SUCLG1基因或其表达产物的应用、检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及SUCLG1基因或其表达产物的应用检测试剂盒。

背景技术

肾癌是世界上最常见的泌尿系统肿瘤之一。肾癌在世界范围内呈逐年上升趋势，年发病率为2％。统计结果表明，发达国家肾癌的发病率高于落后国家。男性肾癌的发病率约为女性的1.58倍。我国肾癌的发病率相对较低，但近年来肾癌发病率呈快速上升趋势。2019年，美国估计有73820个新病例，其中14770人死于肾癌。我国肾癌的发病率和死亡率也呈上升趋势。2015年，估计新病例为66800，死亡人数为23,400。根据世界卫生组织的预测，肾细胞癌预后不良，全世界每年的死亡人数约为9万人。

早期肾癌往往不会引起明显的临床症状，一旦出现症状，往往已处于晚期。然而，由于缺乏针对肾癌的特异性肿瘤标志物，其早期诊断仍依赖于诸如b超、CT和MRI等成像方法。肾癌的治疗仍以手术为主，虽然切除肿瘤的恶性增殖是一个很好的选择，但目前的结果仍不令人满意。目前，肾细胞癌发生、发展和转移的具体机制尚不清楚。肿瘤标志物与肿瘤的发生发展密切相关。寻找肿瘤恶性增殖的关键、有效和广谱的靶点仍是临床急需解决的难题。肿瘤的侵袭和转移是一个复杂的过程，通常需要缺氧、能量代谢、血管生成、免疫逃逸等环节，以及细胞微环境重塑、细胞骨架重建、细胞粘附变化、细胞外基质降解等变化。因此，肿瘤细胞侵袭和转移相关标志物的研究有助于肿瘤相关基因的功能鉴定。

随着分子生物学技术的发展，探寻与疾病相关的基因已成为当前抗肿瘤靶点研究的有效途径。相关基因标志物的发现不仅有助于肾癌患者的预后评估，同时也有助于临床上对肾癌的诊断、术后局部复发或远处转移的预测、也有望成为分子靶向药物研发的靶点，也为肾细胞癌的靶向治疗提供新思路。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了SUCLG1基因或其表达产物在肿瘤检测中的应用。

本发明通过实时荧光定量PCR比较了SUCLG1基因在不同肾癌细胞系中的表达，结果显示，与正常的肾癌细胞系293T相比，SUCLG1在OSRC-2、A498、786-O、Caki-1、ACHN、769-P细胞系中的表达显著降低。通过蛋白印迹试验，比较了SUCLG1在癌旁组织和肾癌组织样本中的表达情况，结果显示，与癌旁组织相比，肾癌组织中SUCLG1的基因表达水平显著降低。

基于以上结果，本发明提供了SUCLG1基因或其表达产物作为标志物在制备肿瘤检测试剂盒中的应用；本发明还提供SUCLG1基因或其表达产物在制备肿瘤标志物中的应用；本发明还提供了检测SUCLG1基因的引物或检测SUCLG1基因表达产物的抗体在制备肿瘤检测试剂盒中的应用。

本发明中，所述SUCLG1基因可以是编码SUCLG1的DNA，也可以是编码SUCLG1的RNA。

一些实施方案中，SUCLG1基因的序列号为NM_003849.4。SUCLG1基因表达产物为SUCLG1蛋白，其NCBI ID号为NP_003840.2。

一些实施方案中，所述肿瘤为肾癌。

本发明还提供一种肿瘤检测试剂盒，该试剂盒以SUCLG1基因或其表达产物为靶点，包括DNA提取试剂盒、检测SUCLG1基因的试剂、检测SUCLG1基因表达产物的试剂。

一些实施方案中，所述检测SUCLG1基因的试剂包括SUCLG1基因检测引物；所述检测SUCLG1基因表达产物的试剂包括SUCLG1基因表达产物的抗体。

一些具体实施例中，所述SUCLG1基因检测引物包括SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物。

forward 5'-GAGCAACGGCTTCTGTCATTT-3'(SEQ ID NO:1)；

reverse 5'-TGCTTGACTCGTACCATGTCC-3'(SEQ ID NO:2)。

本发明通过细胞增殖试验、划痕实验和transwell实验证明，在OSRC和A498细胞系中过表达SUCLG1之后，细胞的增殖、迁移和侵袭明显受到抑制。基于该结果，本发明还提供了SUCLG1激动剂在制备预防或治疗肾癌的药物中的应用。

其中，所述SUCLG1激动剂为上调SUCLG1基因转录水平或表达水平的DNA、RNA或蛋白。

具体地，所述治疗为抑制肾癌细胞增殖和/或抑制肾癌细胞迁、侵袭。

一些实施方案中，所述肾癌细胞为OSRC-2、A498、786-D、Caki-1、ACHN、769-P中的至少一种细胞系。

由以上方案可知，本发明提供了SUCLG1的新应用，具体为SUCLG1基因或其表达产物、激动剂的应用。本发明通过实时荧光定量PCR和蛋白印迹试验证实，与正常的肾癌细胞系293T相比，SUCLG1在肾癌细胞系OSRC-2、A498、786-O、Caki-1、ACHN、769-P中的表达显著降低。与癌旁组织相比，肾癌组织中SUCLG1的基因表达水平显著降低。进一步通过细胞增殖试验、划痕实验和transwell实验发现，过表达SUCLG1基因可有效地抑制肾癌细胞的增殖、肾癌细胞的迁移、侵袭。本发明首次发现并验证了SUCLG1基因表达水平与肾癌发病之间的联系，SUCLG1基因或其表达产物可作为标志物准确的判断个体是否患有肾癌或评估肾癌患病风险。

附图说明

图1示SUCLG1在不同肾癌细胞系中的表达；

图2示SUCLG1 mRNA在肾癌组织中的表达；

图3示免疫蛋白印迹法检测SUCLG1蛋白在肾癌组织中的表达；

图4示过表达SUCLG1对肾癌细胞增殖的曲线图；

图5示edu增殖试验检测过表达SUCLG1对肾癌细胞细胞增殖的影响

图6示transwell实验检测过表达SUCLG1对肾癌细胞迁移的影响；

图7示transwell实验检测过表达SUCLG1对肾癌细胞侵袭的影响；

图8示划痕实验检测过表达SUCLG1对肾癌细胞迁移的影响。

具体实施方式

本发明提供了SUCLG1基因或其表达产物的应用检测试剂盒。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1 SUCLG1在不同肾癌细胞系中的表达

将细胞培养皿置于冰上，取出培养基，用PBS洗涤细胞三次。使用

forward 5'-GAGCAACGGCTTCTGTCATTT-3'(SEQ ID NO:1)；

reverse 5'-TGCTTGACTCGTACCATGTCC-3'(SEQ ID NO:2)。

按照以上步骤提取肾癌组织的总RNA，将反转录的cDNA为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2为引物，按照常规方法、步骤进行实时荧光定量PCR，结果见图2。

分别提取肾癌组织和正常组织的蛋白，在4℃用RIPA裂解缓冲液裂解10分钟。然后在4℃下以12000×g离心20分钟。取上清，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。样品与3倍样品缓冲液混合，煮沸5分钟。将获得的蛋白样品装载在10％SDS凝胶上，并使用SDS-PAGE进行2小时的分离。然后将分离的蛋白转移到硝化纤维素膜上，在室温下用5％脱脂牛奶将其封闭2小时，然后根据基于预染色蛋白质阶梯的感兴趣蛋白质的分子量切割膜。随后，将膜与一级抗体在4℃孵育过夜。第二天，用TBST缓冲液冲洗膜四次，并在室温下用适当的二级抗体(1:10000)孵育2小时。用TBST再次洗涤这些膜四次，并用增强化学发光试剂观察信号，进行密度测定分析，结果见图3。

由图1～3可知，与正常的肾癌细胞系293T相比，SUCLG1在肾癌细胞系OSRC-2、A498、786-O、Caki-1、ACHN、769-P中的表达显著降低。与癌旁组织相比，肾癌组织中SUCLG1的基因表达水平显著降低。

实施例2过表达SUCLG1对肾癌细胞增殖的影响

为了进行细胞活性测定，构建过表达SUCLG1的质粒pSUCLG1分别转染OSRC-2、A498细胞系，将转染细胞在96孔板(每孔1000个细胞)中进行培养、计数。细胞培养、计数的时间为0、24、48、72、96小时，使用细胞计数试剂盒CCK8分析试剂盒测定细胞活力，按照试剂盒说明书的步骤进行操作。结果见图4。

利用edU细胞增殖检测试剂盒对培养24小时的细胞进行细胞增殖检测，按照说明书的步骤进行试验，结果见图5，其中，vector为转染空质粒的对照组。

由图4～5的结果可知，过表达SUCLG1基因可有效地抑制肾癌细胞的增殖。

实施例3过表达SUCLG1对肾癌细胞迁移、侵袭的影响

(一)transwell实验

构建过表达SUCLG1的OSRC-2、A498细胞，用胰蛋白酶消化，室温下900×g离心3分钟，丢弃上清液后，将样品重新悬浮在RPMI-1640培养基中，在室温下以900x g离心3分钟，并用PBS洗涤细胞。将细胞重新悬浮于500μlRPMI-1640培养基中，用血液细胞仪测定细胞密度。在侵入试验中，用基质凝胶包裹Transwell膜。共将2×104个细胞置于8μm孔微孔Transwell插入物的上腔中，在下腔中添加500μl补充有10％FBS的RPMI-1640，然后培养细胞。通过计算成功通过细胞膜(迁移)或通过基质凝胶基质(侵袭)迁移的细胞数来确定迁移和侵袭。24小时后，取出腔室，用棉签取出未迁移或侵入的细胞，并在室温下干燥插入物。细胞在室温下用4％多聚甲醛固定15分钟，用结晶紫染色5分钟。滤膜干燥后，进行拍照。结果见图6～7。

(二)划痕实验

对OSRC-2、A498细胞进行筛选、消化和计数后，分别将细胞接种到6孔板中并培养过夜。第二天用SUCLG1、PCK2、GLDC和NC过表达质粒转染。转染48小时后，汇合达到几乎100％，用200μl移液管尖端刮取单层细胞，并用倒置显微镜在×200处拍照。将6孔板放入培养箱中，24小时后再次拍照。比较了两张照片中的划痕区域，结果见图8。

由图6～8可知，pSUCLG1组划痕愈合面积的比例明显低于比Vector组表明，在OSRC和A498细胞系中过表达SUCLG1基因可有效地抑制肾癌细胞的迁移、侵袭。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。