疗性基因拷贝插入具有独立于特定致病突变和靶细胞潜在增殖状态的治疗潜力[12]。令人惊奇地，本发明人发现HITI可以用于通过用供体DNA 提供的基因的正确拷贝替换突变型和野生型等位基因来治疗显性遗传疾病。这将避免由等位基因特异性敲除所致靶序列限制，并且将扩大该疗法对同一基因中的所有突变的适用性，并且能够靶向非分裂细胞和组织诸如神经系统或视网膜。此外，发明人利用HITI将肝脏转化成用于全身释放高水平的治疗性蛋白质的工厂，这对于因功能丧失或这样的病症所致的许多遗传性和常见病症的治疗是需要的，上述病症中需要被替代的因子分泌自肝脏和/或必须通过血液到达其他靶器官以发挥其功能，诸如血友病、LSD或糖尿病，这克服了现有的疗法，如低效酶替代疗法、传统基因疗法和基因编辑的局限性。基于腺相关病毒 (AAV)的载体因其安全性、广泛的趋向性以及提供长期转基因表达的能力而最常被用于基因疗法的体内应用[13]。然而，考虑到AAV基因组的附加型状态，随着时间的推移，在发育中的肝脏中或者在肝损伤的情况下，AAV的肝转基因表达可能会丢失[14]。因此，需要更稳定且有效的肝转基因表达。AAV介导的HITI通过将感兴趣的分泌蛋白(即ARSB)的编码序列插入高度转录的白蛋白基因座克服了所述限制[6-9]，这提供了系统分泌的高水平蛋白质的长期表达。色素性视网膜炎(RP)是一组异质性遗传性视网膜疾病(IRD)，全球每3000-5000 人中就有一人受到影响。所有RP病例中30-40％的病例有常染色体显性遗传。视紫红质(RHO)基因中的突变导致美国约25％的显性RP病例和世界其他地区约20％的病例。P23H在北美是最常见的突变，占美国所有RP病例的9％，而在其他大陆几乎没有。P23H突变破坏视紫红质的正确折叠，并因此使其累积在内质网(ER)中。这激活未折叠的蛋白反应(UPR)和蛋白酶体，从而消除突变视紫红质。这两种机制都是通过其存在而被组成性地激活，从而导致光受体的细胞毒性。一些携带P23H的动物模型被广泛用于研究，尤其是 mRho-P23H敲入[15]和hRHO-P23H转基因[16]小鼠。

另一方面，P347(S和L)位置的突变在欧洲和亚洲很常见。在西班牙[17] 和意大利[18]，P347L占显性RP的4.5％。P347位置的突变具有显性负效应，其改变突变型和野生型视紫红质向视杆外段(outer segment)的运输。这会导致损害光传导中的视杆功能以及膜运输，进而导致光受体死亡[19]。T.Dryja等 [20]建立了表达hRHO-P347S的转基因小鼠模型并在本文中使用。在两种情况下，疾病表型因具有功能获得/显性负效应的突变所致，因此需要降低毒性产物的水平，而不是或除了添加正确的基因拷贝(常规基因疗法)，以提供显著益处。因此，治疗显性色素性视网膜炎的理想方法是在不改变野生型等位基因的情况下特异性地敲除突变等位基因。最近的研究包括使用工程改造的锌指核酸酶敲除P347S RHOmRNA[21]，以及使用内切核酸酶进行切割来特异性地敲除 GOF等位基因。这取决于对突变等位基因非常特异性的识别，所述突变等位基因大多数情况下因点突变所致。最近，不同的文献已经证明了视网膜中等位基因特异性敲除治疗不同类型的色素性视网膜炎的可行性。Bakondi等证明转基因大鼠模型中的小鼠S334Ter-3等位基因与WT大鼠等位基因是不同的[22]。然而，这些方法都是针对一个单一突变，而显性色素性视网膜炎可能因多个不同的突变所致。仍然需要一种治疗策略，其允许突变等位基因的非突变依赖性沉默以及功能基因的替代，这将适用于更多的患者。粘多糖病VI型(MPS VI) 是一种罕见的溶酶体贮存障碍(LSD)，其因芳基硫酸酯酶B(ARSB)缺乏所致，导致广泛积累并尿排出毒性糖胺聚糖(GAG)。临床上，MPS VI表型的特征在于生长迟缓、面部特征粗糙、骨骼畸形、关节僵硬、角膜混浊、心脏瓣膜增厚和器官肿大，且无原发性认知障碍[24]。针对MPS的疗法依赖于分泌正常溶酶体水解酶，然后通过甘露糖-6-磷酸受体途径被大多数细胞摄取。本发明人证明，重组AAV载体血清型8(AAV2/8)(其在肝脏特异性甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子(AAV2/8.TBG.hARSB)的转录控制下编码ARSB)的单次全身给药导致MPS VI动物模型中持续的肝脏转导和表型改善[25-31]。本发明人还证明，这与MPS VI小鼠中每周给予酶替代疗法(ERT)(当前针对这种疾病的护理标准)至少同样有效[32-34]。本发明人最近发起了I/II期临床试验(ClinicalTrials.gov标识符：NCT03173521)，以测试该方法在MPS VI 患者中的安全性和有效性。高转录的白蛋白基因座中HITI有可能克服AAV的肝基因治疗安全有效的局限性，包括：i.转基因表达水平，白蛋白基因座的水平特别高；ii.在基因组基因座插入治疗性编码序列以保证转基因表达的稳定性，如果发生肝细胞丢失，其将被复制。发明人成功地证明了这种方法在溶酶体贮积病(MPS VI)模型中的有效性，为其他LSD或需要稳定表达全身性治疗蛋白的慢性衰弱性疾病(诸如血友病、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症、糖尿病、慢性炎症性肠病等)的新型基因疗法策略奠定了基础。因此，仍然需要用于需要稳定全身性表达治疗蛋白的疾病的基因疗法策略。

发明概述

本发明涉及基于非同源末端连接(NHEJ)的基因编辑策略以将外源性构建体整合到靶基因中。所述策略允许有效靶向非分裂细胞，从而产生更好的靶向产量和治疗水平感兴趣基因的表达。有利地，本发明的方法允许将纠正基因直接插入突变等位基因的位点中，其优点是在内源性启动子下表达纠正基因，导致生理水平的表达，这对于超生理表达基因可能导致毒性作用的疾病尤其有利。在AAV介导的本发明治疗组合物递送的情况下使用NHEJ所带来的另一优点是能够携带较大的外源性构建体，并且靶向由大基因中突变所致的疾病。事实上，相较于基于HDR的基因编辑策略，靶向整合所需的同源区域很少。对于显性负突变体如Rho P347S，另一个优势是毒性等位基因的伴随性沉默。本发明也适合基因特异性靶向，这取决于向导RNA设计，例如向导RNA(gRNA 或sgRNA)可以相比野生型等位基因特异地识别突变等位基因。有利地，本发明的方法可以涉及靶向安全基因座基因，例如，已知为中性“安全”基因组区域的基因组基因座，其中外源性基因序列的插入不会导致毒性事件，例如 AAVS1位点，和/或感兴趣的组织中基因的表达，例如白蛋白基因座。本发明依赖于将感兴趣的序列插入在肝脏中高水平表达的基因的基因座内，例如白蛋白。有利地，作为NHEJ介导的基因靶向的结果，白蛋白基因并不表达并且感兴趣的基因在白蛋白启动子下表达。这导致感兴趣基因的高水平表达，虽然来自肝实质内相对较少的细胞，因此，白蛋白的表达作为一个整体没有受到破坏，并且感兴趣基因的表达足够高以达到治疗效果。此外，因为感兴趣的基因被稳定地整合到肝脏基因组中，在组织再生时(在儿童或在肝脏损伤时)，感兴趣的基因的表达不会丢失。

发明的具体实施方式

因此，本发明的目的之一是将外源性DNA序列整合到细胞基因组中的方法，其包括令细胞接触：

a)供体核酸，其包含：

-至少一个终止(STOP)密码子和翻译起始序列(TIS)或，

-核糖体跳跃序列，和

-所述外源性DNA序列，

其中，所述供体核酸在5'和3'侧接反向靶向序列；

b)与靶向序列同源的互补链寡核苷酸和

c)识别靶向序列的核酸酶。

优选地，所述翻译起始序列(TIS)是kozak共有序列或IRES序列。优选地，核糖体跳跃(ribosomal-skipping)序列是T2A、P2A、E2A、F2A，优选 T2A序列。优选地，所述IRES序列是60-70bp、优选约50bp、更优选50bp的合成序列。

在优选实施方式中，供体核酸包含：

-至少一个终止密码子，和

-翻译起始序列(TIS)，其中所述TIS是kozak序列或IRES序列，所述 IRES序列是60-70bp，优选约50bp，更优选50bp和40bp的合成序列，和

-所述外源性DNA序列。

优选地，所述供体核酸包含三个可能框中的终止密码子，优选地，所述三个可能框中的终止密码子包含或或由插入各框中的两个终止密码子组成，优选地，所述三个可能框中的终止密码子包括或由SEQ ID NO:1 (TAATAAATAATAAATAATAA)的序列或其排列(permutation)组成。优选地：

所述kozak共有序列包括或基本上由下述内容组成：

-与SEQ ID NO:54(gccacc)或其功能片段具有至少98％相同性的序列或，

-序列SEQ ID NO:55(gccncc)，其中n可以是g或a，和/或

所述IRES序列包含或基本上由与SEQ ID NO:24 (TgACAAACTgTACATgCCgTTAACTgTAATTTTgCgTgATTTTTTTgTAg)或

SEQ ID NO:23 (AggTggTAgCCgCAAACATAgTTCAATACAAACTTgCTgTCTCggCgg)或其功能片段具有至少95％相同性的序列组成，

所述核糖体跳跃序列T2A序列包含或基本上由与SEQ ID NO:32 (ggaagcggagagggcagaggaagtctgctaacatgcggtgacgtcgaggagaatcctggacct)或SEQ ID NO:25-28的编码序列或其功能片段具有至少80％相同性的序列组成和/或，

所述靶向序列包含或基本上由与SEQ ID NO:29 (GCAGCCGCAGTACTACCTGG)、SEQID NO:30 (AGTACTGCGGATACTCAAAG)、SEQ ID NO:31 (ACAAGAGTGAGATCGCCCAT)或其功能片段具有至少95％相同性的序列组成和/或，

所述与靶向序列同源的互补链寡核苷酸包含或基本上由与SEQ ID NO:56(CCAGGTAGTACTGCGGCTGC)、SEQ ID NO:57 (CTTTGAGTATCCGCAGTACT)、SEQ ID NO:58(ATGGGCGATCTCACTCTTGT)或其功能片段具有至少95％相同性的序列组成。

在优选实施方式中，靶向序列可以包含或基本上具有所述序列与SEQ ID NO:56(CCAGGTAGTACTGCGGCTGC)、SEQ ID NO:57 (CTTTGAGTATCCGCAGTACT)、SEQ ID NO:58(ATGGGCGATCTCACTCTTGT)或其功能片段具有至少95％相同性的序列，和/或所述与靶向序列同源的互补链寡核苷酸可以包含或基本上具有与SEQ ID NO:29(GCAGCCGCAGTACTACCTGG)、SEQ ID NO:30 (AGTACTGCGGATACTCAAAG)、SEQ ID NO:31(ACAAGAGTGAGATCGCCCAT)或其功能片段具有至少95％相同性的序列。

优选地，供体核酸还包含聚腺苷酸化信号，优选牛生长激素多聚A。

优选地，所述靶向序列是包含在视紫红质(Rho)或肝表达的基因(例如白蛋白基因)中的序列。优选地，所述靶向序列是包含在肝表达的基因中的序列，而所述供体DNA序列是分泌的治疗性蛋白质例如芳基硫酸酯酶B(ARSB) 的编码序列。

优选地，靶向序列包含在：

-RHO基因的第一外显子，优选来自人、小鼠或猪，

-白蛋白基因的第二外显子，优选来自人或小鼠，

或其功能片段。

优选地，所述靶向序列是向导RNA(gRNA)靶位点，并且所述与所述靶向序列同源的互补链寡核苷酸是与基因的靶向序列杂交的向导RNA。

所述gRNA靶位点包含或基本上就有与SEQ ID NO:29 (GCAGCCGCAGTACTACCTGG)、SEQ ID NO:30 (AGTACTGCGGATACTCAAAG)、SEQ ID NO:31 (ACAAGAGTGAGATCGCCCAT)或其功能片段具有至少95％相同性的序列，和/或所述向导RNA可以包含或基本上具有与SEQ IDNO:29 (GCAGCCGCAGTACTACCTGG)、SEQ ID NO:30 (AGTACTGCGGATACTCAAAG)、SEQ ID NO:31(ACAAGAGTGAGATCGCCCAT)或其功能片段具有至少95％相同性的序列。

所述外源性DNA序列优选包含报告基因，优选所述报告基因选自下述中的至少一种：香菇珊瑚红(dicosoma red)、绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、荧光素酶、β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖醛酸酶。

所述核酸酶优选自：CRISPR核酸酶、TALEN、DNA引导的核酸酶、大范围核酸酶(Meganuclease)和锌指核酸酶，优选所述核酸酶是选自下组的CRISPR 核酸酶：Cas9、Cpfl、Casl2b(C2cl)、Casl3a(C2c2)、Cas3、Csf1、Casl3b (C2c6)，和C2c3或其变体，诸如SaCas9或VQR-Cas9-HF1。

所述互补链寡核苷酸、所述供体核酸所述编码所述核酸酶的多核苷酸包含在病毒或非病毒载体中，优选所述病毒载体选自：腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒和腺病毒。

优选地，细胞选自下组中的一个或多个：淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、内皮细胞、上皮细胞、肝细胞、骨细胞、血小板、脂肪细胞、心肌细胞、神经元、视网膜细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、精母细胞、卵母细胞和胰腺细胞、诱导多能干细胞(iPS细胞)、干细胞、造血干细胞、造血干细胞祖细胞，优选所述细胞是眼睛的视网膜细胞或对象的肝细胞。

本发明的另一目的是由上述定义可获得的细胞，优选地，用于医药用途或用于治疗遗传疾病或用于治疗其中突变型和野生型等位基因被供体DNA提供的基因的正确拷贝替换的显性遗传疾病或用于治疗因功能丧失所致的遗传性和常见疾病，优选所述疾病包括血友病，糖尿病，溶酶体贮积病，包括黏多醣贮积症(MPSI、MPSII、MPSIIIA、MPSIIIB、MPSIIIC、MPSIVA、MPSIVB、 MPSVII)、鞘脂沉积病(法布瑞氏症、戈谢病、尼曼-匹克氏病、GM1神经节苷脂沉积症)，脂褐质沉积症(巴顿病和其他)和粘脂贮积症；腺苷酸琥珀酸缺乏，血友病A和B，ALA丙氨酸脱水酶缺乏，肾上腺脑白质营养不良，常染色体显性。上述细胞可以用于治疗显性遗传性视觉疾病，例如视网膜变性，优选色素性视网膜炎、神经和肝脏疾病。

本发明的又一个目的是系统，其包括：

a)供体核酸，其包含：

-至少一个终止密码子和翻译起始序列(TIS)或，

-核糖体跳跃序列，和

-所述外源性DNA序列，

其中，所述供体核酸在5'和3'侧接反向靶向序列；

b)与靶向序列同源的互补链寡核苷酸和

c)识别靶向序列的核酸酶。

在优选实施方式中，所述供体核酸及/或至少一个终止密码子和/或核糖体跳跃序列和/或翻译起始序列(TIS)和/或外源性DNA序列和/或靶向序列和/ 或互补链寡核苷酸和/或核酸酶如上定义。

优选地，所述互补链寡核苷酸和/或所述供体核酸和/或所述编码所述核酸酶的多核苷酸包含在一个或多个病毒载体或非病毒载体中，优选所述病毒载体选自：腺相关病毒、逆转录病毒、腺病毒和慢病毒。

根据本发明的系统优选用于医药用途，优选用于治疗遗传疾病或用于治疗其中突变型和野生型等位基因被供体DNA提供的基因的正确拷贝替换的显性遗传疾病或用于治疗因功能丧失所致的遗传性和常见疾病，优选所述疾病包括血友病，糖尿病，溶酶体贮积病，包括黏多醣贮积症(MPSI、MPSII、MPSIIIA、 MPSIIIB、MPSIIIC、MPSIVA、MPSIVB、MPSVII)、鞘脂沉积病(法布瑞氏症、戈谢病、尼曼-匹克氏病、GM1神经节苷脂沉积症)，脂褐质沉积症(巴顿病和其他)和粘脂贮积症；腺苷酸琥珀酸缺乏，血友病A和B，ALA丙氨酸脱水酶缺乏，肾上腺脑白质营养不良，常染色体显性。上述细胞可以用于治疗显性遗传性视觉疾病，例如视网膜变性，优选色素性视网膜炎、神经和肝脏疾病。

本发明的另一个目的是表达载体，其包含如上所定义的系统或供体核酸和 /或与靶向序列同源的互补链寡核苷酸和/或识别如上所定义的靶向序列的核酸酶。

在本发明中，载体优选选自下组：腺相关载体(AAV)、腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体或裸质粒DNA载体。本发明的另一个目的是宿主细胞，其包含上文所定义的表达载体。

本发明的另一个目的是病毒颗粒，其包含上文所定义的系统或表达载体。

优选地，所述病毒颗粒包含AAV的衣壳蛋白。

优选地，所述病毒颗粒包含选自下组中的一个或多个AAV血清型的衣壳蛋白：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9 和AAV10，优选来自AAV2或AAV8血清型。

本发明的另一目的是药物组合物，其包含下述之一：如上所定义的系统或表达载体或宿主细胞或病毒颗粒和药学上可接受的运载体。

本发明的又一个目的是试剂盒，其包括：一个或多个容器中的如上所定义的系统或表达载体或宿主细胞或病毒颗粒或如上所定义的药物组合物，任选地还包含描述如何将核酸构建体、载体、宿主细胞、病毒颗粒或药物组合物给予患者的说明书或包装材料。

如上所定义的系统或表达载体或宿主细胞或病毒颗粒或药物组合物，优选用作药物，优选用于治疗视网膜营养不良，优选所述视网膜营养不良选自：色素性视网膜炎，莱伯氏先天性黑蒙，视锥营养不良或视锥-视杆营养不良， Stargardt病(ELOVL4)，希佩尔林道征(Von Hippel-Lindau)，视网膜母细胞瘤，神经性，肝脏疾病，溶酶体贮积病，包括黏多醣贮积症(MPSI、MPSII、 MPSIIIA、MPSIIIB、MPSIIIC、MPSIVA、MPSIVB、MPSVII)，褐质沉积症(巴顿病和其他)和粘脂贮积症；肝脏能用作产生和分泌治疗性蛋白质的工厂的其他疾病，诸如糖尿病、腺苷酸琥珀酸缺乏，血友病A和B，ALA丙氨酸脱水酶缺乏，肾上腺脑白质营养不良，常染色体显性(疾病)。

本发明的另一目的是如上所定义的表达载体用于产生病毒颗粒。

优选地，本发明的目的是本文所提及的序列。

优选地，供体DNA盒原件和/或gRNA表达盒原件和/或启动子序列和/或 gRNA表达的U6启动子和/或gRNA和/或gRNA靶位点和/或Cas9/Cas9-2a-GFP 和/或治疗性转基因

和/或多聚A和/或终(STOP止信号和/或起始(START)信号 (Kozak/T2A/IRES)

是下述序列SEQ ID NO 3-22中描述的序列。

在实施方式中，本发明的方法是离体的或体外的。

在实施方式中，在本发明的方法中，细胞是来自对象或患者的分离的细胞。

在本发明上下文中的反向靶向序列位于供体DNA的上游和下游，所述供体DNA是经切割然后整合到靶基因组中的DNA构建体。反向靶向序列与识别靶基因组基因座(例如白蛋白或视紫红质)中向导RNA的序列完全相同，但是是反向的。这允许获得单向整合。

优选地，当翻译起始序列(TIS)是核糖体跳跃T2A序列或存在核糖体跳跃T2A序列时，不存在至少一个终止密码子。

优选地，至少一个终止密码子选自下组：TAG、TAA、TGA。

为了在三个可能的框中插入终止密码子，在各个框中插入两个终止密码子，例如，TAATAAATAATAAATAATAA(SEQ ID NO:1)。可以使用上述终止密码子的任何排列或组合。

优选地，视紫红质(Rho)的序列公开于下述登记号：人：AB065668.1，小鼠：AC142099.3，猪：AEMK02000087.1，而白蛋白的序列优选述于下述登录号：AC140220.4。.

优选地，香菇珊瑚红具有序列SEQ ID NO:2 (atggatagcactgagaacgtcatcaagcccttcatgcgcttcaaggtgcacatggagggctccgtgaacggccacg agttcgagatcgagggcgagggcgagggcaagccctacgagggcacccagaccgccaagctgcaggtgaccaag ggcggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtccccccagttccagtacggctccaaggtgtacgtgaagcacccc gccgacatccccgactacaagaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacgg cggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggcaccttcatctaccacgtgaagttcatcggcgtgaa cttcccctccgacggccccgtaatgcagaagaagactctgggctgggagccctccaccgagcgcctgtacccccgcg acggcgtgctgaagggcgagatccacaaggcgctgaagctgaagggcggcggccactacctggtggagttcaagtc aatctacatggccaagaagcccgtgaagctgcccggctactactacgtggactccaagctggacatcacctcccacaa cgaggactacaccgtggtggagcagtacgagcgcgccgaggcccgccaccacctgttccag)。

在根据本发明的方法中，外源性DNA包含相较于基因组至少一个核苷酸差异。

在本发明的优选实施例中，包含IRBP和Cas9的一个载体与包含如上所定义的供体DNA的第二载体联用

优选地，供体DNA序列在3'和5'处侧接gRNA识别但反向的(例如反向靶位点)相同gRNA靶位点。

根据本发明可获得的细胞表达外源性序列。

在本发明的上下文中，优选核酸酶存在于不同的载体中，特别是当使用 AAV载体时。

优选地，使用AAV2/8载体。

在本发明中，包含Cas9或spCas9的第一载体优选受控于组织特异性启动子，例如肝特异性杂交肝启动子(HLP)或视网膜特异性启动子。所述载体还包含短的合成多聚A(sh多聚A)。优选地，第二载体包含如上所定义的gRNA 表达盒和供体DNA。优选地，白蛋白特异性gRNA在U6启动子下。优选地，供体DNA在3'和5'侧接反向白蛋白gRNA靶位点，优选包含PAM。

优选地，上述第二载体可替代地包含用于白蛋白特异性gRNA，和包含 ARSB编码序列的供体DNA的表达盒，如上文所定义。

在优选实施方式中，所述感兴趣的基因以及NHEJ位点特异性插入所需的酶由两个AAV载体携带，其中由于过程所需元件有限的大小，可采用较大的感兴趣的基因。发明人确实最小化了结构部分(例如使用插入位点而不是同源臂)，允许在载体中插入更长的cDNA。

在本发明的上下文中，供体核酸通过非同源末端连接插入到基因中。

本发明还提供了药物组合物，其包含如上所定义的核酸或如上定义的核苷酸序列或如上所定义的载体和药学上可接受的稀释剂和/或赋形剂和/或运载体。

优选地，组合物还包含治疗剂，优选地，治疗剂选自下组：酶替代疗法和小分子疗法。

优选地，通过选自下组的途径给予药物组合物：脑脊液(CSF)、鞘内、肠外、静脉内、病灶内、腹腔内、肌肉内、肿瘤内、皮下、心室内、小脑延髓池内、腰椎、颅内、脊柱内、静脉内，局部、鼻、口、眼、视网膜下或其任何组合。

本发明还提供了包含上述核酸或核苷酸序列的载体用于医药用途，其中所述载体通过选自下组的途径给予：脑脊液(CSF)、鞘内、肠外、静脉内、病灶内、腹腔内、肌肉内、肿瘤内、皮下、脑室内、小脑延髓池内、腰椎、颅内、脊柱内、静脉内，局部、鼻、口、眼、视网膜下或其任何组合。本发明的载体优选通过静脉内、肠胃外、眼内，优选视网膜下途径给予。

优选地，载体是病毒载体，优选地，病毒载体是慢病毒载体、腺相关病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、脊髓灰质炎病毒载体、基于鼠马洛尼 (Maloney)的病毒载体、α病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体、痘苗病毒载体、杆状病毒载体，或细小病毒载体，优选地，腺相关病毒是AAV2、AAV9、 AAV1、AAVSH19、AAVPHP.B、AAV8、AAV6。

优选地，所述核苷酸序列被插入载体，优选病毒载体，仍然优选腺相关载体中。

在本发明中，至少“80％相同性”指相同性可以是与提及的序列至少80％、或85％或90％或95％或100％序列相同性。这应用于所有提到的％相同性。在本发明中，至少“95％相同性”指相同性可以是与提及的序列至少95％、96％、 97％、98％、99％或100％序列相同性。这应用于所有提到的％相同性。在本发明中，至少“98％相同性”指相同性可以是与提及的序列至少98％、99％或100％序列相同性。这应用于所有提到的％相同性。优选的，％相同性涉及提到序列的全长。

本发明中还包括衍生自本文述及的核苷酸序列的核酸序列，例如，功能片段、突变体、变体、衍生物、类似物和与本文述及的序列具有至少80％相同性％的序列

通过参考下图非限制性实施例阐述本发明。

附图说明

图1：靶向RHO基因座的HITI设计：黄色矩形和蓝色三角形描述了gRNA 靶序列的两个部分(Cas9裂解的上游和下游)。剪刀表示Cas9介导的DSB。打叉的剪刀表示Cas9不能识别和切割序列。PAM序列用红色和下划线描述。 STOP：终止密码子，START：翻译起始位点，bGH：牛生长激素多聚A。

图2：mRho中HITI的体外试验：A)用于HEK293细胞中转染的质粒：黄色矩形和蓝色三角形描述了gRNA靶序列的两个部分(分别为Cas9裂解的上游和下游)。Cbh：鸡β-肌动蛋白杂交启动子。STOP：终止密码子，START：翻译起始位点，bGH polyA：牛生长激素多聚A。细胞在4％PFA中固定15分钟，并用含DAPI的固定培养基染色。B)转染后48小时HEK293细胞的荧光显微镜观察：细胞在4％PFA中固定15分钟，并用含DAPI的固定培养基染色。 C)荧光HEK293细胞的代表性FACS图表：在用胰蛋白酶0.05％EDTA转染后48小时分离细胞。各样品计数10000个细胞。Q1：EGFP-/DsRed+，Q2： EGFP+/DsRed+，Q3:EGFP-/DsRed-，Q4:EGFP+/DsRed-。红色正方形描述了分选的细胞。PE-A：DsRed荧光过滤器。.FITC-A：EGFPDsRed荧光过滤器。.D) EGFP+群中DsRed+细胞的定量。

图3：mRho基于中的Surveyor试验：描述了预期的条带大小。T7E：T7 内切核酸酶Ⅰ处理。

图4：小鼠视网膜中的体内HITI。A)用于小鼠视网膜中HITI的AAV 的示意图：IRBP：间光受体(interphotoreceptor)类视黄醇结合蛋白启动子。 sh多聚A(shpolyA)：短的合成多聚A。bGH：牛生长激素多聚A。黄色矩形和蓝色三角形描述了gRNA靶序列的两个部分(Cas9切割的上游和下游)。以蓝色环描述ITR序列。B)视网膜冰冻切片的荧光显微镜观察：注射后30天收获眼，并在4％PFA中过夜固定。用30％蔗糖处理眼6小时，然后包括在最佳冷却培养基中。制备10μm切片，并用含DAPI的固定培养基染色。C)定量DsRed+ 光受体，以评估HITI效率，**＝p<0.01。

图5：HITI连接(Junction)扩增。DNA提取自视网膜颞侧并用于PCR 扩增HITI连接。A)方案描述了引物设计以扩增5’和3’连接。B)5’连接扩增。预期的片段大小为206bp。PCR扩增仅在一个gRNA处理的视网膜中观察到。 C)3’连接扩增。预期的片段大小为473bp。PCR扩增仅在一个gRNA处理的视网膜中观察到。

图6：mRho中HITI连接的NGS表征：围绕切割位点的各个位置的相对插入缺失频率。负数和正数分别表示删除和插入。相对于切割位点的+1位置用蓝线划线。仅描述在其位置相对频率高于0.05％的插入缺失。

图7：猪视网膜中的HITI：A)DsRed+光受体仅存在于gRNA处理的视网膜中。B)定量DsRed+光受体以评估猪视网膜中的HITI效率，***＝p>0.001。

图8：pRho中的插入缺失表征。A)使用提取自视网膜或RPE:T7E:T7内切核酸酶I处理的DNA进行的pRho基因座的Surveyor试验。描述了PCR产物的大小和预期的裂解条带。B)pRho基因座的TIDE分析：对由提取自视网膜或RPE的DNA扩增的PCR产物进行测序。将RPE序列用作TIDE的模板。将色谱图用于解构插入缺失的频率和类型。A)代表性TIDE结果。B)猪视网膜中插入缺失频率的定量。

图9：使用HITI纠正RP表型。A)用于P23H+/-小鼠治疗的AAV载体的示意图：ITR用蓝色描述。IRBP：间光受体类视黄醇结合蛋白启动子。sh多聚 A：短的合成多聚A。hRHO CDS：人RHO基因的编码序列，bGH：牛生长激素多聚A。黄色矩形和蓝色三角形描述了gRNA靶序列的两个部分(Cas9切割的上游和下游)。B)在p60处的P23H小鼠中ERG B波的改善。Cd.s/m

图10：ONL厚度的组织学分析：A)在p120处收获的视网膜的苏木精- 伊红染色的显微镜图像。B)经分析的视网膜颞区的ONL厚度的定量。

图11：构建体的大小和T2A序列不影响体外HITI的效率。

A)hRHO-2A-DsRed构建体的设计。B)荧光显微镜显示不同大小的2个供体DNA的HITI效率没有差异。C)DsRed+/GFP+细胞的FACS定量。

图12：用于整合到白蛋白基因座中的HITI设计以及所用gRNA和病毒载体的示意图：A)对小鼠白蛋白基因第二内含子具有特异性的gRNA的设计。 PAM序列用红色描述。B)小鼠肝脏中用于HITI的AAV2/8载体的示意图。供体DNA侧接相同的gRNA靶序列。供体DNA包含3个框中的终止密码子，翻译起始序列(kozak)，报告基因DsRed和bGH-多聚-A。C)Cas9和供体DNA 递送后预期的HITI的描述。剪刀表示Cas9介导的DSB。打叉的剪刀表示Cas9 不能识别靶位点。

图12：用于整合到白蛋白基因座中的HITI设计以及所用gRNA和病毒载体的示意图：A)对小鼠白蛋白基因第二内含子具有特异性的gRNA的设计。 PAM序列用红色和下划线描述。B)小鼠肝脏中用于HITI的AAV2/8载体的示意图。供体DNA侧接相同的gRNA靶序列。供体DNA包含3个框中的终止密码子，翻译起始序列(kozak)，报告基因DsRed和bGH-多聚-A。C)Cas9和供体DNA递送后预期的HITI的描述。剪刀表示Cas9介导的DSB。打叉的剪刀表示Cas9不能识别靶位点。

图13：小鼠肝细胞中Alb基因座中DsRed的靶向整合。在p2通过颞血管静脉内给予4*10

图14：插入缺失表征。A)白蛋白2外显子处插入缺失检测的Surveyor试验。DNA提取自肝脏并用于围绕Cas9靶序列的基因组区域的PCR扩增。扩增了592bp片段。描述了T7E1消化产物的预期大小。T7E1:T7内切核酸酶Ⅰ治疗。B)插入缺失频率的定量。包括加扰(scramble)和PBS中观察到的无显著性的插入缺失。C)因微同源(microhomolgy)介导的末端连接(MMEJ) DSB修复所致的常见7bp缺失的示意图。微同源区域用蓝色正方形描述。PAM用红色和下划线描述。

图15：HITI连接扩增。A)方案描述了引物设计以扩增5’和3’连接。B) 5’连接扩增。预期的片段大小为663bp。PCR扩增在所有gRNA处理的肝脏中观察到，而在所有加扰处理的肝脏中不存在。C)3’连接扩增。预期的片段大小为455bp。PCR扩增在所有gRNA处理的肝脏中观察到，而在所有加扰处理的肝脏中并不存在。

图16：Alb基因座中HITI连接的NGS。HITI连接的NGS读数中插入和缺失频率的分布。A)5'连接：总读数＝80000-100000，B)3'连接：总读数＝ 250000-350000。负数和正数分别表示删除和插入。蓝色条显示DSB后的+1位置。

图17：HITI在成年小鼠肝脏中有效且呈剂量依赖性。4周龄C57BL/6小鼠用4*10

图18：用于令ARSB编码序列整合到小鼠肝细胞白蛋白基因座的AAV的设计。HLP：杂交肝启动子，sh多聚(poly)A：短的多聚A，U6：RNA聚合酶3的U6启动子，STOP：3个不同框内的终止密码子。hARSB CDS：人芳基硫酸酯酶B的编码序列，bGH多聚A：生长激素多聚A。填充DNA用灰色描述。黄色矩形和蓝色三角形描述了gRNA靶序列的两个部分(Cas9切割的上游和下游)。

图19：小鼠血清中ARSB水平。使用利用针对人ARSB的抗体的免疫试验每月测定血清ARSB。在各个时间点观察到的值分别表示各只小鼠。

图20：治疗后3个月尿GAG减少。测量注射后3个月收集的尿液的尿 GAG。用肌酸酐标准化GAG水平。结果表示为相对于经加扰gRNA处理的对照影响的小鼠中GAG水平的百分比。圆圈表示单个分析的小鼠。线条代表组平均值和标准误差。

序列表中序列的描述

图例：

P939//pSpCas9(BB)-2A-GFP+gRNA加扰

p972//pSpCas9(BB)-2A-GFP+gRNA hRHO HITI

p995/SpCas9-2A-GFP-HITI mRHO

p1070//pSpCas9(BB)-2A-GFP-gRNA白蛋白

p946//pAAV-IRBP-SpCas9

p1139_pAAV2.1._HLP_SpCas9(HA)_spA

p1135//pAAV2.1 mRHOgRNA-mRHO HITI(kozak-dsRED)_hVmd2-EGFP

p1116//pAAV_加扰_mRHO HITI(kozak-dsRED)_hVmd2-EGFP

p1048//pAAV2.1-加扰-mRHO HITI(IRESdsRED)-Vmd2-EGFP

p1047//pAAV2.1-mRHOgRNA-mRHOHITI(IRESdsRED)-hVDM2-EGFP

p1138//pAAV-mRHO HITI(kozak-hRHO-T2A-dsRED)+mRHO gRNA

p1118//pAAV_加扰_sRHO HITI(kozak-dsRED)_hVmd2-EGFP

p1126//pAAV_sRHOgRNA_sRHO HITI(kozak-dsRED)_hVmd2-EGFP

p1222//pAAV2.1_sRHOgRNA+sRHO HITI(IRES-dsRED)_Vmd2_GFP

p1227//pAAV2.1_sRHOgRNA+sRHO HITI(IRES-dsRED)_Vmd2_GFP

p1160//pAAV_Alb5'HITI(kozak-dsRED)+gRNA mAlb 5'

p1161//pAAV_Alb5'HITI(kozak-dsRED)+加扰

p1336//pAAV_mAlb5'HITI(kozak-ARSB)+Stuffer DNA+gRNA

p1240//pAAV2.1_mAlb5'HITI(kozak-ARSB)NEW+加扰

p1239//pAAV2.1_mAlb5'HITI(kozak-ARSB)NEW+gRNA

本发明的质粒

表1：本发明的质粒

定义

上述外源性DNA序列包含待纳入靶基因组的基因组DNA的DNA片段。在一些实施方式中，外源性DNA包含基因的至少一部分。外源性DNA可以包含编码序列，例如，与野生型基因或与必须表达的因子的“密码子优化”序列相关的cDNA。在一些实施方式中，外源性DNA包含基因的至少一个外显子和/ 或基因的至少一个内含子。在一些实施方式中，外源性DNA包含基因的增强子元件或启动子元件。在一些实施方式中，外源性DNA包含基因的不连续序列，所述基因包含融合到该基因3'部分的该基因的5'部分。在一些实施方式中，外源性DNA包含野生型基因序列。在一些实施方式中，外源性DNA包含突变型基因序列。在一些实施方式中，外源性DNA包含野生型基因序列。在一些实施方式中，外源性DNA包含报告基因。在一些实施方式中，报告基因选自下述中的至少一种：绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、荧光素酶、β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖醛酸酶。在一些实施方式中，外源性DNA序列包含基因转录调节元件，其可以例如包含启动子序列或增强子序列。在一些实施方式中，外源性DNA序列包含一个或多个外显子或其片段。在一些实施方式中，外源性DNA序列包含其一个或多个内含子或其片段。在一些实施方式中，外源性DNA包含至少部分3'未翻译区或5'未翻译区。在一些实施方式中，外源性DNA包含人工DNA序列。在一些实施方式中，外源性DNA序列包含核定位序列和/或核输出序列。在一些实施方式中，外源性DNA序列包含待整合于靶基因组基因座的核酸片段。在一些实施方式中，外源性DNA序列包含一个或多个感兴趣的多核苷酸。在一些实施方式中，外源性DNA序列包含一个或多个表达盒。在一些实施方式中，这类表达盒包含感兴趣的外源性DNA 序列，编码选择标志物和/或报告基因的多核苷酸，和影响表达的调控组件。在一些实施方式中，外源性DNA序列包含基因组核酸。所述基因组核酸源自动物、小鼠、人、非人、啮齿动物、非人、大鼠、仓鼠、兔子、猪、牛、鹿、羊、山羊、鸡、猫、狗、雪貂、灵长类动物(如狨猴、恒河猴)、家养哺乳动物或农业哺乳动物、鸟、细菌、古生动物、病毒，或感兴趣的任何其它有机体或其组合。任何合适大小的外源性DNA序列被整合到靶基因组中。在一些实施方式中，整合到基因组中外源性DNA序列的长度小于3，约3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、 13.5、14、14.5、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、100、 150、200、250、300、350、400、450、500或大于500千碱基(kb)。在一些实施方式中，整合到基因组中外源性DNA序列的长度为至少2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、 12.5、13、13.5、14、14.5、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、 50、100、150、200、250、300、350、400、450、500或大于500(kb)。

在一些实施方式中，靶向构建物(其包含在5'和3'侧接反向靶向序列的供体核酸)包含至少两个靶向序列。本文中的靶向序列是由核酸酶识别和切割的核酸序列。在一些实施方式中，靶向序列的长度为约9-约12个核苷酸、长度为约12-约18个核苷酸、长度为约18-约21个核苷酸、长度为约21-约40个核苷酸、长度为约40-约80个核苷酸或子范围的任何组合(例如，9-18、9-21、 9-40和9-80个核苷酸)。在一些实施方式中，靶向序列包含核酸酶结合位点。在一些实施方式中，靶向序列包含切口(nick)/切割位点。在一些实施方式中，靶向序列包含原型间隔子邻近基序(PAM)序列。在一些实施方式中，靶核酸序列(例如，原型间隔子)是20个核苷酸。在一些实施方式中，靶核酸小于 20个核苷酸。在一些实施方式中，靶核酸为至少5、10、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25、30或更多个核苷酸。在一些实施方式中，靶核酸为至多5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或更多个核苷酸。在一些实施方式中，靶核酸序列是紧邻PAM第一核苷酸的5'的16、17、 18、19、20、21、22或23个碱基。在一些实施方式中，靶核酸序列是紧邻PAM 最后一个核苷酸的3'的16、17、18、19、20、21、22或23个碱基。在一些实施方式中，靶核酸序列是紧邻PAM第一核苷酸5'的20个碱基。在一些实施方式中，靶核酸序列是紧邻PAM最后一个核苷酸3'的20个碱基。在一些实施方式中，靶核酸序列是PAM的5'或3'。在一些实施方式中，靶向序列包括靶核酸中存在的核酸序列，其结合互补链核酸的核酸靶向区段。例如，在一些实施方式中，靶向序列包括互补链核酸被设计成与之碱基配对的序列。在一些实施方式中，靶向序列包含任何多核苷酸，其位于例如细胞的细胞核或细胞质中或者细胞的细胞器诸如线粒体或叶绿体内。靶向序列包括核酸酶的切割位点。在一些实施方式中，靶向序列邻近核酸酶的切割位点。在一些实施方式中，核酸酶在互补链的核酸靶向序列与之结合的靶核酸中存在的核酸序列内或外的位点处切割核酸。在一些实施方式中，切割位点包括核酸酶于此产生单链断裂或双链断裂的核酸位置。例如，形成包含与蛋白酶识别序列杂交并与蛋白酶复合的互补链核酸的核酸酶复合物导致互补链核酸间隔子区域与之结合的靶核酸中存在的核酸序列中或附近(例如，在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、19、 20、23、50或更多个碱基对)的一条或两条链的切割。在一些实施方式中，切割位点仅在核酸的一条链或两条链上。在一些实施方式中，切割位点位于核酸的两条链上相同的位置(产生钝端)或各条链上不同的位置(产生交错 (staggered)端)。在一些实施方式中，交错端是5'或3'突出粘性端。在一些实施方式中，交错端通过粘性端产生核酸酶(例如，Cpfl)产生。在一些实施方式中，例如，交错端通过使用两种核酸酶产生，其各自在各条链上不同的切割位点产生单链断裂，从而产生双链断裂。例如，第一切口酶在双链DNA (dsDNA)的第一链上产生单链断裂，而第二切口酶在dsDNA的第二链上产生单链断裂，从而产生突出序列。在某些情况下，第一链上切口酶的核酸酶识别序列与第二链上切口酶的核酸酶识别序列通过至少2、3、4、5、6、7、8、9、 10、15、20、25、30、40、50、75、100、250、500或1000个碱基对分离。在一些实施方式中，通过核酸酶对靶核酸进行位点特异性切割发生在通过互补链核酸和靶核酸之间的碱基配对互补性确定的位置。在一些实施方式中，通过核酸酶蛋白质对靶核酸进行位点特异性切割发生在通过靶核酸中短基序(称为原型间隔子相邻基序(PAM))确定的位置。例如，PAM在核酸酶识别序列的 3'端侧接核酸酶识别序列。例如，在一些实施方式中，核酸酶的切割位点是PAM 序列上游或下游的约1-约25，或约2-约5，或约19-约23个碱基对(例如，3 个碱基对)。在一些实施方式中，核酸酶的切割位点是PAM序列上游的3个碱基对。在一些实施方式中，核酸酶的切割位点为(+)链上的19个碱基和(-)链上的23个碱基，产生长度为5个核苷酸(nt)的5'突出端。在一些情况下，切割产生钝端。在一些情况下，切割产生具有5'突出端的粘性端或交错端。在一些情况下，切割产生具有3'突出端的粘性端或交错端。不同核酸酶蛋白质的直系同源物利用不同的PAM序列。例如，在一些实施方式中，不同的Cas蛋白质识别不同的PAM序列。例如，在酿脓链球菌(S.pyogenes)中，PAM是靶核酸中的序列，其包含序列5'-XRR-3'，其中R是A或G，其中X是任何核苷酸，X紧邻间隔子序列靶向的靶核酸序列的3'。酿脓链球菌Cas9(SpyCas9) 的PAM序列是5'-XGG-3'，其中X是任何DNA核苷酸并且紧邻靶DNA非互补链核酸酶识别序列的3'。Cpfl的PAM是5'-TTX-3'，其中X是任何DNA核苷酸并且紧邻核酸酶识别序列的5'。优选地，Cas9/sgRNA复合物引入DSB至基因组靶序列中PAM序列上游的3个碱基对处，产生两个钝端。完全相同的 Cas9/sgRNA靶序列以相反方向加载于供体DNA上。靶向的基因座以及供体 DNA被Cas9/gRNA切割，并且线性化的供体DNA通过NHEJ-DSB修复途径整合到靶位点中。如果供体DNA以正确的方向整合，那么连接序列被保护免于Cas9/gRNA的进一步切割。如果供体DNA以相反方向整合，那么Cas9/gRNA 将由于完整Cas9/gRNA靶位点的存在而切除整合的供体DNA。

互补链核酸，例如互补链寡核苷酸或互补链RNA，指与另一核酸(例如细胞基因组中的靶核酸)杂交的核酸。互补链核酸可以是例如RNA或DNA。在一些实施方式中，互补链核酸包含核苷酸类似物和/或修饰的核苷酸。在一些实施方式中，互补链核酸经编程或设计以特异性结合核酸位点的序列。在一些实施方式中，互补链核酸包含一个或多个修饰，以提供具有新的或增强的特征的核酸。在一些实施方式中，互补链核酸包含核酸亲和力标签和/或合成核苷酸、合成核苷酸类似物、核苷酸衍生物和/或修饰核苷酸。在一些实施方式中，互补链核酸包括例如在5'端或3'端处或附近与靶核酸中序列杂交的核苷酸序列(例如间隔子)。在一些实施方式中，互补链核酸的间隔子通过杂交(即，碱基配对)以序列特异性方式与靶核酸相互作用。在一些实施方式中，间隔子序列杂交位于原型间隔子基序(PAM)5'或3'的靶核酸(例如，原型间隔子序列)。在一些实施方式中，互补链核酸包含两个单独的核酸分子，其被称为双互补链核酸。在一些实施方式中，互补链核酸包含单个核酸分子，其被称为单互补链核酸。在一些实施方式中，互补链核酸是包含crRNA的单互补链核酸。在一些实施方式中，互补链核酸是包含融合构建体的单互补链核酸。在一些实施方式中，互补链核酸的核酸靶向区包括与靶核酸中序列互补的核苷酸序列。在一些实施方式中，核酸靶向区包括间隔子区。间隔子区的核苷酸序列变化并决定靶核酸内与互补链核酸相互作用的位置。在一些实施方式中，互补链核酸的间隔子区经修饰以杂交靶核酸内的任何所需序列。互补性要么是完美的，要么是实质性的/足够的。两个核酸之间的完美互补性意指两个核酸形成一个双链体，其中双链体中的各个碱基通过沃森克里克配对结合互补碱基。实质性或足够的互补性意指一条链中的序列与相对链中的序列不完全和/或完美互补，但是两条链上的碱基之间发生足够的结合，以在一组杂交条件(例如盐浓度和温度)下形成稳定的杂交体复合物。通过使用序列和标准数学计算来预测杂交链的Tm，或者通过使用常规方法来经验性地确定Tm，可以预测这类条件。在一些实施方式中，互补链核酸的核酸靶向区(例如间隔子)的长度为18-72个核苷酸。互补链核酸的核酸靶向区(例如间隔子)的长度为约12个核苷酸-约100个核苷酸。例如，互补链的核酸靶向区(例如间隔子)的长度为约12个核苷酸(nt) -约80nt、约12nt-约50nt、约12nt-约40nt、约12nt-约30nt、约12nt-约25 nt、约12nt-约20nt、约12nt-约19nt、约12nt-约18nt、约12nt-约17nt、约12nt-约16nt或约12nt-约15nt。或者，DNA靶向区段的长度为约18nt- 约20nt、约18nt-约25nt、约18nt-约30nt、约18nt-约35nt、约18nt-约40 nt、约18nt-约45nt、约18nt-约50nt、约18nt-约60nt、约18nt-约70nt、约18nt-约80nt、约18nt-约90nt、约18nt-约100nt、约20nt-约25nt、约 20nt-约30nt、约20nt-约35nt、约20nt-约40nt、约20nt-约45nt、约20nt- 约50nt、约20nt-约60nt、约20nt-约70nt、约20nt-约80nt、约20nt-约90 nt或约20nt-约100nt。

在一些实施方式中，互补链核酸的核酸靶向区(例如间隔子区)的长度为 20个核苷酸。在一些实施方式中，互补链核酸的核酸靶向区(例如间隔子区) 的长度为19个核苷酸。在一些实施方式中，互补链核酸的核酸靶向区(例如间隔子区)的长度为18个核苷酸。在一些实施方式中，互补链核酸的核酸靶向区(例如间隔子区)的长度为17个核苷酸。在一些实施方式中，互补链核酸的核酸靶向区(例如间隔子区)的长度为16个核苷酸。在一些实施方式中，互补链核酸的核酸靶向区(例如间隔子区)的长度为21个核苷酸。在一些实施方式中，互补链核酸的核酸靶向区(例如间隔子区)的长度为22个核苷酸。在一些实施方式中，通过识别感兴趣区域内的PAM并选择PAM上游或下游所需大小的区域作为原型间隔子来鉴定原型间隔子序列。通过确定原型间隔子区域的互补序列来设计相应的间隔子序列。在一些实施方式中，使用计算机程序 (例如，机器可读代码)来识别间隔子序列。在一些实施方式中，计算机程序使用变量，诸如预测解链温度，二级结构形成，和预测退火温度，序列相同性，基因组背景，染色质可及性，％GC，基因组发生频率，甲基化状态、SP存在等。在一些实施方式中，核酸靶向序列(例如间隔子序列)和靶核酸内的核酸酶识别序列(例如原型间隔子)之间的互补性百分比为至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。在一些实施方式中，核酸靶向序列和靶核酸内核酸酶识别序列之间的互补性百分比在约20个相邻核苷酸上为至少60％。在一些实施方式中，互补链核酸包括提供额外所需特征(例如，修饰或调节的稳定性；亚细胞靶向性；荧光标签追踪；蛋白质或蛋白质复合物的结合位点；等等)的修饰或序列。这类修饰的示例包括，例如，5'帽(例如，7-甲基鸟苷酸帽(m7G))； 3'聚腺苷酸尾(即3'多聚(A)尾)；核糖开关序列(例如，允许蛋白质和/或蛋白质复合物调节稳定性和/或调节可及性)；稳定性控制序列；形成dsRNA双链体(即发夹)的序列；将RNA靶向到亚细胞位置(例如细胞核、线粒体、叶绿体等)的修饰或序列；提供追踪的修饰或序列(例如，与荧光分子的直接偶联、与促进荧光检测的部分的偶联、允许荧光检测的序列等)；或提供蛋白质 (例如，作用于DNA的蛋白质，包括转录激活剂、转录抑制剂、DNA甲基转移酶、DNA脱甲基酶、组蛋白乙酰转移酶、组蛋白脱乙酰基酶及其组合)结合位点的修饰或序列。互补链核酸以任何形式提供，例如以RNA的形式，既可以为两个分子(例如，分开的crRNA和tracrRNA)或一个分子(例如，sgRNA)。在一些实施方式中，互补链核酸以与核酸酶蛋白质形成复合物的形式提供。或者，互补链核酸也以编码RNA的DNA的形式提供。编码互补链核酸的DNA 交替地编码单互补链核酸(例如sgRNA)或分开的RNA分子(例如分开的crRNA 和tracrRNA)。在后一种情况下，编码互补链核酸的DNA分别作为编码crRNA 和tracrRNA的分开的DNA分子提供。在一些实施方式中，编码互补链核酸的DNA稳定地整合在细胞的基因组中，并且任选地，可操作地连接细胞中具有活性的启动子。在一些实施方式中，编码互补链核酸的DNA可操作地连接表达构建体中的启动子。互补链核酸通过任何合适的方法制备。例如，使用例如T7 RNA聚合酶通过体外转录制备互补链核酸。在一些实施方式中，互补链核酸也是通过化学合成制备的合成产生的分子。

识别靶向序列的核酸酶为本领域技术人员所知，并且包括但不限于：锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、成簇且规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)核酸酶和大范围核酸酶。下文更详细地描述组合物中发现并在本文所公开的方法中有用的核酸酶。

“锌指核酸酶”或“ZFN”是Fokl的切割结构域和包含3个或更多锌指基序的 DNA识别结构域的融合体。两个单独的ZFN在DNA中特定位置以精确方向和间距的异二聚作用在DNA中导致双链断裂。在一些情况下，ZFN将切割结构域融合到各锌指结构域的C末端。为了使两个切割结构域进行二聚化并切割 DNA，使两个单独的ZFN结合DNA的相对链，并且其C末端相隔一定距离。在一些情况下，锌指结构域和切割结构域之间的接头序列要求各结合位点的5' 边缘相隔约5-7bp。能够用于本发明的示例性ZFN包括但不限于下述内容中的那些：Urnov等,Nature Reviews Genetics,2010,11:636-646；Gaj等,Nat Methods,2012,9(8):805-7；美国专利号6,534,261；6,607,882；6,746,838； 6,794,136；6,824,978；6,866,997；6,933,113；6,979,539；7,013,219；7,030,215； 7,220,719；7,241,573；7,241,574；7,585,849；7,595,376；6,903,185；6,479,626；和美国专利申请公开号2003/0232410和2009/0203140。在一些实施方式中，ZFN 是锌指切口酶，其中在一些实施方式中是工程改造的ZFN，其诱导位点特异性单链DNA断裂或切口。锌指切口酶的描述存在于例如，Ramirez等,Nucl Acids Res,2012,40(12):5560-8；Kim等,Genome Res,2012,22(7):1327-33。

“TALEN”或“TAL效应物核酸酶”是工程改造的转录激活因子样效应物核酸酶，其包含DNA结合串联重复序列的中心结构域、核定位信号和C末端转录激活结构域。在一些情况下，DNA结合串联重复序列包含长度为33-35个氨基酸并且在位置12和13处包含识别一个或多个特异性DNA碱基对的两个高变氨基酸残基。通过将TAL效应物DNA结合域与DNA切割域融合产生 TALEN。例如，TALE蛋白可以融合核酸酶，诸如野生型或突变型Fokl内切核酸酶或Fokl的催化结构域。针对FokI在TALEN中的用途，已经对FokI进行了多种突变；例如，它们将改善切割特异性或活性。这类TALEN经工程改造以结合任何所需DNA序列。TALEN通常用于通过在靶DNA序列中产生双链断裂来生成基因修饰，从而使靶DNA序列经历NHEJ或HDR。在一些情况下，提供单链供体DNA修复模板，以促进HDR。TALEN及其用于基因编辑的用途的详细描述存在于例如，美国专利号8,440,431；8,440,432；8,450,471；8,586,363；和8,697,853；Scharenberg等,Curr Gene Ther,2013,13(4):291-303；Gaj等,Nat Methods,2012,9(8):805-7；Beurdeley等,Nat Commun,2013,4:1762；和Joung 和Sander,Nat Rev Mol CellBiol,2013,14(l):49-55。DNA

“DNA引导的核酸酶”是这样的核酸酶，其通过与另一核酸(例如，细胞基因组中的靶核酸)杂交利用单链DNA互补核苷酸将核酸酶引导到基因组中的正确位置。在一些实施方式中，DNA引导的核酸酶包括阿尔古(Argonaute) 核酸酶。在一些实施方式中，DNA引导的核酸酶选自TtAgo、PfAgo和NgAgo。在一些实施方式中，DNA引导的核酸酶是NgAgo。

"大范围核酸酶"是稀切内切核酸酶或归巢核酸酶，在一些实施方式中，其具有高度特异性，识别长度为至少12个碱基对的DNA靶位点，例如，长度为 12-40个碱基对或12-60个碱基对。

本文预期使用任何大范围核酸，包括但不限于：I-Scel，I-Scell，I-SceIII，I-SceIV，I-SceV，I-SceVI，I-SceVII，I-Ceul，I-CeuAIIP，I-Crel，I-CrepsblP， I-CrepsbllP，I-CrepsbIIIP，I-CrepsbIVP，I-Tlil，I-Ppol，PI-PspI，F-Scel，F-Scell， F-Suvl，F-Tevl，F-TevII，I-Amal，I-Anil，I-Chul，I-Cmoel，I-Cpal，I-CpaII， I-Csml，I-Cvul，I-CvuAIP，I-Ddil，I-DdiII，I-Dirl，I-Dmol，I-Hmul，I-HmuII， I-HsNIP，I-Llal，I-Msol，I-Naal，I-Nanl，I-NcIIP，I-NgrIP，I-Nitl，I-Njal， I-Nsp236IP，I-Pakl，I-PboIP，I-PcuIP，I-PcuAI，I-PcuVI，I-PgrlP，1-PobIP， I-Porl，I-PorIIP，I-PbpIP，I-SpBetaIP，I-Scal，I-SexIP，1-SneIP，I-Spoml，I- SpomCP，I-SpomIP，I-SpomIIP，I-SquIP，I-Ssp6803I，I-SthPhiJP，I-SthPhiST3P， I-SthPhiSTe3bP，I-TdeIP，I-Tevl，I-TevII，I-TevIII，I-UarAP，I-UarHGPAIP， I-UarHGPA13P，I-VinlP，1-ZbiIP，PI-MtuI，PI-MtuHIPPI-MtuHIIP，PI-PfuI， PI-PfuII，PI-PkoI，Pl-PkoII，PI-Rma43812IP，PI-SpBetaIP，PI-SceI，PI-Tful， PI-TfuII，PI-Thyl，PI-Tlil，PI-THII，I-Crel大范围核酸酶，I-Ceul大范围核酸酶，I-Msol大范围核酸酶，I-Scel大范围核酸酶，或其任何活性变体，片段，突变体或衍生物。

CRISPR(成簇且规律间隔的短回文重复序列)/Cas(CRISPR相关蛋白) 是基于细菌系统的工程改造的核酸酶系统，其用于基因组工程改造。其部分基于多种细菌和古细菌的适应性免疫反应。当病毒或质粒侵入细菌时，侵入物的 DNA片段通过“免疫”反应转化为CRISPR RNA(crRNA)。然后，crRNA通过部分互补的区域与另一类型的RNA(称为tracrRNA)结合，以将Cas(如Cas9) 核酸酶引导到与靶DNA中的crRNA同源的区域，称为“原型间隔子”。Cas(例如，Cas9)核酸酶切割DNA，以在双链断裂处产生钝端，所述双链断裂在crRNA 转录本中包含的20个核苷酸的互补链序列所指定的位点。在一些实施方式中， Cas(例如Cas9)核酸酶需要crRNA和tracrRNA用于位点特异性DNA识别和切割。现在已对该系统进行工程改造，从而在某些实施方式中，crRNA和 tracrRNA结合成一个分子(“单向导RNA”或“sgRNA”)，并且单向导RNA 的crRNA等效部分经工程改造以引导Cas(例如，Cas9)核酸酶，从而靶向任何所需序列(参见，例如Jinek等(2012)Science 337:816-821；Jinek等(2013) eLife 2:e00471；Segal(2013)eLife 2:e00563)。因此，CRISPR/Cas系统可以经工程改造，以在细胞基因组中所需靶点处产生双链断裂，并利用细胞的内源性机制来通过同源定向修复(HDR)或非同源末端连接(NHEJ)修复诱导的断裂。在一些实施方式中，Cas核酸酶具有DNA切割活性。在一些实施方式中， Cas核酸酶指导在靶DNA序列中的位置处的一条或两条链的切割。例如，在一些实施方式中，Cas核酸酶是具有一个或多个失活催化结构域的切口酶，其切割靶DNA序列的单链。Cas核酸酶的非限制性示例包括：Casl，CaslB，Cas2， Cas3，Cas4，Cas5，Cas6，Cas7，Cas8，Cas9(也称为Csnl和Csxl2)，CaslO，， Cpfl，C2c3，C2c2和C2clCsyl，Csy2，Csy3，Csel，Cse2，Cscl，Csc2，Csa5， Csn2，Csm2，Csm3，Csm4，Csm5，Csm6，Cmrl，Cmr3，Cmr4，Cmr5，Cmr6， Cpfl，Csbl，Csb2，Csb3，Csxl7，Csxl4，CsxlO，Csxl6，CsaX，Csx3，Csxl， Csxl5，Csfl，Csf2，Csf3，Csf4，其同源物，其变体，其突变体和其衍生物。存在3种主要类型的Cas核酸酶(I型、II型和III型)，以及10种亚型，包括5种I型蛋白，3种II型蛋白和2种III型蛋白(参见例如，Hochstrasser和 Doudna,Trends Biochem Sci,2015:40(1):58-66)。II型Cas核酸酶包括但不限于： Cas1、Cas2、Csn2和Cas9。本领域技术人员熟知这些Cas核酸酶。例如，酿脓链球菌野生型Cas9多肽的氨基酸序列示于例如，NBCI序列编号NP 269215，而嗜热链球菌野生型Cas9多肽的氨基酸序列示于例如，NBCI序列编号 WP_011681470。在一些实施方式中，Cas核酸酶(例如Cas9多肽)衍生自多种细菌物种。"Cas9"指RNA引导的双链DNA结合核酸酶蛋白或切口酶蛋白。野生型Cas9核酸酶有两个功能性结构域，如RuvC和HNH，它们切割不同的 DNA链。当两个功能性结构域被激活之时，Cas9可以诱导基因组DNA(靶 DNA)双链断裂。在一些实施方式中，Cas9酶包含衍生自述于下组的细菌的 Cas9蛋白的一个或多个催化结构域：棒状杆菌(Corynebacter)，萨特氏菌 (Sutterella)，军团杆菌(Legionella)，密螺旋体(Treponema)，纤毛因子，真细菌(Eubacterium)，链球菌，乳酸菌，支原体，拟杆菌，黄腐菌(Flaviivola)，黄杆菌(Flavobacterium)，鳞球菌(Sphaerochaeta)，固氮螺菌(Azospirillum)，葡萄酸杆菌(Gluconacetobacter)，奈瑟菌(Neisseria)，罗氏菌(Roseburia)，细小杆菌(Parvibaculum)，葡萄球菌，硝酸杆菌(Nitratifractor)和弯曲杆菌。在一些实施方式中，Cas9是融合蛋白，例如，两个催化结构域来自不同的细菌物种。有用的Cas9核酸酶变体包括单个非活性催化结构域，如RuvC或HNH 酶或切口酶。Cas9切口酶仅具有一个活性功能性结构域，并且在一些实施方式中，仅切割靶DNA的一条链，从而产生单链断裂或缺口。在一些实施方式中，具有至少D10A突变的突变型Cas9核酸酶是Cas9切口酶。在其它实施方式中，具有至少H840A突变的突变型Cas9核酸酶是Cas9切口酶。Cas9切口酶中存在的突变的其它示例包括但不限于：N854A和N863 A。如果使用靶向相反DNA 链的至少两个DNA靶向RNA，那么使用Cas9切口酶引入双链断裂。双切口诱导的双链断裂可以通过NHEJ或HDR修复。这种基因编辑策略有利于HDR，并且降低脱靶DNA位点插入缺失突变的频率。在一些实施方式中，针对靶细胞或靶生物体对Cas9核酸酶或切口酶进行密码子优化。在一些实施方式中， Cas核酸酶是Cas9多肽，其包含RuvCl和HNH核酸酶结构域的两个沉默突变(D10A和H840A)，其被称为dCas9。在一个实施方式中，来自酿脓链球菌的dCas9多肽包含位置D10、G12、G17、E762、H840、N854、N863、H982、 H983、A984、D986、A987或其任意组合处的至少一个突变。这类dCas9多肽和其变体的描述在例如国际专利公开号WO 2013/176772中提供。在一些实施方式中，dCas9酶包含D10、E762、H983或D986处的突变，以及H840或N863 处的突变。在一些情况中，dCas9酶包含D10A或DION突变。此外，dCas9 酶可选地包含突变H840A、H840Y或H840N。在一些实施方式中，本发明的 dCas9酶包含D10A和H840A；D10A和H840Y；D10A和H840N；DION和 H840A；DION和H840Y；或DION和H840N取代。任选地，取代是保守性或非保守性取代，以使Cas9多肽催化性失活并且能够结合靶DNA。对于基因组编辑方法，一些实施方式中的Cas核酸酶包含Cas9融合蛋白，诸如包含连接到dCas9的IIS型限制酶的催化结构域Fokl的多肽。FokI-dCas9融合蛋白 (fCas9)可以使用两个向导RNA来结合靶DNA的单链，以生成双链断裂。

可以将发明的基因递送载剂给予患者。所述给予可以是“体内”给予或“体外”给予。本领域技术人员能够确定适当的剂量率。术语“给予/给药/施用”包括通过病毒或非病毒技术递送。病毒递送机制包括但不限于如上所述的腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体和杆状病毒载体等。非病毒递送系统包括DNA转染，如电穿孔、脂质介导的转染、致密DNA介导的转染；脂质体，免疫脂质体，脂质体转染试剂，阳离子表面两亲物(CFA)及其组合。通过根据本发明的载体系统递送一个或多个治疗基因可单独使用或与其他治疗或治疗的组件结合使用。

考虑了使用任何合适的递送方法来递送本公开的组合物。在一些实施方式中，HITI系统的单个组件(例如，核酸酶和/或外源性DNA序列)被同时递送或在时间上分隔。基因修饰方法的选择取决于转化的细胞的类型和/或转化发生的环境(例如，体外、体外或体内)。关于这些方法的一般性讨论见Ausubel 等《分子生物学简易方案》(Short Protocolsin Molecular Biology)，第3版，约翰韦利父子公司(John Wiley&Sons)，1995年。

术语“接触细胞”包括本文公开的所有递送方法。在一些实施方式中，本文所公开的方法涉及接触靶DNA或将一个或多个核酸引入细胞(或细胞群)，所述核酸包含编码互补链核酸(例如，gRNA)、位点定向修饰多肽(例如， Cas蛋白)和/或外源性DNA序列的核苷酸序列。包含编码互补链核酸和/或位点定向修饰多肽的核苷酸序列的合适核酸包括表达载体，其中包含编码互补链核酸和/或位点定向修饰多肽的核苷酸序列的表达载体是重组表达载体。递送方法或转化的非限制性实例包括例如病毒或噬菌体感染、转染、偶联、原生质体融合、脂质转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE- 葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染，粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接微量注射和纳米颗粒介导的核酸递送(参见例如，Panyam等Adv Drug Deliv Rev. 2012年9月13日.pii:50169-409X(12)00283-9.doi: 10.1016/j.addr.2012.09.023)。在一些方面中，本发明提供了这样的方法，所述方法包括向宿主细胞递送一个或多个多核苷酸，诸如或本文所述的一个或多个载体，其一个或多个转录本和/或由其转录的一个或多个蛋白质。在一些方面，本公开进一步提供了通过这类方法产生的细胞，以及包含这类细胞或由这类细胞产生的生物体(例如动物、植物或真菌)。在一些实施方式中，向细胞递送与互补链序列组合且任选地与互补链序列复合的核酸酶蛋白质。考虑使用基于常规病毒和非病毒的基因转移方法在哺乳动物细胞或靶组织中引入核酸。这类方法可用于将编码HITI系统组件的核酸给予培养物中的细胞或宿主生物体中。非病毒载体递送系统包括DNA质粒、RNA(例如，本文所述载体的转录本)、裸核酸和与递送载体(例如脂质体)复合的核酸。病毒载体递送系统可以包括DNA和RNA病毒，其在递送至细胞后可以具有附加型或整合的基因组。对于基因治疗法的综述，参见Anderson,Science 256:808-813(1992)；Nabel和Felgner, TIBTECH 11:211-217(1993)；Mitani和Caskey,TIBTECH 11:162-166(1993)； Dillon.TIBTECH 11:167-175(1993)；Miller,Nature 357:455-460(1992)；Van Brunt,Biotechnology 6(10):1149-1154(1988)；Vigne,Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36(1995)；Kremer和Perricaudet,British Medical Bulletin 51(1):31-44(1995)；Haddada等,刊于《微生物与免疫学热门主题》(Current Topics in Microbiology and Immunology)Doerfler和

迄今为止，已经鉴定并分类了数几十种不同的AAV变体(血清型) (Srivastava A,Curr Opin Virol.2016年12月；21:75-80)。所有已知的血清型可以感染多种不同组织类型的细胞。组织特异性通过由衣壳血清型决定，并且对 AAV载体进行假分型以改变其趋向性范围对其在治疗中的应用具有重要意义。假型AAV载体是在第二个AAV血清型的衣壳中包含一个AAV血清型的基因组的载体；例如，AAV2/8载体包含AAV8衣壳和AAV2基因组(Auricchio等 (2001)Hum.Mol.Genet.10(26):3075-81)。这类载体也称为嵌合载体。

血清型2

血清型2(AAV2)迄今为止已经最广泛的检验。AAV2对骨骼肌、神经元、血管平滑肌细胞和肝细胞具有天然的趋向性。AAV2有三种细胞受体：硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)，aVβ5整合素和成纤维细胞生长因子受体1(FGFR-1)。第一种作为主要受体起作用，而后两种具有共受体活性并通过受体介导的内吞作用使AAV进入细胞。这些结果一直受到Qiu,Handa,等的争议。HSPG作为主要受体起作用，通过其在胞外基质中的丰度可以清除AAV颗粒并损害减损感染效率。

其它血清型

虽然AAV2是各自基于AAV的研究中最常见的血清型，但是已经表明其他血清型可以更有效地作为基因传递载体。例如，AAV6在感染气道上皮细胞方面表现得更好，AAV7对小鼠骨骼肌细胞的转导率非常高(类似于AAV1和 AAV5)，AAV8对肝细胞和光受体转导非常出色，AAV1和5在向血管内皮细胞的基因递送方面非常有效。在大脑中，大多数AAV血清型表现出神经趋向性，虽然AAV5也能转导星形胶质细胞。AAV6是AAV1和AAV2的杂交体，其显示出低于AAV2的免疫原性。血清型可能因它们所结合的受体不同而不同。例如，AAV4和AAV5转导可被可溶性唾液酸(对于这些血清型中的每一种具有不同形式)抑制，并且显示AAV5通过血小板衍生的生长因子受体进入细胞。证明新型AAV变体，如四倍酪氨酸突变体或AAV 2/7m8在小动物模型中由玻璃体转导外视网膜(Dalkara D等,Sci Transl Med.2013年6月12 日；5(189):189ra76；Petrs-Silva H等,Mol Ther.2011Feb；19(2):293-301)。另一 AAV突变体命名为ShH10，是一种在玻璃体内给予后具有改善的神经胶质趋向性的AAV6变体(KlimczakRR等,PLoS One.2009Oct 14；4(10):e7467.)。对视网膜具有特别有利的趋向性的另一种AAV突变体是AAV2(四Y-F(quad Y-F))(Hickey DG等,Gene Ther.2017年12月；24(12):787-800)。在本发明的含义内，AAV病毒颗粒包含选自下组中一个或多个AAA血清型的衣壳蛋白：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8 AAV9和AAV 10，优选来自AAV2或AAV8血清型。

考虑将与宿主细胞兼容的任何合适载体用于本发明。真核宿主细胞的载体的非限制性示例包括：pXTl、pSG5、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVLSV40。在一些实施方式中，编码互补链核酸和/或位点定向修饰多肽的核苷酸序列可操作地连接到控制元件，例如转录控制元件，诸如启动子。在一些实施方式中，转录控制元件在真核细胞(例如哺乳动物细胞)或原核细胞(例如细菌或古细菌细胞)中具有功能。在一些实施方式中，编码互补链核酸和/或位点定向修饰多肽的核苷酸序列可操作地连接允许编码互补链核酸和/或位点定向修饰多肽的核苷酸序列在原核和/或真核细胞中表达的多个控制元件。取决于所用的宿主 /载体系统，表达载体可以使用任何数量的合适的转录和翻译控制元件，包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等(例如，U6启动子、 HI启动子等；参见上文)(参见例如，Bitter等(1987)Methods in Enzymology, 153:516-544)。在一些实施方式中，互补链核酸和/或位点定向修饰多肽以RNA 提供。在这种情况下，编码位点定向修饰多肽的RNA和/或互补链核酸通过直接化学合成产生或可在体外由编码互补链核酸的DNA转录。使用RNA聚合酶 (例如，T7聚合酶、T3聚合酶、SP6聚合酶等)在体外合成编码位点定向修饰多肽的RNA和/或互补链核酸。一旦合成，RNA直接接触靶DNA或使用任何适合用于将核酸引入细胞的技术(例如，微量注射、电穿孔、转染等)将其引入细胞。使用合适的转染技术向细胞提供编码互补链核酸(以DNA或RNA 引入)和/或位点定向修饰多肽(以DNA或RNA引入)和/或外源性DNA序列的核苷酸；参见例如，Angel和Yanik(2010)PLoS ONE 5(7):el 1756，以及商购可及的来自凯杰公司(Qiagen)的TransMessenger.RTM.试剂，来自Stemgent 公司的Stemfect.TM.转染试剂盒，和来自Minis Bio有限责任公司(Minis Bio LLC.)的TransIT.RTM.-mRNA转染试剂盒。可以在DNA载体上提供编码互补链核酸和/或位点定向修饰多肽和/或嵌合位点定向修饰多肽和/或外源性DNA 序列的核酸。能够获得可用于将核酸转移到靶细胞中的许多载体，例如质粒、粘粒、微环、噬菌体、病毒等。在一些实施方式中，包含核酸的载体以附加方式保持，例如作为质粒，微环DNA，病毒，诸如巨细胞病毒、腺病毒等，或者通过同源重组或随机整合，例如逆转录病毒衍生载体，诸如MMLV、HIV-1和 ALV，将其整合到靶细胞基因组中。

本文提供用于改变核酸的同源非依赖性靶向整合(HITI)方法和组合物，所述核酸为诸如基因组DNA，包括不分裂的非分裂或终末分化细胞中的基因组 DNA。至少在一些实施方式中，本文中的方法独立于同源性，使用非同源末端连接将外源性DNA插入靶DNA，诸如细胞(诸如非分裂或末端分化细胞)的基因组DNA。在一些实施方式中，本文所述方法包括将外源性DNA序列整合到非分裂细胞的基因组中的方法，所述方法包括令所述非分裂细胞接触包含靶向构建物的组合物，所述靶向构建物包含外源性DNA序列和靶向序列，与所述靶向序列同源的互补链寡核苷酸和核酸酶，其中所述外源性DNA序列包含相较于所述基因组的至少一个核苷酸差异，并且所述靶向序列被所述核酸酶识别。在本文公开的HITI方法的一些实施方式中，外源性DNA序列是包含待插入靶细胞或宿主细胞基因组中的所需序列的DNA片段。至少部分外源性DNA 序列具有与靶细胞或宿主细胞的部分基因组同源的序列，并且至少部分外源性 DNA序列具有与靶细胞或宿主细胞的部分基因组不同源的序列。例如，在一些实施方式中，外源性DNA序列可以包含部分宿主细胞基因组DNA序列，其中具有突变。因此，当外源性DNA序列整合到宿主细胞或靶细胞基因组中时，外源性DNA序列中存在的突变被携带到宿主细胞或靶细胞基因组中。在本文所公开的HITI方法的一些实施方式中，外源性DNA序列侧接至少一个靶向序列。在一些实施方式中，外源性DNA序列侧接两个靶向序列。靶向序列包含被至少一种核酸酶识别的特定DNA序列。在一些实施方式中，在具有相对靶向序列的同源序列的互补链寡核苷酸存在下的情况下，靶向序列被核酸酶识别。在一些实施方式中，在本文所公开的HITI方法中，靶向序列包含由酸酶识别并切割的核苷酸序列。识别靶向序列的核酸酶为本领域技术人员所知，并且包括但不限于：锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、成簇且规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)核酸酶。在一些实施方式中， ZFN包含锌指DNA结合域和DNA切割域，其融合在一起以产生序列特异性核酸酶。在一些实施方式中，TALEN包含TAL效应物DNA结合域和DNA切割域，其融合在一起以产生序列特异性核酸酶。在一些实施方式中，CRISPR核酸酶是天然存在的核酸酶，其识别与在原核DNA中通常存在的成簇且规律间隔的短回文重复序列同源的DNA序列。CRISPR核酸酶包括但不限于：Cas9 Cpfl、C2c3、C2c2和C2cl。通常，本发明的Cas 9是脱靶活性降低的变体，如SpCas9 D10A(Ran,F.A.,等,，使用CRISPR-Cas9系统进行基因组工程改造 (Genomeengineering using the CRISPR-Cas9 system).Nat Protoc,2013.8(11): 第2281-2308页

(RuvC结构域切割活性失活)，SpCas9 N863A(Ran,F.A.,等,，使用 CRISPR-Cas9系统进行基因组工程改造(Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system).NatProtoc,2013.8(11):第2281-2308页)

(HNH结构域切割活性失活)，SpCas9-HF1(Kleinstiver,B.P.,等,不具有无可检测到的全基因组脱靶效应的高保真CRISPR-Cas9核酸酶(High-fidelity CRISPR-Cas9nucleases with no detectable genome-wide off-target effects).Nature, 2016.529(7587):第490-5页)(通过蛋白质工程改善降低Cas9结合能)， eSpCas9(laymaker,I.M.,等,特异性改善的合理工程改造的Cas9核酸酶 (Rationally engineered Cas9 nucleaseswith improved specificity).Science,2016. 351(6268):第84-8页)(减少Cas9的正电荷)，EvoCas9(asini,A.,等,通过酵母体内筛选鉴定高特异性SpCas9变体(A highlyspecific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast).NatBiotechnol,2018.36(3):第265-271 页)(REC3结构域突变)，KamiCas9(Merienne,N.,等,用于编辑CNS疾病基因的自失活KamiCas9系统(The Self-Inactivating KamiCas9 Systemfor the Editing of CNS Disease Genes).Cell Rep,2017.20(12):p.2980-2991)(表达后敲除Cas9)

在一些实施方式中，本文公开的HITI方法能够将突变引入宿主基因组或靶基因组以及修复宿主基因组或靶基因组中的突变。在本文所述方法的一些实施方式中，突变或野生型序列存在于待插入宿主基因组或靶基因组的外源性 DNA序列中。本领域技术人员已知突变，并且突变包括单碱基对改变或点突变、插入和缺失。在一些实施方式中，单碱基对改变导致错义突变，其产生在转录的mRNA中编码相比野生型序列不同的氨基酸的密码子。在一些实施方式中，单碱基对改变导致无义突变，其编码转录mRNA中的终止密码子。在一些实施方式中，转录RNA中的终止密码子导致翻译自mRNA的蛋白质的早期截短。在一些实施方式中，单碱基对改变导致沉默突变，其不会导致由转录自宿主基因组或靶基因组的mRNA编码的氨基酸的任何改变。在一些实施方式中，沉默突变在内含子中。在一些实施方式中，沉默突变在外显子中并且产生编码与野生型序列相同氨基酸的密码子。在一些实施方式中，沉默突变存在于宿主基因组或靶基因组的启动子、增强子、5’UTR、3’UTR或其他非编码区中。在一些实施方式中，沉默突变导致mRNA转录本的异常剪接。在一些实施方式中，沉默突变破坏RNA剪接供体或剪接受体位点。在一些实施方式中，沉默突变导致异常RNA输出。在一些实施方式中，沉默突变导致mRNA的异常翻译或翻译减少。在一些实施方式中，沉默突变导致RNA的异常或转录减少。在一些实施方式中，突变包括宿主基因组或靶基因组中的插入。在一些实施方式中，插入包含范围为1-4700个碱基对的特定数目的核苷酸，例如1-10、5-20、15-30、 20-50、40-80、50-100、100-1000、500-2000、1000-4700个碱基对。在一些实施方式中，该方法包括由宿主基因组或靶基因组消除至少一个基因或其片段。在一些实施方式中，该方法包括将外源性基因(本文中也定义为感兴趣的外源性DNA序列或基因)或其片段引入宿主基因组或靶基因组。在一些实施方式中，该方法包括用野生型基因或其片段替换宿主基因组或靶基因组中的突变基因或其片段。在一些实施方式中，宿主基因被沉默并被野生型基因或其编码序列替代。在一些实施方式中，该方法改变宿主基因组或靶基因组的至少一个核苷酸，导致基因表达增加。在一些实施方式中，该方法改变宿主基因组或靶基因组的至少一个核苷酸，导致基因表达降低。在一些实施方式中，该方法将外源性启动子引入宿主基因组或靶基因组中，导致基因表达改变。在一些实施方式中，启动子是诱导型启动子。本文所公开的HITI方法具有在非分裂细胞中改变基因组DNA的能力。非分裂细胞包括但不限于：中枢神经系统中的细胞，包括神经元、少突胶质细胞、小胶质细胞和室管膜细胞；感觉传导细胞；自主神经细胞；感觉器官和外周神经支持细胞；视网膜中的细胞，包括光受体、视杆和视锥；肾中的细胞，包括壁细胞、肾小球足细胞、近曲小管刷状缘细胞、亨利氏套细段细胞(loop of henle thin segment cell)、远曲小管细胞、集管细胞；造血谱系中的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、血小板；肝脏中的细胞，包括肝细胞、星状细胞、枯氏细胞和肝内皮细胞；胰腺内分泌细胞，包括α、β、δ、γ和ε细胞；呼吸上皮细胞，包括纤毛细胞、基底细胞、杯状细胞和肺泡细胞，生殖细胞，包括卵原细胞/ 卵母细胞、精子细胞、精母细胞、精原细胞和精子；骨骼的细胞，包括骨细胞、破骨细胞和成骨细胞；心脏的细胞，包括心肌细胞和心脏起搏器细胞；甲状腺中的滤泡细胞；上消化道的细胞，包括浆液细胞、粘液细胞和味蕾；胃中的细胞，包括壁细胞、主细胞、内分泌细胞；内皮细胞、上皮细胞、脂肪细胞、骨髓细胞、内耳细胞、真皮细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞。在一些实施方式中，本文公开的HITI方法提供了对分裂细胞中基因组DNA进行改变的方法，其中所述方法具有比本领域先前公开的方法更高的效率。分裂细胞包括但不限于：造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、肝干细胞、肌卫星细胞、表皮细胞、胶质细胞和星形胶质细胞。在一些实施方式中，通过病毒将用于本文所述HITI 方法的靶向构建体、互补链寡核苷酸和/或编码核酸酶的多核苷酸引入靶细胞或宿主细胞。在一些实施方式中，病毒感染靶细胞并表达靶向构建体、互补链寡核苷酸和核酸酶，其允许靶向构建体的外源性DNA整合到宿主基因组中。在一些实施方式中，该病毒包含仙台病毒、逆转录病毒、慢病毒、杆状病毒、腺病毒或腺相关病毒。在一些实施方式中，该病毒是假型病毒。在一些实施方式中，通过非病毒基因递送方法将用于本文所述HITI方法的靶向构建体、互补链寡核苷酸和/或编码核酸酶的多核苷酸引入靶细胞或宿主细胞。在一些实施方式中，非病毒基因递送方法将遗传物质(包括DNA、RNA和蛋白质)递送到靶细胞中并表达靶向构建体、互补链寡核苷酸和核酸酶，其允许靶向构建体的外源性DNA整合到宿主基因组中。在一些实施方式中，非病毒方法包括用于DNA mRNA或蛋白质或电穿孔的转染试剂(包括纳米颗粒)。

本文还提供了用于治疗疾病诸如遗传疾病的方法和组合物。遗传疾病是由遗传性DNA中的突变所导致的疾病。在一些实施方式中，遗传疾病由基因组 DNA中的突变所致。本领域技术人员已知遗传突变，并且突变包括单碱基对改变或点突变、插入和缺失。在一些实施方式中，本文提供的方法包括治疗有此需要的对照中的遗传疾病的方法，其中所述遗传疾病源自相较于野生型基因而言具有至少一个改变的核苷酸的突变基因，其中所述方法包括令对象的至少一个细胞与包含靶向构建体的组合物接触，所述靶向构建体包含与野生型基因和靶向序列同源的DNA序列、与靶向序列同源的互补链寡核苷酸和核酸酶，其中靶向序列被核酸酶识别，从而使突变基因或其片段被野生型基因或其片段替换。通过本文所公开的方法治疗的遗传疾病包括但不限于：溶酶体储存疾病，包括黏多醣贮积症(MPSI、MPSII、MPSIIIA、MPSIIIB、MPSIIIC、MPSIVA、 MPSIVB、MPSVII)、鞘脂沉积病(法布瑞氏症、戈谢病、尼曼-匹克氏病、 GM1神经节苷脂沉积症)，脂褐质沉积症(巴顿病和其他)和粘脂贮积症；其中肝脏可作为产生和分泌治疗性蛋白质的工厂的其他疾病，如糖尿病，腺苷酸琥珀酸缺乏，血友病A和B，ALA丙氨酸脱水酶缺乏，肾上腺脑白质营养不良，常染色体显性。可在本发明中治疗的视网膜疾病是例如色素性视网膜炎(由于 RHO、AIPL1、IMPDH1、RDS、PDE6B或其它基因中的突变)、视锥-视杆营养不良(CRX)、Stargardt病(ELOVL4)、希佩尔林道征和视网膜母细胞瘤。

本文公开的治疗遗传疾病的方法采用外源性DNA序列，所述外源性DNA 序列包含对应突变基因的DNA序列的至少部分野生型DNA序列，使得在所述方法中，突变DNA序列被野生型DNA序列替换。

本文所用术语"一个"、"一种"或"该/所述"不仅包括一个成员的方面，而且还包括一个以上成员的方面。例如，除非上下文另外清楚地说明，否则，单数形式的"一个"、"一种"或"该/所述"包括复数指代。因此，例如，提到“一个细胞”则包括多个/种这样的细胞，且提到“该/所述试剂”则包括本领域技术人员已知的一个/种或多个/种试剂等等。术语“基因组编辑”指一类遗传工程改造，其中使用一种或多种核酸酶和/或切口酶将DNA插入、替代或由靶DNA(例如细胞的基因组)中移除。核酸酶在基因组中所需位置产生特定的双链断裂(dsb)，并利用细胞的内源性机制通过非同源末端连接(NHEJ)修复诱导的断裂。切口酶在基因组中所需位置产生特定的单链断裂。在一个非限制性示例中，两个切口酶可以用于在靶DNA的相对链上产生两个单链断裂，从而生成钝端或粘性末端。可将任何合适的核酸酶引入细胞中以诱导靶DNA序列的基因组编辑，包括但不限于：CRISPR相关蛋白(Cas)核酸酶、锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸、其它内切或外切核酸酶、其变体、其片段，及其组合。术语“非同源末端连接”或“NHEJ”指修复双链DNA 断裂的途径，其中断裂末端直接连接，不需要同源模板。术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”、“核苷酸”和“核酸分子”可以互换使用，并指单链、双链或多链形式的脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)及其聚合物。该术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA，基因组DNA，cDNA，DNA-RNA 杂合体或包含嘌呤和/或嘧啶碱基或其它天然化学修饰、生化修饰的、非天然的、合成的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。例如，其还包括修饰，例如通过甲基化和/或通过加帽，以及未修饰形式的多核苷酸。更具体地，术语“多核苷酸”，“寡核苷酸”，“核酸”和“核酸分子”包括多脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)，多核糖核苷酸(含有D-核糖)，任何其他类型的多核苷酸，其是嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷，以及含有非核苷酸骨架的其他聚合物，例如聚酰胺(例如，肽核酸(PNA))和多吗啉代(可从Anti-Virals，Inc.Corvallis,Oreg商购获得，称为Neugene)聚合物，和其他合成的序列特异性核酸聚合物，条件是该聚合物包含核碱基的构型允许碱基配对和碱基堆叠，例如DNA和RNA中发现的那样。在一些实施方式中，核酸可包含DNA、RNA及其类似物的混合物。除非特别限定，否则该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参比核酸相似的结合特性，并以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另外说明，一特定核酸序列还隐含包括其保守性修饰变体(例如简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、单核苷酸多态性(SNP)和互补序列，以及明示序列。具体说，可通过产生一个或多个选定(或所有)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来获得简并密码子取代。术语核酸可与基因、cDNA和基因编码的mRNA互换使用。术语“基因”或“编码多肽的核苷酸序列”指与产生多肽链有关的DNA片段。DNA片段可以包括涉及基因产物转录 /翻译以及调节转录/翻译的编码区(前导和尾)之前和之后的区域，以及单个编码片段(外显子)之间的插入序列(内含子)。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以表示氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然产生氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然产生的氨基酸聚合物和非天然产生的氨基酸聚合物。本文中，这些术语涵盖任意长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中氨基酸残基通过共价肽键相连。“重组表达载体”是重组或合成产生的核酸构建体，具有一系列允许特定多核苷酸序列在宿主细胞中转录的特定核酸元件。表达载体可以是质粒，病毒基因组或核酸片段的一部分。通常，表达载体包括待转录的多核苷酸，其操作性地连接至启动子。“可操作连接”在本文中指两个或多个遗传元件(诸如多核苷酸编码序列和启动子)置于允许元件(诸如引导编码序列转录的启动子)的适当生物功能的相对位置。本文所用术语“启动子”指引导核酸转录的核酸控制序列的阵列。本文中，启动子包括转录起始位点附近的必需核酸序列，例如聚合酶 II型启动子的TATA元件。启动子还任选地包括远端增强子或阻抑物元件，其可位于距转录起始位点多达几千个碱基对处。可能存在于表达载体中的其它元件包括增强转录的元件(例如增强子)和终止转录的元件(例如终止子)，以及赋予产生自表达载体的重组蛋白特定结合亲和力或抗原性的元件。术语“单核苷酸多态性”或“SNP”指多核苷酸的单核苷酸变化，包括在等位基因内。这可以包括用一个核苷酸替换另一个核苷酸，以及删除或插入单个核苷酸。最典型地， SNP是双等位基因标志物，尽管三等位基因和四等位基因标志物也可以存在。作为非限制性示例，包含SNP A\C的核酸分子可在多晶位置包括C或A。术语“对象”、“患者”和“个体”在本文中可互换使用以包括人或动物。例如，动物对象可以是哺乳动物、灵长类动物(例如猴子)、家畜动物(例如马、牛、羊、猪或山羊)、伴侣动物(例如狗、猫)、实验室试验动物(例如老鼠、大鼠、豚鼠、鸟)、具有兽医意义的动物或具有经济意义的动物。如本文所用，术语“给予/给药/施用”包括向对象的口服给予，局部接触，作为栓剂的给予，静脉内，腹腔内，肌肉内，病灶内，鞘内，鼻内或皮下给予。给予通过任何途径，包括肠胃外和经粘膜的(例如，颊、舌下、腭、牙龈、鼻、阴道、直肠或经皮)。肠胃给予药包括，例如，静脉内，肌肉内，小动脉内，皮内，皮下，腹膜内，心室内和颅内。递送的其他模式包括但不限于，利用脂质体制剂，静脉输注，透皮贴剂等。术语“治疗/处理”指用于获得有益或期望结果的方法，包括但不限于治疗益处和/或预防益处。述及治疗益处意指在治疗/处理中的一种或多种疾病、状况或症状的任何治疗相关的改善或效果。为了预防益处，可以将组合物给予具有发育特定疾病、病症或症状的风险的对象，或者报告疾病的一种或多种生理症状的对象，即使疾病、病症、或症状可能尚未表现出来。术语“有效量”或“足够量”指足以产生有益或期望结果的试剂(例如，DNA核酸酶等)的量。治疗有效量可以根据下述一种或多种情况而变化：正在治疗/处理的患者和疾病或病症，对象的体重和年龄，疾病或病症的严重程度，给药方式等，这些都可由本领域普通技术人员容易地确定。具体量可以根据下述一种或多种情况而变化：所选择的特定试剂，靶细胞类型，对象中靶细胞的位置，将遵循的给药方案，是否与其他化合物联用，给予的时间和其所携带的物理递送系统。

术语“药学上可接受的运载体”指有助于向细胞、生物体或对象给予试剂(例如DNA核酸酶等)的物质。“药学上可接受的运载体”指这样的运载体或赋形剂，其可以包含于组合物或制剂中并且不会对患者造成显著的不良毒理作用。药学上可接受的运载体的非限制性示例包括水、NaCl、生理盐水、乳酸林格溶液、普通蔗糖、普通葡萄糖、粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和着色剂等。本领域技术人员应理解，其它药用运载体可用于本发明中。

关于参考数值的术语“约”可以包括从该值加上或减去10％的值的范围。例如，量“约10”包括从9-11的量，包括参考数字9、10和11。与参考数值相关的术语“约”还可以包括由该值加或减10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％， 2％或1％的值的范围。

如本文所用，术语“衍生物”还指更长或更短的多核苷酸/蛋白质和/或与本文所公开的序列具有例如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％的相同性百分比，更优选具有至少99％。在本发明中，至少“70％相同性”意指相同性可以是与提及的序列至少70％、或75％、或80％、或85％或90％或95％或100％序列相同性。这应用于所有提到的％相同性。优选的，％相同性涉及提到序列的全长。本发明的衍生物还包括多肽或多核苷酸的“功能性突变体”，其是可通过使其序列中一个或多个氨基酸或核苷酸突变而产生并维持其活性的多肽或多核苷酸。在本发明中，“功能性”意指，例如，“保持其活性”。同样在本发明的范围内的是这样的多核苷酸，其具有与本文例示的多核苷酸相同的核苷酸序列，除了多核苷酸序列内的核苷酸取代、添加或删除之外，只要这些变体多核苷酸保持与本文具体例示的多核苷酸基本相同的相关功能活性(例如，它们编码具有与例示的多核苷酸编码的蛋白质相同的氨基酸序列或相同功能活性的蛋白质)。因此，本文所公开的多核苷酸应理解为包括特定例示的序列的突变体、衍生、变体和片段，如上文所讨论。本发明还考虑与本发明的多核苷酸序列具有足够同源性的序列的那些多核苷酸分子，从而允许在标准严格条件和标准方法下与该序列杂交(Maniatis,T. 等,1982)。

内部核糖体进入位点(IRES)元件是顺式作用的RNA区域，其使用独立于帽的机制促进翻译的内部启动。IRES元件的平均尺寸为500bp。通常，已经报道了维持活性的小型人工IRES元件。例如，[38]描述了2个50nt长的IRES 元件：

AggTggTAgCCgCAAACATAgTTCAATACAAACTTgCTgTCTCggCgg (SEQ ID NO:23)

和

TgACAAACTgTACATgCCgTTAACTgTAATTTTgCgTgATTTTTTTgTAg (SEQ ID NO:24)

Kozak序列是这样的基序，其在大多数RNA转录本中起翻译起始位点作用，核糖体将其识别为翻译起始位点，mRNA分子由此编码蛋白质。在体内，该位点在不同的mRNA上通常不完全匹配，并且由给定mRNA合成的蛋白质的量取决于Kozak序列的强度。该序列中的一些核苷酸比其他核苷酸更重要： AUG是最重要的，因为它是编码蛋白质N末端甲硫氨酸氨基酸的实际起始密码子(很少的情况下，GUG作为起始密码子，但是甲硫氨酸仍然是第一个氨基酸，因为它是起始复合物中与mRNA结合的met-tRNA)。“AUG”的A核苷酸被称为数字1。对于“强”共有，相对于数字1核苷酸的位置+4(即G在共有中) 和-3(即A或G在共有中)处的核苷酸必须都与共有匹配(没有数字0位置)。“充分”共有只有这些位点中的1个，而“弱”共有都没有。-1和-2处的cc不是保守的，但有助于整体强度。

2A肽是18-22aa的长肽，其可以诱导细胞中重组蛋白的切割。2A肽来源于病毒基因组中的2A区。

2A肽家族的四个成员是生命科学研究中常用的多肽。它们是P2A、E2A、 F2A和T2A。F2A源自口蹄疫病毒18；E2A源自马鼻炎病毒A；P2A源自猪捷申病毒(Porcineteschovirus)-1 2A；T2A源自明脉扁刺蛾病毒(thosea asigna virus)2。

终止密码子是信使RNA(mRNA)分子中的三核苷酸序列，其发出停止蛋白质合成的信号。遗传密码中有三个终止密码子：TAG、TAA、TGA。在本发明的意义内，为了在三个可能的框中插入终止密码子，在各个框中插入两个终止密码子，例如，TAATAAATAATAAATAATAA(SEQID NO:1)或其排列或组。

实施例

质粒构建：

用于AAV载体产生的质粒来自pAAV2.1[36]质粒，该质粒含有AAV血清型2的ITR。具体地，我使用了我们小组先前的出版物中生成的pAAV2.1质粒。

kozak-DsRed和IRES-DsRed供体DNA载体这样生成：通过PCR扩增 Discosoma(香菇珊瑚)红色荧光蛋白(DsRed)CDS(675bp)和牛生长激素多聚腺苷酸化信号(bGHpA)，其来自我们组先前的出版物中生成的质粒[37]，添加kozak或IRES[38]序列，以及5'和3'gRNA靶位点，作为PCR引物突出端。 PCR片段在PCR Blunt II-TOPO(英杰公司，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德) 中亚克隆，然后使用AflII限制性位点通过输注(Infusion)(宝生物公司(Takara)，日本草津)在pAAV2.1质粒中克隆。

mRho-gRNA、pRHO-gRNA、mAlb-gRNA(参见表2)使用Benchling gRNA 设计工具(www.benchling.com)设计，选择具有靶向各基因第一外显子的较高预测中靶和脱靶评分的gRNA。然后生成gRNA，作为正向和反向寡核苷酸(表 3)，退火并在PX458(pCbh-SpCas9-2A-GFP)中克隆，如Zhang的实验室所述[35]。PCR扩增gRNA表达盒(包括上文所述的加扰gRNA)并在PCR Blunt II-TOPO(英杰公司，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)中亚克隆，然后使用NheI 限制性位点通过In-Fusion克隆(宝生物公司，日本草津)在pAAV2.1质粒中克隆。

表2：用于靶向Cas9至不同物种中视紫红质和白蛋白基因座的gRNA序列

pAAV2.1-IRBP-SpCas9-spA质粒这样生成：通过使用HindIII和AgeI限制性位点和常规连接将间光受体类视黄醇结合蛋白(IRBP)启动子克隆到商购可及的pAAV-pMecp2-SpCas9-spA(艾德基因公司(Addgene)PX551[39])。 pAAV2.1-IRBP-VQRCas9HF1-SpA质粒由Daniela Benati和Clarissa Patrizi(摩德纳和埃米利亚地区大学(University ofModena and Regio Emilia))按照类似的连接策略生成。

pAAV2.1-HLP-SpCas9-spA质粒联合来自Auricchio组的Hristiana Lyubenova这样产生：通过使用AflII和AgeI限制性位点和融合克隆(宝生物公司，日本草津)用杂交肝启动子(HLP)替换先前引物中的IRBP启动子。

AAV载体产生与表征

AAV载体这样产生：由TIGEM-AAV载体核心通过三重转染HEK293细胞，然后进行两轮CsCl

HEK293细胞的培养与转染

HEK293细胞保存在含有10％胎牛血清(FBS)和2mM L-谷氨酰胺(吉布可公司(Gibco)，赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)的DMEM中。将细胞接种于6孔板(1*10

细胞荧光分析

接种于6孔板中的HEK293细胞用PBS洗涤一次，用胰蛋白酶0.05％EDTA (赛默飞世尔科学公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)解离，用PBS洗涤两次，然后在含有PBS、5％FBS和2.5mM EDTA的分选溶液中重悬。在配备有 BD-FACSDiva软件(BD生物科学公司(BDBiosciences)，美国加利福尼亚州圣何塞)的BD-FACS ARIA III(BD生物科学公司)上使用针对EGFP和DsRed 的适当激发和检测设置对细胞进行分析。在未转染细胞上设置荧光检测阈值，并分析至少10,000细胞/样品。对最少50,000个GFP+或GFP+/DsRed+细胞/样品进行分选并用于DNA提取。

动物模型

小鼠饲喂于TIGEM动物之家(意大利波佐利)，并保持于12小时光/暗循环下。C57BL/6J小鼠购自Envigo意大利SRL(意大利乌迪内)。P347S小鼠由Enrico Surace馈赠。将P347S转基因小鼠通过与自身杂交保持F0，然后与C57BL/6小鼠杂交以生成实验小鼠。

Rho-P23H敲入[15](称为P23H)小鼠从杰克逊实验室公司(The JacksonLaboratory)引入。小鼠通过杂交纯合雌性和雄性来维持。P23H小鼠在小鼠Rho 基因的第1外显子中被敲入P23H突变，并一起插入Neomicin(新霉素)盒。通过将纯合P23H小鼠与C57BL/6小鼠杂交获得实验杂合动物。小鼠基因型通过对基因组DNA(提取自小鼠指骨尖)进行PCR分析得到证实。纯合小鼠具有 530bp的PCR产物，而杂合小鼠具有530bp和399bp的产物。野生型小鼠只有 399bp的PCR产物。用于PCR扩增的引物如下：

正向：5’-TGGAAGGTCAATGAGGCTCT-3’(SEQ ID NO:34)

反向：5’-GACCCCACAGAGACAAGCTC-3(SEQ ID NO:35)

MPSVI小鼠被敲除ARSB基因，并且是表达截短的人ARSB的转基因动物，其产生对治疗性ARSB蛋白的耐受性。这概括了MPSVI患者的免疫状态。将MPSVI小鼠保持为杂合，并杂交产生纯合子敲除的实验性小鼠。小鼠基因型通过对基因组DNA(提取自小鼠指骨尖)进行PCR分析得到证实。敲除小鼠具有1400bp的PCR产物，而杂合小鼠具有1400bp和另一234bp的条带。野生型小鼠仅有234bp的条带。用于PCR扩增的引物如下：

正向：5’-TGGGCAGACTAGGTCTGG-3’(SEQ ID NO:36)

反向：5’-TGTCTTCCACATGTTGAAGC-3’(SEQ ID NO:37)

本研究中使用的大型白色母猪(Azienda Agricola Pasotti，意大利伊莫拉) 在意大利国家养猪者协会的LWHerd手册中登记为纯种猪，并饲养在 A.O.R.N.AntonioCardarelli生物技术中心(Centro di Biotecnologie A.O.R.N. Antonio Cardarelli)(意大利那不勒斯)，并保持在12小时的光/暗循环下。小鼠和猪中视网膜下注射AAV载体

该研究是根据视觉和眼科研究协会关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明以及意大利卫生部关于动物程序的规定(卫生部授权号147/2015-PR)进行。手术在全身麻醉下进行，并且所有的努力都是为了尽量减少动物的痛苦。

小鼠(1-4周龄)通过腹腔注2mL/100g体重的氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉，然后通过经巩膜经脉络膜途径视网膜下递送AAV2/8载体，如Liang等所述[42]。眼睛注射1uL的载体溶液。AAV2/8剂量(GC/眼)在各载体/眼为1*10

视网膜下递送AAV2/8载体至猪视网膜如先前所述进行[43]。眼(n＝3)注射100uL的AAV2/8载体溶液的两个滤泡。AAV2/8剂量在各载体/滤泡为2*10

通过颞血管的新生静脉内注射

p1-p2新生小鼠按照Gombash-Lampe等公开的方案注射[44]。.总体积为 35uL。注射的剂量中各载体为4*10^13GC/Kg，总剂量为8*10*^13GC/Kg。

通过眶后丛的静脉内注射

4周龄C57BL/6小鼠经眶后丛注射，总体积为360uL，各载体的注射剂量为1.3*10

电生理学记录

为了视网膜电图分析，P347S或P23H小鼠经历暗适应3小时。将小鼠麻醉并放置在微弱红光下的立体定向装置中。用0.5％托吡卡胺液滴(Visufarma，意大利罗马)扩瞳，并将体温保持在37.5度。

闪光是由Ganzfeld激发器(CSO，Costruzione Strumenti Oftalmici，意大利佛罗伦萨)产生的。电生理信号通过插入下眼睑下与角膜接触的金电极记录。各只眼睛中的电极以在相应额叶水平皮下插入的针状电极为参照。不同电极连接到双通道放大器上。在完成暗适应条件下获得的反应(暗视)后，继续进行记录，目的是分辨介导光反应的视锥通路(明视)。为了使噪声最小化，对各个发光步骤取光诱发的不同反应的平均值。在黑暗条件(暗视)下测量视杆和视锥的最大暗视反应，其中两个闪光为0.7Hz，光照强度为20cd s/m2；在光照条件下分离明视视锥反应，其中连续背景白光为50cd s/m2，10个闪光为0.7 Hz，光照强度为20cd s/m2。

血清中ARSB酶活性评估的试验

血清ARSB活性通过基于使用特异性抗hARSB多克隆抗体(Covalab)的免疫捕获试验进行测量，如前所述[26]。简言之，96孔板(Nunclon)涂覆有 5μg/mL中0.1M NaHCO

尿中GAG累积的定量分析

将尿样在水中1:50稀释以测定GAG含量。用于GAG试验，如前所述[45]。 GAG浓度根据硫酸皮肤素标准曲线(西格玛奥里奇公司)确定。组织GAG表示成每毫克蛋白质的GAG微克。将尿GAG标准化至肌酸酐含量，其用肌酸酐分析试剂盒(Quidel，美国圣地亚哥)测量。因此，尿GAG的单位为每微摩尔肌酸酐中GAG微克数。尿GAG以AF对照小鼠的百分比报告。在观察的最后一个时间点，对各组的尿GAG水平取平均值。

血清白蛋白定量

按照生产商的说明，用小鼠白蛋白ELISA试剂盒(Abcam公司，英国剑桥)分析血清样品。将样品稀释30000倍，并根据生物素化白蛋白结合板的竞争确定白蛋白。血清白蛋白表示为每毫升血清中白蛋白的毫克数。

视网膜剥离

为了分离视网膜的颞区和鼻区，在处死小鼠后，烧灼眼的颞区。眼球采集后，在徕卡M205FA立体显微镜(徕卡公司，德国威茨拉)下解剖眼，以确认颞区的GFP荧光。颞区和鼻区在两个不同的管中解剖。

组织学和光以及荧光显微镜检

为了体外评估HITI后的DsRed表达，将以1*10

为了评估组织切片中HITI后视网膜中的DsRed表达，C57BL/6J小鼠和大白猪[43]经视网膜下注射IRBP-Cas9和供体DNA AAV载体。1个月后处死小鼠和猪，并在4％多聚甲醛中将眼固定过夜，并用30％蔗糖渗透过夜；然后解剖角膜和晶状体，将眼杯(eyecup)埋入最佳切割温度化合物(O.C.T.基质； Kaltek，意大利帕多瓦)。10微米厚的连续视网膜冷冻切片沿着水平经线切割，逐步分布在载玻片上，并装载在具有DAPI的Vectashield(载体实验室公司b，英国彼得伯勒)上。然后，在共焦LSM-700显微镜(卡尔蔡司公司，德国奥伯科亨)下使用适当的激发和检测设置分析冷冻切片。为了评估AAV给药后小鼠视网膜冷冻切片中的HITI效率，选择并在40倍放大下获得两个切片/眼的最高转导面积，然后使用ImageJ软件进行分析(http://rsbweb.nih.gov/ij/)。各图像经计数最小值为500PR(通过DAPI染色鉴定)。根据在分析的切片的z-叠层中观察到的其形状以及DsRed+外段的存在，明确识别与DsRed表达信号相容的PR。

为了评价HITI处理后的视网膜外核层厚度，P23H小鼠视网膜下注射 IRBP-Cas9和供体DNA AAV载体。三个月后，处死小鼠并将眼固定在戴维森固定液(Davidson’sfixative)(去离子水、10％醋酸、％20％福尔马林、35％乙醇)中，在系列乙醇中脱水过夜，然后包埋在石蜡块中。沿水平经线切10微米厚的显微切片，逐步分布在载玻片上并用苏木精-伊红染色。然后，切片在显微镜(徕卡微系统股份有限公司(Leica MicrosystemsGmbH)；DM5000)下分析切片并在20倍放大下成像。对于各只眼睛，使用来自眼中央区域中切片的颞部注入侧的一个图像进行分析。使用ImageJ软件的“手绘线”工具，在各幅图像中进行三次ONL厚度测量，对基因型/处理组掩码处理(masked)。

为了评价HITI后肝脏中的DsRed表达，C57BL/6J小鼠在p2或4周龄注射，并在注射后1个月通过心脏灌注处死。收获肝脏并在莱卡立体显微镜(莱卡公司，德国韦茨拉尔)上以25倍放大倍数拍摄。然后，解剖各肝叶的一小片，并将所有的片在4％多聚甲醛中固定过夜，并用15％蔗糖浸润一天和30％蔗糖浸润过夜，然后包埋在O.C.T.基质(Kaltek，意大利帕多瓦)，用于冷冻切片。切割5微米厚的视网膜冷冻切片，并分布在载玻片上，并装载在具有DAPI的 Vectashield(载体实验室公司，英国彼得伯勒)上。然后，在共焦LSM-700显微镜(卡尔蔡司公司，德国奥伯科亨)下使用适当的激发和检测设置分析冷冻切片。为了评估小鼠肝脏冷冻切片中的HITI效率，将各肝放大20倍后获得3 幅图像，然后使用ImageJ软件进行分析(http://rsbweb.nih.gov/ij/)。各图像最少计数850个肝细胞(通过DAPI核染色鉴定)。根据肝细胞的形态可以明确地识别出具有与DsRed表达相容信号的肝细胞。

DNA切割分析

分别在可商购的裂解冲液(GeneArt

用50-200ng DNA对包含Cas9靶位点(RHO的第一外显子)的区域进行 PCR扩增，所述Cas9靶位点分别来自pCMV-mRho-P23H质粒或小鼠基因组。

表4显示了所用引物：

表4：用于生成用于Surveyor试验并对插入缺失进行测序的PCR片段的引物。

P347S-插入缺失引物产生444bp的PCR产物。pCMV-mRho-插入缺失引物产生634bp的PCR产物。mRho-HITI-插入缺失引物产生426bp的PCR产物。 pRHO-插入缺失引物产生341bp的PCR产物。mAlb-HITI-插入缺失引物产生 592bp的PCR产物。

1-3uL的PCR产物(根据PCR效率)用于Surveyor试验，遵循GeneArt

mRho-HITI-插入缺失、pRHO-插入缺失和mAlb-HITI-插入缺失PCR产物也用于Sanger测序。然后，将序列用于插入缺失频率的TIDE软件 (https://tide.deskgen.com/)分析。

HITI连接表征

将提取自视网膜或肝脏组织的DNA用于HITI连接的PCR扩增。扩增5' 和3'连接的整合。对于5'连接，我使用了识别mRho或mAlb基因第一外显子上游区域的正向引物和识别DsRed编码序列的反向引物。对于3'连接，我们设计了识别供体DNA的bGH多聚A序列的正向引物，以及识别切割位点的mRho 第一外显子或mAlb第二外显子的反向引物。表5显示了使用的引物。

表5：用于HITI连接扩增的引物

5’连接引物产生663bp的PCR产物。3’连接引物产生455bp的PCR产物。将两种PCR产物克隆到PCR Blunt II-TOPO(英杰公司，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)中，并对单个克隆进行测序以确认PCR产物的特性，然后进行NGS 分析。

对于文库制备，将来自HITI连接PCR产物的总共47.5ng DNA用作合成 DNA文库的输入，所述DNA文库的合成使用SMART Seq v4超低输入RNA 测序试剂盒(美国宝生物生物公司(Takara Bio USA)，美国加利福尼亚州山景城)。遵循生产商建议的方案并稍作改动。按照建议的方案，使用NEXTERA XT DNA文库制备试剂盒(亿明达公司(Illumina)，美国加利福尼亚州圣地亚哥)将使用SMART Seq v4试剂盒生成的75pg cDNA用于文库制备。文库的质量通过在DNA高灵敏度芯片(安捷伦科技公司(Agilent Technologies)，美国加利福尼亚州圣克拉拉)上使用生物分析仪DNA分析评估，并使用Qubit 4 荧光计(赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)进行定量。使用 NextSeq 500/550Mid-Output v2试剂盒在150+150配对末端运行中对样品进行测序。数据保存在GEO:GSE10717中。Illumina碱基识别的原始数据通过 bcl2fastq软件(版本v2.20.0.422，亿明达公司，美国圣地亚哥San Diego，USA) 转换为fastq文件。

使用Cutadapt软件对序列读取进行修剪，以将读出长度从600bp减少到350bp。通过预测藉由感兴趣的基因座中的Cas9介导的NHEJ介导的整合来构建定制的参照序列。将切割的供体DNA序列插入gRNA序列的-3和-4碱基之间。使用BWASW软件将所有测序读出与其相应的参照序列对齐，并相对于切割位点对各个位置处的插入缺失进行定量。使用BWA-SW软件(MIT，美国波士顿)进行比对。用deepSNV[46]软件包估计比对的bam文件中的插入缺失总数和特异性核苷酸计数。通过ad-hoc R算法由BAM CIGAR串获得插入缺失的长度。插入缺失长度的图形示例中不包括频率低于0.5％读出的插入缺失。

光受体中通过HITI的显性色素性视网膜炎基因疗法

历史上，大多数研究都集中在使用AAV提供在隐性条件下因功能缺失所致突变基因的正确拷贝。然而，在因RHO突变(RP4)所致的adRP中，需要敲除RHO突变等位基因，而不是添加正确的RHO拷贝才能达到治疗效果[47， 48]。已经使用不同的策略来以等位基因非依赖性或等位基因特异性的方式敲低突变的RHO。等位基因非依赖性策略包括使用与AAV介导的RHO表达偶联的短发夹RNA的RHO沉默[49-51]和使用非活性转录因子的RHO沉默[21]。等位基因特异性策略包括等位基因特异性沉默和等位基因特异性基因组编辑。使用CRISPR/Cas9(Cas9)进行基因组编辑是近年来出现的一种多功能和有效的用于治疗显性IRD的策略[4，48]。因为PR是终末分化细胞，所以切割后HDR 纠正的效率很低[10，52]。另一方面，NHEJ是PR中的主要DNA修复机制。所得插入缺失通常用于敲除靶基因[3]。这已被用来诱导色素性视网膜炎的各种模型中的等位基因特异性RHO敲除。两个不同的组分别靶向mRho和RHO基因座中普遍存在的P23H突变。在这两种情况下，小鼠模型视网膜中的等位基因特异性基因组编辑实现了RP4的部分纠正[23，53]。类似地，Bakondi等靶向转基因大鼠模型中mRho中的Ser334 Ter突变[22]。Yu等靶向NRL基因座，并观察了小鼠中视网膜变性的预防[54]。Burnright等也在体外使用这种方法来生成经基因纠正的诱导型多能干细胞，这种细胞可能用于视网膜疗法[55]。然而，该方法受限于GOF等位基因处gRNA/PAM组合的可用性，并且是突变特异性的，由于RP4的遗传异质性限制了其临床适用性[19，48]。

考虑到等位基因特异性敲除用于治疗因获得功能性突变所致疾病(例如显性色素性视网膜炎)的局限性，本发明人旨在开发等位基因非依赖性方法，旨在沉默内源性等位基因并用功能性编码序列代替它们。当靶向非分裂细胞时，这将产生特别有利的结果。发明人们决定在光受体中实现基因纠正，作为该策略的概念证明。因为预期HDR在分化的神经元中非常低效，所以发明人开发了HITI系统以用WT视紫红质代替突变型视紫红质。为此，发明人设计了针对同时识别野生型和WT等位基因的mRHO第1外显子的gRNA。然后，发明人生成了这样的供体DNA序列，其在3个可能的框架中携带终止密码子，翻译起始序列(TIS)，报告基因dsRED和BgH多聚A。该供体DNA序列在5' 和3'处侧接针对mRHO的gRNA识别但反向的(例如反向靶位点)相同gRNA 靶位点(图1)。这允许定向整合，因为在供体DNA以相反方向整合的情况下， Cas9将能够再次识别其靶位点并将其切割。在以正确方向整合后，Cas9将不再能够切割靶位点。

本发明人决定在小鼠模型体内测试kozak和IRES序列。为了在体外测试 mRho基因座中的HITI，本发明的发明人生成了编码具有不同TIS的两种形式的供体DNA的质粒：一种携带kozak序列，而另一种携带小的合成的50bp IRES。用Rho特异性gRNA和不识别小鼠基因组中任何序列的加扰gRNA克隆各个供体DNA。该质粒与CBh-SpCas9-2A-EGFP质粒以及在CMV启动子控制下编码mRhoP23H的另一质粒一起转染(图2A)。该CMV-mRhoP23H质粒用作Cas9切割和供体DNA整合的模板。

本发明人所预期的是，在HITI发生后，由于CMV的促进作用，DsRed能够被表达。转染后48小时，荧光显微镜显示仅在用gRNA处理的细胞中大量存在DsRed+细胞，而在用加扰处理的细胞中没有DsRed+细胞(图2B)。

因为Cas9转染的细胞表达EGFP+，所以本发明人使用FACS分选来确定 DsRed+和EGFP+细胞之间的比率，从而评估kozak或IRES是否实现了较高的 DsRed表达或较高的整合效率(图2C)。kozak和IRES之间未发现显著差异，虽然kozak的表现似乎略好(47％比34％)(图2D)。同样，FACS显示在用加扰处理的患者中不存在DsRed+细胞，这证实了DsRed阳性依赖于gRNA存在。

为了证实DsRed表达是模板CMV-RhoP23H质粒中Cas9切割的结果，本发明人由EGFP+分选的细胞中提取DNA，并对gRNA靶位点周围的质粒区域进行PCR扩增。Surveyor分析显示，仅在用gRNA处理的细胞中存在插入缺失 (图3)，这与DsRed表达相关联。

本发明人还生成了携带hRHO-T2A-dsRED的供体DNA(图11A)。该供体DNA应当能够用人视紫红质的拷贝替换mRho基因，并且在纠正的光受体中产生dsRED的表达。本发明人在体外测试了这种供体DNA，将其与原始 dsRED供体DNA进行比较，从而确定HITI的效率是否随插入物大小的不同而变化。即使hRHO-T2A-dsRED供体DNA是dsRED供体长度的两倍(2.4kB而不是1.2kB)，荧光成像(图11B)和FACS分选(图11C)显示，两个插入物的整合效率完全相同(67％)，并且当使用加扰而非mRho特异性gRNA时，同样没有整合。

为了评估HITI在小鼠光受体中是否可行，本发明人生成了携带具有kozak 或IRES序列的供体DNA的AAV2/8载体，以及mRho特异性gRNA或加扰 gRNA的gRNA表达盒(图4A)。将这些载体与已描述的IRBP-SpCas9-sh多聚A载体一起注射。

在4周龄C57BL/6小鼠中进行各载体2.5*10

光受体中HITI的表征：

为了更好地理解HITI在光受体中可以如何精确，本发明人设计了两个引物对来扩增整合的5'和3'连接(图5A)。两个引物对只能在提取自gRNA处理的视网膜的DNA中扩增出预期大小的PCR产物，而不能在加扰处理的视网膜中扩增出预期大小的PCR产物(图5B)。

这些PCR片段随后用于NGS分析。获得各连接150万-300万的读出。分析NGS读出显示，在5'连接中，特别是在Cas9切割位点(位置1)中出现插入(5％)和缺失(15％)较低(图6)。最常见的缺失的范围为1-9bp。有趣的是，本发明人观察到40bp和48bp序列的两种常见插入，本发明人将其鉴定为部分AAV ITR序列(图6)。不同的是，3'连接呈现出令人惊讶丰富的1bp插入(71％)，其中主要是胞嘧啶或胸腺嘧啶，一些2bp插入，并且几乎不存在缺失(图6)。

此外，将提取自小鼠视网膜的DNA用于潜在脱靶HITI整合的NGS分析。将靶向DsRed的探针用于富集包括供体DNA在内的基因组序列。令人惊讶的是，即使在RHO基因座中，也没有发现含有完整供体DNA的基因组序列。这可以解释为读出的数量少，并且观察到的整合效率低，以及无法仅选择DsRed+ 光受体进行DNA提取，从而稀释了提取的总DNA中编辑的基因组。

为了在更好地再现人眼解剖结构的动物模型中表征HITI效率，本发明人决定使用猪眼(一种相关的临床前模型)。为此，本发明人设计了对猪视紫红质(pRho)基因第一外显子具有特异性的gRNA，和与先前实验中使用的DNA 相同但侧接pRho靶位点的供体DNA。藉由这些，本发明人生成了图14中所示的相同类型的载体。在3月龄大白猪进行视网膜下注射各载体的2.5×10

为了确定DsRed表达是否与pRho基因中Cas9介导的DSBs相关联，本发明人由猪视网膜和RPE提取基因组DNA并进行Surveyor试验。本发明人观察到插入缺失仅存在于gRNA处理的视网膜中，而不存在于加扰处理的视网膜中。正如本发明人所期望的，插入缺失仅存在于视网膜中，而在RPE中不存在，这与IRBP启动子对Cas9的光受体特异性表达一致(图8A)。为了更好地表征切割的效率，发明人们使用了TIDE分析，对此，将用于Surveyor分析的相同的PCR片段用于SANGER测序。将所得色谱图被用作TIDE软件的输入。将 RPE样品的色谱图用作阴性对照，并与其它色谱图进行比较。TIDE显示gRNA 处理的视网膜的切割效率为22％，而加扰处理的视网膜的插入缺失可忽略不计 (图8B)。

为了评估HITI效率是否足以纠正AdRP表型，本发明人生成了两个 AAV2/8载体，其携带具有IRES序列和hRHO基因编码序列(hRHO CDS)的供体DNA，以及mRho或加扰gRNA(图9A)。将这些载体与 AAV2/8-IRBP-SpCas9载体一起注射。

20天龄P23H+/-小鼠接受视网膜下注射2.5*10

我们的方法的一个重要问题是本发明人已经靶向小鼠和猪Rho序列。对于临床应用，应该靶向人RHO基因。本发明人开发了gRNA和供体DNA以靶向人RHO基因。本发明人在HEK-293细胞体外测试了该方法。为了优化由mRNA 翻译dsRED，发明人测试了两种不同的翻译起始序列：kozak序列和小50bp IRES序列[38]。发明人还测试了核糖体-跳跃T2A序列(图11A)。使用CMV 启动子控制下编码hRHO的质粒，编码具有hRHO特异性gRNA的Cas9-GFP 的第二质粒和携带供体DNA的第三质粒转染HEK293细胞。转染后72小时的荧光显微镜和FACS分选显示，IRES和T2A稍稍优于kozak(39.4％和40.3％对35.6％)，尤其是在dsRED强度方面(图11B，C)。

稳定肝脏表达治疗性蛋白质的白蛋白基因座中的HITI

由于肝细胞分裂过程中的载体稀释，使用AAV的肝定向基因疗法具有些许局限性。这阻止了对可以避免或至少可以调节一些最严重的症状的数种遗传性疾病的新生儿或儿科治疗。为此以及其他原因，基因组编辑领域一直致力于开发策略，以实现由肝脏稳定表达转基因。在白蛋白基因座使用ZFN介导的 HDR表达治疗性蛋白的两项临床试验分别被批准用于MPSI和MPSII(试验编号NCT02702115和NCT03041324)。靶向白蛋白基因座作为整合和表达来自肝脏的治疗性蛋白质的“安全港”的这种方法已应用于其他几种疾病的动物模型[9，57-59]，并显示出作为可用于儿科患者的常规GT的替代的巨大前景。

本发明旨在将肝脏转化用于产生和稳定分泌ARSB酶的工厂，用于治疗 MPSVI。本发明人为小鼠白蛋白基因的第二外显子设计了特异性gRNA(图 12A)。然后，本发明人生成了两个AAV2/8载体：第一个载体编码在肝脏特异性杂交肝启动子(HLP)的控制下的SpCas9以及短合成多聚A(sh多聚A) [60]。第二载体编码gRNA表达盒和供体DNA。Alb特异性或加扰gRNA受到 U6启动子的控制。供体DNA侧接反向白蛋白gRNA靶位点，包含PAM。供体DNA在所有3个框架中都包含终止密码子，驱动翻译开始的kozak信号，转基因DsRed和bGH多聚A(图12B)。本发明人所期望的是，在静脉递送后，两种载体将到达肝脏并且在表达Cas9后，其将切割白蛋白基因座和供体 DNA，导致白蛋白基因座中NHEJ介导的供体DNA整合(图12C)。

为了评估新生小鼠中白蛋白基因座处的HITI是否可行，2日龄C57BL/6 小鼠接受静脉内注射AAV2/8(各载体的剂量为4*10

为了将DsRed+肝细胞的存在与Cas9介导的白蛋白基因座的切割相关联，本发明人由注射的肝脏提取了DNA并对Cas9靶位点周围的区域进行PCR扩增。PCR片段随后被用于Surveyor分析，结果表明，仅在gRNA处理的肝脏中存在插入缺失，而在加扰的肝脏中不存在插入缺失(图14A)。然后，本发明人使用TIDE分析来评估生成的插入缺失的频率和类型。本发明人在gRNA处理的肝脏中观察到了9.9％的插入缺失效率，而在加扰处理的PBS注射的肝脏中的插入缺失可忽略(图14B)。有趣的是，即使因NHEJ修复所致的大多数缺失被认为在1-6bp之间，但是在所有gRNA处理的肝脏中，本发明人观察到非常频繁的7bp缺失(图20A，蓝色箭头)。基于Shen等[61]用于插入缺失预测的模型的序列分析使我能够识别DSB两侧的两个小4bp微同源区域，它们通过7bp缺失导致有效的MMEJ修复(图14C)。

接下来，本发明人设计了PCR引物，以便在靶向整合后扩增5'和3'连接。对于5'连接，正向引物识别白蛋白的第一内含子，而反向引物识别供体DNA。对于3'连接，正向引物识别供体DNA，而反向引物识别白蛋白的第二外显子。在这两种情况下，本发明人仅在gRNA处理的肝脏中观察到预期大小的PCR 产物的扩增，这与同时存在插入缺失和DsRed+的肝细胞一致。由提取自加扰处理的肝脏的DNA没有扩增出PCR产物(图15B，C)。然后，纯化扩增的PCR产物，用于下一代测序分析。每个连接获得80000-350000的读出。与细菌克隆测序的数据一致，在5'连接处，本发明人观察到低频率的插入，和频率为38％的缺失(图16A)。大多数插入为1bp的，而缺失大多为1-47bp，并且1bp缺失是最常见的(图16C)。在3'连接处，本发明人在切割位点观察到高频率的1bp插入(图16B，C)，以及一些2bp插入。总之，缺失的频率更高(52％)，但也更多地分布在切割位点周围，从切割位点的1bp到38bp不等 (图16B)。最常见的缺失为1-18bp，并且本发明人还鉴定出了常见的42bp缺失。

接下来，本发明人希望评估HITI是否也能在成年小鼠的肝脏中以与新生小鼠相似的效率进行。因此，4周龄C57BL/6小鼠静脉内注射与新生小鼠所用各种载体相同的4*10

接下来，本发明人决定使用HITI来整合MPSVI小鼠白蛋白基因座中的编码序列或芳基硫酸酯酶B(ARSB)。为此，本发明人使用已经提到的 AAV2/8-HLP-Cas9-sh多聚A载体，并且本发明人生成了另一个载体，其携带白蛋白特异性或加扰gRNA的表达盒，以及编码3个框中的停止信号的侧接靶标的供体DNA，起始翻译的kozak信号，ARSB和bGH多聚的编码序列(图 18)。考虑到本发明人使用DsRed供体DNA在3'连接处观察到的缺失，本发明人在bGH和Cas9靶位点之间添加了200bp填充DNA，以避免bGH序列中不需要的缺失。2日龄MPSVI-/-小鼠静脉内注射6*10

与计划靶向Alb的策略相关的一个重要问题是基因组编辑后可能的Alb敲除。因此，我决定评估使用Cas9和Alb特异性gRNA的处理是否能降低处理的MPSVI小鼠中的血清白蛋白水平。为此，在p90测量血清白蛋白水平。尽管相较于加扰处理或未注射的小鼠，在gRNA处理的小鼠中观察到白蛋白水平的相对降低，但是这种降低并不显著，并且观察到的水平被认为是该年龄小鼠的正常范围(图21)。

显性遗传性疾病一直是基因疗法的难点。基因组编辑可能是开发针对GOF 突变治疗策略的关键工具。

HITI是一个非常灵活的工具，其可以改变基因纠正的格局。HDR在非分裂细胞中具有严重的局限性，并且所需同源臂的大小可以限制通过AAV可以插入的供体DNA的大小。相反，HITI已被证明在分裂和非分裂细胞中都有效，尽管需要进行更多的工作来了解增加Cas9切割或供体DNA的存在对于提高其体内效率是否有必要。本发明人已经证明HITI可以用来插入感兴趣的基因的正确拷贝以替换突变等位基因。尽管IRES似乎是最佳选择，这与本发明人已经进行的插入不在靶基因的ATG之前的事实一致，但是kozak和T2A序列也可以根据特定的方法工作。本发明人还致力于开发用于将供体整合到内含子而不是外显子中的系统，以避免Cas9切割GOF和野生型等位基因产生的潜在毒性。尽管HITI的效率可以进一步提高，但是其可以用于视网膜中的基因矫正，用于光受体的矫正。HITI还可以作为HDR的替代品，用于将肝脏转化为生产治疗性蛋白质的工厂。基因组编辑方法在需要将治疗递送到发育中的肝脏的情况下优于传统的基因传递方法，因为基因组编辑是持久的并且转基因表达不会随着时间的推移而丢失。即使HITI的效率很低，将转基因插入具有非常转录活性的白蛋白基因座也能确保治疗蛋白的高表达和分泌。发明人已经证明，该方法足以取代肝脏中AAV介导的ARSB表达，作为MPSVI的新生治疗策略，可以潜在地用于儿科患者以避免骨骼生长中的缺陷。总之，基因组编辑，特别是HITI平台正在将治疗遗传疾病的潜力扩大到新的高度，并且未来几年进行的研究将确定其适用于人类使用的前景。

结论

综上所述，这些结果表明，视紫红质基因座处的HITI在不同物种的视网膜中是有效的，高度依赖于AAV载体的转导以及gRNA的效率。HITI可以用于显性遗传性疾病的非等位基因治疗，其方法是敲除等位基因并将其替换为来自供体DNA的正确的等位基因。

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