一种靶向人高侵袭性脉络膜黑色素瘤的核酸适体QQ-4及应用

技术领域

本发明具体涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种靶向人高侵袭性脉络膜黑色素瘤的核酸适体QQ-4及应用。

背景技术

葡萄膜黑色素瘤是成人最常见的原发性恶性眼内肿瘤，也是仅次于皮肤的第二常见黑色素瘤类型。肿瘤起源于葡萄膜，包括脉络膜（90%）、睫状体（6%）和虹膜（4%）。葡萄膜黑色素瘤通常无症状，且无特异性的肿瘤血清标志物，诊断主要基于眼科成像技术，包括眼底摄影、荧光素血管造影、眼底自体荧光成像、光学相干断层扫描和超声成像，这也使得葡萄膜黑色素瘤成为少数不主要依靠活检诊断的癌症之一。

葡萄膜黑色素瘤极易发生转移，特别是肝转移。多项研究发现，超过90%的转移病例表现为肝脏病变。肝转移是葡萄膜黑色素瘤患者死亡的最主要原因，超过95%的病人在死亡时都有肝转移。一旦发现转移，葡萄膜黑色素瘤患者的平均生存期只有仅仅６到８个月。而即使局部肿瘤控制情况良好，高达50%的患者仍会在15年内发生转移，导致其预后极差。

该疾病在早期可无症状，造成诊断困难。且现有治疗方案效率低下，尤其是对于高危患者，目前缺乏高效准确的方法来控制其转移。因此，开发一种靶向葡萄膜黑色素瘤的特异性分子探针对葡萄膜黑色素瘤的早期诊断、病情监测和治疗预后具有重要意义。

传统肿瘤识别和靶向治疗依赖抗体。然而，使用抗体作为分子探针往往缺乏理想的药代动力学，而且这种探针在化学修饰和储存过程中很容易失去活性。通过Cell-SELEX筛选技术得到的核酸适体是一类短小的单链寡核苷酸或多肽，能够通过其多种多样的三维构象与多种靶分子结合，具有结合亲和力高、特异性高、合成简单、结构灵活、稳定性好、免疫原性低等优点，是一种有效而有发展前景的分子探针。

Cell-SELEX(SystematicEvolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX) 技术全称是指数富集的配体系统进化技术。其通过靶细胞与体外合成的寡核苷酸文库相互结合，引入负筛细胞（通常为正常细胞）去除非特异性结合寡核苷酸，利用PCR技术扩增与靶细胞结合的寡核苷酸含量，经过十几轮的重复筛选来最大化富集目标核酸链，以此获得高特异性和高亲和性的核酸适体。通过Cell-SELEX技术筛选的到的适体能识别正筛选细胞(目标癌细胞)和负筛选细胞(正常细胞)细胞膜上细微的分子差异，从而能够高效鉴别癌细胞和正常细胞。进一步对这核酸适体的性质表征和靶分子的鉴定，有助于发现新的肿瘤标志物，用于肿瘤的诊治和靶向治疗。

发明内容

为了解决现有技术存在的技术缺陷，本发明提供了一种靶向人高侵袭性脉络膜黑色素瘤的核酸适体QQ-4及应用，该条适体能特异性结合脉络膜黑色素瘤细胞，且其合成成本低，制备简单方便，对脉络膜黑色素瘤细胞选择性好，结合力强，检测灵敏度高，检测过程操作简单，结果准确。

本发明采用的技术解决方案是：一种靶向人高侵袭性脉络膜黑色素瘤的核酸适体QQ-4，包含如下序列：

5’- ATCCCCGGCGATCGGCCGTAACTCAGTTCTCGGTGGTTACGGAA -3’，或在所述的序列两端均加上引物序列。

5’端所述的引物序列具有18个核苷酸，3’端所述的引物序列具有18个核苷酸。

所述的5’端的引物序列为ACCGACCGTGCTGGACTC，所述的3’端的引物序列为CTATGAGCGAGCCTGGCG。

所述的序列为

5’-ACCGACCGTGCTGGACTCATCCCCGGCGATCGGCCGTAACTCAGTTCTCGGTGGTTACGGAACTATGAGCGAGCCTGGCG -3’。

所述的序列两端或一端包括：放射性标记、治疗性药物连接、荧光标记或生物素标记在内的修饰或改造。

所述的序列包括以下二级结构中的任意一种或几种：

一种靶向人高侵袭性脉络膜黑色素瘤的核酸适体QQ-4在制备诊断和治疗人高侵袭性脉络膜黑色素瘤的制剂中的应用。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种靶向人高侵袭性脉络膜黑色素瘤的核酸适体QQ-4及应用，通过对该条核酸适体QQ-4的性质表征和靶分子的鉴定，有助于发现脉络膜黑色素瘤的肿瘤标志物，用于脉络膜黑色素瘤的诊治和靶向治疗，制备的核酸适体能特异性识别人高侵袭脉络膜黑色素瘤细胞并具有很高的亲和力；无免疫原性；分子量小，能够体外化学合；核酸适体的不同部位易于修饰和取代。同时，其具有序列稳定，便于保存，方便标记等优势。采用本发明的核酸适体进行人脉络膜黑色素瘤细胞检测时，操作更为简单、迅速，并且本发明核酸适体的合成成本较抗体制备成本低，且周期短，重现性好。

附图说明

图1为富集文库流式；其中图左为正筛细胞C918与富集文库；右为负筛细胞MC与富集文库。

图2为流式细胞术验证QQ-4结合能力，其中图左为正筛细胞C918与适体QQ-4；右为负筛细胞MC与适体QQ-4。

图3为激光共聚焦成像验证QQ-4结合能力。

图4为流式细胞术验证QQ-4的结合特异性，其中蓝线代表对照文库，红线代表QQ-4。

图5为激光共聚焦显微成像考察QQ-4的结合特异性。

图6为QQ-4的二级结构预测，其中左为4℃下QQ-4的二级结构；右为37℃下QQ-4的二级结构。

图7为适体QQ-4的解离常数。

图8为QQ-4在生理条件下的结合能力，左为温度对QQ-4的影响；右为不同结合液对QQ-4的影响。

图9为QQ-4的血清稳定性。

图10为QQ-4的内化性分析。

图11为QQ-4对C918迁移的影响。

图12为QQ-4的活体成像。

图13为核酸适体QQ-4在临床病理组织切片中的激光共聚焦显微镜电子扫描图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获的的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

1.细胞系的培养及扩增

实验中所用细胞均购自赛百慷(上海)生物技术股份有限公司和武汉普诺赛生命科技有限公司。正筛细胞是人高侵袭性脉络膜黑色素瘤细胞C918，负筛细胞是人黑色素细胞MC，其余用到的细胞系包括人高侵袭性脉络膜黑色素瘤细胞MµM2B，人低侵袭性脉络膜黑色素瘤细胞OCM-1，人恶性黑色素瘤细胞A375，人胶质母细胞瘤细胞U87MG，人横纹肌肉瘤细胞A673，人肺癌细胞PC-9，人乳腺癌细胞MCF-7，人宫颈癌细胞Hela，人肝癌细胞HuH-7，人卵巢癌细胞Anglne，人胰腺管癌细胞PL45，人组织细胞淋巴瘤细胞U-937，人恶性多发性畸胎瘤细胞NTERA-2，人原髓细胞白血病细胞HL-60，人视网膜色素上皮细胞ARPE，人角膜上皮细胞HCEC，人晶状体上皮细胞HLEC，人视网膜内皮细胞HREC，人胚肾细胞HEK-293t，人角质形成细胞hacat。

所有培养基均加入100U/ml青霉素和链霉素，具体培养条件如表1所示。所有细胞系均培养于二氧化碳恒温培养箱，培养温度为37℃，CO

表1 实验所用细胞系及培养条件

2.Cell-SELEX筛选

以人高侵袭脉络膜黑色素瘤细胞系 C918为靶细胞，人黑色素细胞MC为对照细胞系，通过cell-SELEX 技术筛选得到能和C918结合而与对照细胞不结合的核酸适体富集文库。筛选过程中所用的初始文库为ACCGACCGTGCTGGACTC(N)

具体过程如下：

（1）负筛选：用结合缓冲液溶解上述的随机文库，95℃变性5分钟，冰上静置10分钟后，与培养和预处理好的人黑色素细胞（MC）4℃下进行孵育。

（2）正筛选：负孵育结束后，将上清液加入培养和预处理好的人高侵袭性脉络膜黑色素瘤细胞（C918），在4℃下进行孵育

（3）洗脱：孵育完成后，去除孵育培养皿里的液体，用洗涤缓冲液（DPBS，5mMMgCl2，4.5mg/ml葡萄糖）洗涤完成孵育的细胞。

（4）解离：洗涤结束后，用1mL 无菌水刮取孵育培养皿中细胞，置于1.5ml离心管，95℃加热变性10分钟，5500rpm离心后取上清，上清即为与人高侵袭性脉络膜黑色素瘤细胞C918细胞结合，而不与人黑色素细胞MC细胞结合的筛选富集文库。

(5)PCR 扩增：对富集文库进行PCR 扩增，上游引物：5’-FAM-ACCGACCGTGCTGGACTC-3’；下游引物：5’-生物素-TGGACACGGTGGCTTAGT-3’；扩增条件为：95℃，3分钟；95℃，30秒；58℃，30秒，72℃，30秒，经合适循环轮数，72℃，5min。

(6) 制备DNA 单链富集文库：用链霉亲和素琼脂糖球珠分离生物素标记的PCR扩增产物；然后利用0.2M氢氧化钠使双链DNA 变性解链，从而得到FAM荧光素标记的 DNA 单链文库。

上述步骤为一轮完整的筛选过程，本实验总共进行了20轮筛选。在第三轮引入负筛选，第一、二轮只进行正筛选。随着筛选轮数的增加，不断增加正筛和负筛的压力，即减少正筛时间和正筛细胞数，增加负筛时间和负筛细胞数，同时增加洗脱时长。具体筛选条件如表2。

表2 筛选条件及筛选压力

3.流式细胞术验证筛选文库的富集情况

经过20轮的循环筛选，用流式细胞术对12、16、19、20轮筛选产物的富集情况进行考察，对照组为FAM标记的初始文库。用无酶消化液将贴壁状态的C918细胞从培养皿上消化下来，将细胞收集到离心管中，并用洗涤缓冲液离心洗涤3次。然后，加入已经用结合缓冲液配好的浓度为250nM的不同轮数筛选所得的富集文库，在4℃下孵育45分钟。孵育结束后，用洗涤缓冲液1000rpm离心洗涤3次，然后用结合缓冲液重悬细胞，流式细胞术检测细胞的荧光强度。

结果如图1显示，随着筛选轮数的不断增加，筛选产物与靶细胞的结合能力逐渐增强，并在19轮达到最强，20轮产物的荧光强度较19轮反而有所降低，说明19轮已经实现适体最大富集化，达到筛选终点。且19轮筛选文库与对照细胞几乎不结合。

4.富集文库的高通量测序及核酸适体的明确

流式结果可知，第19轮筛选产物的富集程度达到最强，对第19轮筛选产物进行高通量测序，测序工作交由上海生工生物工程有限公司完成。测序结果按照序列出现的频次及重复率从高到低给出前2000条ssDNA序列。经过比对和分析，最终挑选出一条核酸序列，命名为QQ-4，具体序列如下：ACCGACCGTGCTGGACTCATCCCCGGCGATCGGCCGTAACTCAGTTCTCGGTGGTTACGGAACTATGAGCGAGCCTGGCG

4.1 流式细胞术验证QQ-4的结合能力

具体方法如步骤3，用流式细胞术验证适体QQ-4的结合能力。结果如图2显示，适体QQ-4能特异性地结合C918细胞，而不与MC细胞结合。

4.2单光子激光共聚焦荧光显微镜验证QQ-4的结合能力

为了进一步更直观地考察适体QQ-4的结合能力在体外的成像能力，通过激光共聚焦显微镜实现细胞荧光成像，直观地展现细胞表面的荧光信号强度。用洗涤缓冲液润洗预先接种在光学培养皿中的C918细胞，润洗结束后，加入已经用结合缓冲液配好的浓度为250nM的Cy5标记的适体QQ-4，在4℃下孵育45分钟。孵育结束后，用洗涤缓冲液洗涤3次，然后加入结合缓冲液，置于激光共聚焦荧光显微镜下拍照。

结果如图3示，适体与靶细胞C918结合，而与对照细胞人黑色素细胞MC不结合。

通过流式细胞术和激光共聚焦显微成像的结果，确定适体QQ-4可以特异性地与人高侵袭性脉络膜黑色素瘤细胞结合。

5.适体QQ-4的结合特异性分析

5.1 流式细胞术验证QQ-4的结合特异性

为了验证核酸适体QQ-4与其他肿瘤以及正常细胞的结合情况，培养扩增了其他肿瘤细胞以及正常细胞，并通过流式细胞术验证结合能力。结果如图4，适体除了与靶细胞C918结合，也和另一人高侵袭性脉络膜黑色素瘤细胞MµM2B高度结合，此外其与皮肤黑素瘤A375、人低侵袭性脉络膜黑色素瘤细胞OCM-1也有部分结合能力，不与其他细胞结合。

5.2 单光子激光共聚焦荧光显微镜考察QQ-4的结合特异性

为了进一步考察QQ-4是否只靶向结合人高侵袭性脉络膜黑色素瘤，通过单光子激光共聚焦荧光显微镜来直观观察QQ-4与人高侵袭性脉络膜黑色素瘤和人低侵袭性脉络膜黑色素瘤，人黑色素细胞，人视网膜色素上皮细胞的结合情况。结果如图5，适体QQ-4只与人高侵袭性脉络膜黑色素瘤细胞C918和人高侵袭性脉络膜黑色素瘤细胞MµM2B结合，而不与人低侵袭性脉络膜黑色素瘤细胞OCM-1，人恶性皮肤黑色素瘤细胞A375，人黑色素细胞MC，人视网膜色素上皮细胞ARPE结合。

通过Cell-SELEX筛选技术，以人高侵袭脉络膜黑色素瘤细胞系C918为靶细胞，以人黑色素细胞MC为对照细胞，进行靶向人眼脉络膜黑色素瘤适体的筛选。流式细胞术验证发现筛选产物的富集率在19轮时达到最大。对19轮富集文库进行高通量测序，测序结果分析后，再挑选部分进行流式细胞术和激光共聚焦显微成像验证，明确了靶向人眼脉络膜黑色素瘤细胞C918细胞的适体的序列。此外，该适体与皮肤黑色素瘤以及人低侵袭脉络膜黑色素瘤结合能力弱，说明该适体对人高侵袭脉络膜黑色素肿瘤有高度特异性，为葡萄膜黑色素瘤的诊断以及靶向治疗打下基础。

6.适体QQ-4的二级结构预测

通过Cell-SELEX技术筛选得到的核酸适体，核心序列加上两端引物，长度一共有80个碱基。其经折叠后，形成某种特定的三维结构嵌入靶分子。通过Nupack软件预测得到适体QQ-4的二级结构如图6。

7.核酸适体QQ-4与靶细胞结合解离常数的测定

通过设置不同浓度梯度的适体分别与靶细胞孵育，利用流式细胞术分析细胞与不同梯度浓度的适体结合的平均荧光强度值，再用Graph Pad Prism 7软件绘制模拟曲线，计算得到平衡解离常数（Kd）。公式为Y = Bmax X / (Kd + X)。其中适体组设置浓度梯度为0nM、25nM、50nM、75nM、100nM、150nM、200nM、 300 nM、400 nM、500 nM、600 nM、750 nM、1000nM, 并将其配成终体积为200µl的溶液。同时设置相对应浓度梯度的 FAM 标记的文库作为对照组，扣除对照组的非特异性结合荧光强度值，并记录计算Kd值。独立实验重复三次。Kd值越小，说明亲和力越高。

经过流式检测和分析，结果如图7所示，适体的Kd值为12.27±2.49nM，在nM水平，说明本次筛选得到的适体与靶细胞有很强的亲和性。

8.生理条件下适体QQ-4的结合能力分析

为了降低DNA酶对ssDNA的降解作用，整个筛选过程在４℃环境下进行，且是在特定的结合缓冲液条件下筛选得到，如果适体仅能在4℃下在特定结合缓冲液中发挥作用，则会限制其应用。为了验证适体在生理条件下的结合能力，用37℃下的10%FBS 的 RPMI-1640完全培养基模拟生理条件，来检测核酸适体的在生理条件下的结合能力。

结果如图8，左图表明QQ-4在４℃和37℃下与靶细胞的均有很强的结合能力，右图表明适体QQ-4在37℃的完全培养基或者FBS（胎牛血清）中的结合能力并未下降，这说明适体在生理条件下有很强的结合能力，这为适体未来的应用打下了基础，有望在临床诊断和治疗中发挥更大的用途。

9.适体的稳定性分析

生物稳定性是生理条件下影响核酸适体应用能力的重要因素，通过含10%FBS 的RPMI-1640 完全培养基在37℃体外模拟生理条件来检测核酸适体的生物稳定性。取18µl的100µM适体加入582µl 完全培养基中，配成600μl 3μM的溶液，于37℃分别孵育0h，2h，4h，6h，12h，24h，36h, 48h。并且于不同时间点收集50μl含有适体的培养基，95℃变性10min，冰上冷却后，保存于-80℃。待所有时间点样品收集结束后，通过3%的琼脂糖凝胶电泳及成像表征适体的稳定性。

分析结果如图9，48小时后的适体在完全培养基中仍有很高的浓度，基本未降解，说明筛选得到的适体稳定性很强。

10.QQ-4的内化性分析

适体能通过结合细胞表面受体而内化进入细胞，参与细胞信号传导，调控细胞代谢等。本实验通过激光共聚焦显微成像来观察适体的内化效果。将适体QQ-4与靶细胞在37℃下孵育3小时，孵育结束后，用洗涤缓冲液清洗三次，用DAPI染细胞核，DiO染细胞膜，在激光共聚焦显微镜下观察QQ-4的内化情况。

结果如图10所示，基本所有的适体都发生内化，进入胞浆，说明适体的内化性极强，为适体未来的载药打下基础。

11.QQ-4对肿瘤细胞迁移的影响

为了考察适体QQ-4是否可以影响人高侵袭性脉络膜黑色素瘤细胞C918 的迁移能力，进行了划痕试验。把C918细胞接种到到24孔板中，加入的细胞数以过夜能铺满单层为宜，用枪头尽量垂直于背面的平行线划痕，实验组和对照组划痕宽度相近，分别设置空白组，文库对照组和适体QQ-4组，在不同时间段拍照。

结果如图11，说明适体QQ-4可以抑制人高侵袭性脉络膜黑色素瘤细胞C918 的迁移。

12.QQ-4的活体成像

活体肿瘤实验当中，通过皮下注射的方式给裸鼠种植瘤。于上海SLAC购买上海斯莱克实验动物有限责任公司购买4周大的雄性裸鼠，给每只老鼠皮下注射5*10

13.核酸适体QQ-4在临床病理组织切片中的检测

本实验中采用的临床病理石蜡组织切片均来自温州医科大学附属眼视光医院病理科，实验中所用到的试剂如下：

封闭液：4ml 结合缓冲液+1ml 胎牛血清+500µl 10ml/ml鲑鱼精子DNA

具体实验步骤；

１、烤片：将封好蜡的临床病理石蜡组织切片放入60℃烘箱，烤片2h。

２、脱蜡：将切片放入装有二甲苯的染色缸，浸泡15min之后，放入另一个装有二甲苯的染色缸，再浸泡15min进行脱蜡处理；

３、将切片放入装有无水乙醇的染色缸，浸泡5min之后，放入另一个装有无水乙醇的染色缸，再浸泡５min；

４、将切片依次浸入梯度降级的乙醇进行水化处理：90％乙醇5min，80％乙醇5min，70％乙醇5min，DPBS洗３次，每次３min；

５、抗原修复，将切片浸入新配制的PH6.0的抗原修复液中，微波95℃加热约20min，在室温自然冷却后，用DPBS洗３次，每次5min，

６、使用新配制的封闭液在室温条件下，放置于水平摇床上，封闭1h。封闭完之后轻轻甩掉封闭液；

７、向切片上分别加入终浓度为200µl 500 nM、Cy5标记的核酸适体QQ-4或者对照文库，在４℃，水平摇床上，孵育２ｈ，孵育完之后用DPBS浸泡清洗３次，每次５min；

８、封片：清洗完之后，用无尘纸吸干切片表明的水，分别向每张切片上加入抗淬灭封闭液，然后小心盖上盖玻片，操作时注意避免产生气泡；

９、激光共聚焦显微镜拍照成像。

实验结果如图，激光共聚焦显微镜的电子扫描图，可看出QQ-4能够很好的识别脉络膜黑色素瘤癌组织而不识别癌旁组织以及正常组织；文库基本不识别癌组织和正常组织。说明适体QQ-4能特异性识别临床组织中的脉络膜肿瘤组织样本。

总结

本发明利用核酸适体筛选技术（cell-SELEX），针对人高侵袭性脉络膜黑色素瘤细胞(C918）进行筛选。所用的筛选初始文库总长度为80个碱基，包括两端固定的18个碱基的PCR引物序列，和中间44个碱基组成的序列。筛选过程中，前两轮只进行正筛选，在第三轮开始加入负筛选，并不断减少正筛时间，增加负筛时间，以此加大筛选压力。经过19轮的筛选，富集序列与人高侵袭性脉络膜黑色素瘤细胞C918有非常强的结合能力。对第19轮的富集序列进行了高通量测序，并对结果进行同源家族分析和比对，通过流式细胞术的验证，最终挑选出了核酸适体QQ-4。QQ-4在体内外与人脉络膜黑色素瘤均表现出了极高的亲和性和很强的特异性。在共聚焦显微成像下，QQ-4仅与人高侵袭性脉络膜黑色素瘤细胞C918和MµM2B结合，且展现了很强的内化能力。而在成瘤裸鼠活体成像实验中，尾静脉注射带有荧光标记Cy-5的QQ-4后，荧光信号在肿瘤部位富集，表明该条核酸适体QQ-4在复杂环境中仍能保持良好的识别能力，并且保持高度的组织特异性。此外，适体QQ-4孵育临床组织切片结果显示，核酸适体QQ-4能特异性识别临床癌组织。以上结果均说明核酸适体QQ-4可以应用于人葡萄膜黑色素瘤细胞的检测，有望应用于寻找葡萄膜黑色素瘤的癌症靶标分子及后续靶向治疗。

各位技术人员须知：虽然本发明已按照上述具体实施方式做了描述，但是本发明的发明思想并不仅限于此发明，任何运用本发明思想的改装，都将纳入本专利专利权保护范围内。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 温州医科大学附属眼视光医院

<120> 一种靶向人高侵袭性脉络膜黑色素瘤的核酸适体QQ-4及应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

accgaccgtg ctggactcat ccccggcgat cggccgtaac tcagttctcg gtggttacgg 60

aactatgagc gagcctggcg 80