一种球毛壳菌HJF 13菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一种球毛壳菌(Chaetomium cochliodes)HJF 13及其在制备抗枯草芽孢杆菌剂中的应用，属于应用微生物学技术领域。

背景技术

球毛壳菌属于毛壳菌属的一个种，作为一类有效的生防真菌，能对多种病原菌产生拮抗作用。球毛壳菌除了可降低由镰刀菌引起的番茄枯萎病、黑星菌引起的苹果斑点病等植物病害的发病率外，还对日常生活中常见的白色念珠菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、荧光假单胞菌等病原菌具有良好的抑制活性，在医药、农药的研发中具有广阔的应用前景。

枯草芽孢杆菌是一种生长繁殖速度较快的革兰氏阳性细菌，虽然在动植物病害的生物防治、植物生长促进剂、工业酶类和肥料发酵等方面枯草芽孢杆菌具有很好的应用价值，但是在日化产品、食品及工业产品等领域，枯草芽孢杆菌依然是一个有害菌。目前，越来越多的日化产品中添加了胶原蛋白、透明质酸、多肽等高营养成分，它们在保护皮肤的同时也为微生物的繁殖创造了更加便利的条件，消费者使用了微生物超标的化妆品，会导致皮肤红肿、过敏等不良反应，因此，迫切需要寻找一种高效、低毒的生物防治方法来降低枯草芽孢杆菌对一些特殊领域产品的污染。发明人在前期研究中，从分离自黄精植物的内生真菌中筛选到一株对枯草芽孢杆菌具有较好抑制作用的球毛壳菌HJF 13(Chaetomiumcochliodes HJF 13)，可用于枯草芽孢杆菌的生物防治，经文献检索，未见相关文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种球毛壳菌HJF 13(Chaetomium cochliodes HJF 13)及其在制备抗枯草芽孢杆菌剂中的应用。

本发明的目的是这样实现的：

本发明使用的菌株球毛壳菌HJF 13(Chaetomium cochliodes HJF 13)，菌株HJF13已于 2021年4月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M2021343。

本发明菌株的形态特征为：菌丝交织透明有隔，子囊壳表生，中等大小，卵形，菌落在 PDA培养基上初始为白色，渐呈淡褐色。提取菌株的DNA，采用真菌通用引物ITS1和ITS4扩增ITS序列后进行测序，将测序得到的DNA序列在NCBI数据库中进行BLAST搜索比对，菌株的ITS序列与球毛壳菌有效发表种Chaetomium cochliodes HMAS:244354相似性为100％，因此，将菌株命名为球毛壳菌HJF 13(Chaetomium cochliodes HJF 13)。

本发明的球毛壳菌HJF 13为黄精植物内生真菌。

本发明的球毛壳菌HJF 13(Chaetomium cochliodes HJF 13)在制备抗枯草芽孢杆菌剂中的应用。

制备微生物抗枯草芽孢杆菌剂份步骤如下：

1、试管种培养

将菌株HJF 13接种到试管固体培养基斜面上，于28℃下培养6天，获得试管种。固体培养基为常用的PDA培养基，方法是马铃薯200g去皮后切成小块，加水1000ml煮沸20分钟后过滤，得到的滤液中加入葡萄糖20g，琼脂15g，加水定容至1000ml，121℃灭菌30 分钟。

2、液体种子培养

采用500ml三角瓶摇瓶培养，方法是先配制液体种子培养基，液体种子培养基为常用的 PDB培养基，方法是：马铃薯200g去皮后切成小块，加水1000ml煮沸20分钟后过滤，得到的滤液中加入葡萄糖20g，加水定容至1000ml，在每个三角瓶中装入100ml液体种子培养基，121℃灭菌30分钟。冷却后接入1cm

3、制备抗枯草芽孢杆菌剂

采用1000ml三角瓶摇瓶培养，方法是先配制液体发酵培养基，液体发酵培养基为常用的 PDB培养基，制作方法同上述液体种子培养基的制作方法，在每个三角瓶中装入200ml液体发酵培养基，121℃灭菌30分钟，冷却后接入20ml上述方法2中得到的种子液，28℃下于转速为220rpm的摇床上培养7天得菌株发酵液。在发酵液中加入等体积乙醇，经摇床振荡6小时后滤去菌丝体，蒸去发酵液中的乙醇得到菌株发酵提取物，将发酵提取物用水稀释到原发酵液体积，即成为可供使用的抗枯草芽孢杆菌剂。

将上述方法制备得到的微生物抗枯草芽孢杆菌剂，采用平板抑菌试验来测试该制剂对枯草芽孢杆菌的抑制作用。

平板抑菌试验结果表明：用上述方法制备得到的菌株HJF 13抗枯草芽孢杆菌剂对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径平均为18.0mm。

平板抑菌试验表明该制剂对抗枯草芽孢杆菌具有较强的抑制效果。

本发明提供了一株球毛壳菌HJF 13及其在发酵制备抗枯草芽孢杆菌剂中的应用，利用本发明生产的制剂对枯草芽孢杆菌具有较好的抑制活性，可用于制备抗枯草芽孢杆菌剂。本发明具有高效、低毒、原料成本低及生产工艺简单的优点，在日化产品、食品及工业产品等领域中具有潜在和实际的应用价值。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：

实施例一：球毛壳菌HJF 13(Chaetomium cochliodes HJF 13)的鉴定

采用常规CTAB法提取菌株的DNA，采用真菌通用引物ITS1和ITS4扩增ITS序列，PCR产物送由北京擎科(昆明)新业生物科技有限公司进行测序，将测序得到的DNA序列在NCBI数据库中进行BLAST搜索比对，菌株的ITS序列与球毛壳菌有效发表种Chaetomiumcochliodes HMAS:244354相似性为100％，因此，将菌株命名为球毛壳菌HJF 13(Chaetomium cochliodes HJF 13)，该菌株已于2021年4月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M2021343。

实施例二：微生物抗枯草芽孢杆菌剂的制备方法

1、试管种培养

将菌株HJF 13接种到试管固体培养基斜面上，于28℃下培养6天，获得试管种。固体培养基为常用的PDA培养基，方法是马铃薯200g去皮后切成小块，加水1000ml煮沸20分钟后过滤，得到的滤液中加入葡萄糖20g，琼脂15g，加水定容至1000ml，121℃灭菌30 分钟。

2、液体种子培养

采用500ml三角瓶摇瓶培养，方法是先配制液体种子培养基，液体种子培养基为常用的 PDB培养基，方法是：马铃薯200g去皮后切成小块，加水1000ml煮沸20分钟后过滤，得到的滤液中加入葡萄糖20g，加水定容至1000ml，在每个三角瓶中装入100ml液体种子培养基，121℃灭菌30分钟。冷却后接入1cm

3、制备抗枯草芽孢杆菌剂

采用1000ml三角瓶摇瓶培养，方法是先配制液体发酵培养基，液体发酵培养基为常用的 PDB培养基，制作方法同上述液体种子培养基的制作方法，在每个三角瓶中装入200ml液体发酵培养基，121℃灭菌30分钟，冷却后接入20ml上述方法2中得到的种子液，28℃下于转速为220rpm的摇床上培养7天得菌株发酵液。在发酵液中加入等体积乙醇，经摇床振荡6小时后滤去菌丝体，蒸去发酵液中的乙醇得到菌株发酵提取物，将发酵提取物用水稀释到原发酵液体积，即成为可供使用的抗枯草芽孢杆菌剂。

实施例三：平板抑菌试验

1、制备试验用微生物抗枯草芽孢杆菌剂

本发明的微生物抗枯草芽孢杆菌剂，由球毛壳菌HJF 13(Chaetomium cochliodesHJF 13)菌株通过液体发酵方法制备。具体制备过程及条件与发明内容描述部分相同。

2、枯草芽孢杆菌的培养

将枯草芽孢杆菌接种到试管斜面培养基上25℃下培养5-6天，待菌体生长好备用。培养基为常规ISP2培养基，其配方为：酵母粉4g；葡萄糖4g；麦芽膏10g；水1000ml，在该培养基中加入琼脂粉15g，121℃灭菌30分钟。

3、平板抑菌试验方法

将培养好的枯草芽孢杆菌取0.5cm

表1.微生物抗枯草芽孢杆菌剂对枯草芽孢杆菌的抑菌结果

实验结果表明：菌株HJF 13抗枯草芽孢杆菌剂对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径平均为 18.0mm。