一种利用核卫星结构多联检测miRNA的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用核卫星结构多联检测miRNA的方法。

背景技术

质谱作为一种免标记的分析技术，可以直接给出待测物分子量这一本征信息。同时，质谱给出的精确分子量信息不仅提升了定性的准确性，也有效避免了多目标物同时检测中可能出现的谱峰重叠干扰。质谱分析技术强大的分子信息获取和多组份分析能力为复杂体系中多目标物的精准测定提供了可能，这也与细胞内多酶活性评估的需求相契合。近年来，有许多研究学者提出了利用质谱技术来检测各种小分子物质的方案。2008年,Vincent Rotello教授课题组率先提出了一种“质量条形码”策略，利用金纳米颗粒表面组装的烷基硫醇分子在激光辐照下的高效解吸电离能力，将不同烷基硫醇的精确分子量作为“条形码”用于专一指示其对应修饰的金纳米颗粒，首次利用质谱技术对不同纳米颗粒的细胞摄取量进行定量分析。(Zheng-Jiang Zhu，Partha S.Ghosh，Oscar R.Miranda，RichardW.Vachet，Vincent M.Rotello.J.Am.Chem.Soc.2008，130，14139-14143)

以此为基础，2020年南京大学朱俊杰教授课题组报道了一种以多重和定量的方式揭示级联的胱天蛋白酶在细胞凋亡中的活性的方案，一系列质量标记修饰的金纳米颗粒(AuNP)通过包含目标蛋白酶底物肽的连接子拴在磁性Fe3O4纳米球上，形成“一对多”核心-卫星结构。该纳米结构被内化到细胞中，在细胞内进行酶促反应，并在从细胞中磁分离后进行反应后质谱分析(MS)询问。(Hongmei Xu，Xiaodan Huang，Zhenzhen Zhang，XuemengZhang，Qianhao Min*and Jun-Jie Zhu，Chem.DOI:10.1039/d0sc01534b3)

大多数基于MALD质谱技术进行检测的都是人体内的某些蛋白质，如背景信息中对胱天蛋白酶在细胞凋亡中的活性的测试，对人体内一些调控基因表达的核酸结构鲜有报道，实际上，MicroRNA也可以精细调控基因的表达，因此提出一种简便快捷的方案来进行MicroRNA的测试也是十分必要的。

MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。

目前，缺乏一种利用核卫星结构多联检测miRNA的方法。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中的问题，提供了一种利用核卫星结构多联检测miRNA的方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：本发明的一种利用核卫星结构多联检测miRNA的方法，包括如下步骤：

(1)取出20～40μL磁珠，吸取上清液后用12.5mM Mg

(2)已修饰DNA的金球与三种烷基硫醇，按照浓度比1：2000～1:3000的比例混合，将miRNA链设置在摇床上，反应温度为20℃，反应转速为1250～1500rpm，反应时间为6～12h，然后通过在18000～20000rcf转速下离心去除过量未连接的烷基硫醇分子并用0.1MPBS缓冲液洗涤2～3次；

(3)取已修饰DNA的磁珠并加入过量已修饰烷基硫醇分子mass tag的金球，并在摇床上以37℃，反应转速为1050～1250rpm，反应时间为6～12h，反应结束后洗涤上清液并进行MALDI检测；

(4)链置换反应：按照Biotin DNA:置换链为1：0.05～1：1的比例加入置换链，即需要检测的miRNA链，，将miRNA链设置在摇床上，反应温度为25℃，反应转速为400rpm～600rpm，反应时间为3～6h，反应结束后洗涤上清液并进行MALDI检测；

(5)MALDI检测：将1μL分析物与0.5μL DHB基质溶液混合，然后将1μL该混合物沉积在384孔不锈钢靶板上，待到风干后将不锈钢靶板放入4800Plus MALDI-TOF/TOF质谱仪进行测试并得到相应的质谱数据。

进一步地，所述的0.1M PBS磷酸缓冲盐溶液为0.1M NaCl，10mM磷酸盐。

进一步地，所述的三种烷基硫醇分别为Mass tag 1[HS-(CH

更进一步地，在步骤(2)中，反应时间为12h。

进一步地，在步骤(2)中，反应时间为12h。

进一步地，在步骤(4)中，反应转速为500rpm。

有益效果：本发明通过MALDI质谱测试，可以检测出样品中含有的miRNA的种类，并且可以同时独立的检测3种miRNA的种类与含量多少。实验结果探究得出，miRNA的检测限浓度能够达到pM级别，灵敏都特别高。

(1)本发明修饰不同种烷基硫醇分子(mass tag)的金球(本发明为3种)与磁珠之间的组装，磁珠-金球组装体即为本发明中的“核-卫星结构”；miRNA的置换作用：每种miRNA可以将核-卫星结构中相应的卫星金球置换下来，在之后的MALDI质谱检测中也会以相应信号的有无或者强弱来判定miRNA的有无与量的多少；MALDI检测：MALDI检测中需要引入对照组，即未加入miRNA进行链置换反应的control组。

(2)本发明旨在开发一种miRNA响应性核-卫星结构“质量条形码(mass tag)”纳米探针，来探测人体细胞内miRNA的种类与含量，这些均可通过质谱信号的有无与强弱反映出来。

附图说明

图1为本发明的MALDI质谱测试图；在检测物为修饰有mass tag 3的金球时，MALDI质谱图中出现横坐标为957的信号峰(957为mass tag 3相对分子质量，同样的，693与781分别为mass tag 1与mass tag 2相对分子质量)，横坐标表示mass tag的类型，纵坐标表示信号强弱，信号越强，含量越高。

图2为本发明的miRNA的检测图。其中，(A)未加入检测物，(B)加入的检测物中只含有miR-155，(C)加入的检测物中含有miR-155与miR-16，(D)检测物中含有miR-155，miR-16，miR-let7。

注释：不同的miRNA加入后会置换出对应的金球，金球上连接的mass tag种类是固定的，因此不同金球的置换反应在质谱信号中就是其上mass tag信号的缺失。

图3为本发明的检测物中miR-155的含量对质谱信号的影响图；用957的信号与加入的内标869信号的比值q来标定；(A)未加入检测物的对照组，q为100％(B)检测物中miR-155浓度为0.5μM，q＝0％，(C)检测物中miR-155浓度为1nM，q为82％，(D)检测物中miR-155浓度为500pM，q为100％。

图4为本发明的磁球与修饰有不同mass tag的金球之间的组装示意图；其中miR-let 7可以置换修饰有693信号的金球；miR-16可以置换修饰有781信号的金球；miR-155可以置换修饰有957信号的金球。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1

结构组成：1μm直径的磁珠，10nm直径金球，miRNA-155，miRNA-let7，miRNA-16，烷基硫醇分子(mass tag)；

本发明的一种利用核卫星结构多联检测miRNA的方法，包括如下步骤：

(1)取出20μL磁珠，吸取上清液后用12.5mM Mg

(2)已修饰DNA的金球与三种烷基硫醇，按照浓度比1：2500的比例混合并在摇床上以20℃，1400rpm的条件反应9h，然后通过在19000rcf转速下离心去除过量未连接的烷基硫醇分子并用0.1M PBS缓冲液洗涤2.5次；

(3)取已修饰DNA的磁珠并加入过量已修饰烷基硫醇分子mass tag的金球，并在摇床上以37℃，1000rpm的条件下反应，反应时间为12h，反应结束后洗涤上清液并进行MALDI检测；

(4)链置换反应：按照Biotin DNA:置换链为1：0.05的比例加入置换链，即需要检测的miRNA链，并在摇床上以25℃，500rpm的条件反应5h，反应结束后洗涤上清液并进行MALDI检测；

(5)MALDI检测：将1μL分析物与0.5μL DHB基质溶液混合，然后将1μL该混合物沉积在384孔不锈钢靶板上，待到风干后将不锈钢靶板放入4800Plus MALDI-TOF/TOF质谱仪进行测试并得到相应的质谱数据。

实施例2

实施例2与实施例1的区别在于：本发明的一种利用核卫星结构多联检测miRNA的方法，包括如下步骤：

在步骤(1)中，取出40μL磁珠，吸取上清液后用12.5mM Mg

在步骤(2)中，已修饰DNA的金球与三种烷基硫醇，按照浓度比1:3000的比例混合并在摇床上以20℃，1500rpm的条件反应6h，然后通过在18000rcf转速下离心去除过量未连接的烷基硫醇分子并用0.1M PBS缓冲液洗涤3次；

在步骤(3)中，取已修饰DNA的磁珠并加入过量已修饰烷基硫醇分子mass tag的金球，并在摇床上以37℃，1250rpm的条件下反应，反应时间为6h，反应结束后洗涤上清液并进行MALDI检测；

在步骤(4)中，链置换反应：按照Biotin DNA:置换链为1：1的比例加入置换链，即需要检测的miRNA链，并在摇床上以25℃，600rpm的条件反应6h，反应结束后洗涤上清液并进行MALDI检测。

实施例3

实施例3与实施例1的区别在于：本发明的一种利用核卫星结构多联检测miRNA的方法，包括如下步骤：

在步骤(1)中，取出30μL磁珠，吸取上清液后用12.5mM Mg

在步骤(2)中，已修饰DNA的金球与三种烷基硫醇，按照浓度比1：2000的比例混合并在摇床上以20℃，1250rpm的条件反应12h，然后通过在20000rcf转速下离心去除过量未连接的烷基硫醇分子并用0.1M PBS缓冲液洗涤2次；

在步骤(3)中，取已修饰DNA的磁珠并加入过量已修饰烷基硫醇分子mass tag的金球，并在摇床上以37℃，1050rpm的条件下反应，反应时间为9h，反应结束后洗涤上清液并进行MALDI检测；

在步骤(4)中，链置换反应：按照Biotin DNA:置换链为1：0.08的比例加入置换链，即需要检测的miRNA链，并在摇床上以25℃，400rpm的条件反应3h，反应结束后洗涤上清液并进行MALDI检测。

试验例

如图1所示，检测物的有无与含量的多少可以从MALDI质谱图中反应出来，图1显示直接测试修饰有mass tag 3的金球，MALDI质谱图中将出现横坐标为957的信号峰，横坐标957即代表mass tag 3，纵坐标代表信号强度，信号越强，待测物含量越高。

MALDI质谱图信号解读：在本实施例中，一共会在MALDI质谱图中出现3种特征峰，其横坐标依次为693(mass tag 1)，781(mass tag 2)，957(mass tag 3)，代表修饰在金球表面的mass tag的类型，纵坐标为峰值，峰值越高代表信号越强，说明检测物中的mass tag含量越高，图2A显示核—卫星结构的MALDI质谱图，在未加入检测物时，出现693，781，957三种不同信号，说明修饰有3种不同mass tag的金球成功与磁球连接，图2B中出现693，781信号，说明检测物中含有miR-155,成功发生链置换反应将修饰957mass tag的金球从核-卫星结构中置换下来导致957信号的缺失，同理，图2C中693与957信号的缺失说明待测物中含有miR-155与miR-let7，图2D中三种信号均缺失说明待测物中含有miR-155，miR-16与miR-let7三种miRNA；

图3是进行miRNA的检测限探究，在进行MALDI测试之前，在所有的样品中加入相同物质的量的mass tag 4(869)，用957的信号与加入的内标869信号的比值q来标定。图3A显示在核-卫星结构中加入内标869后，MALDI质谱图中出现693，781，957，869四种信号，此时规定q＝100％,图3B,3C,3D显示miR-155的浓度分别为0.5μM，1nM，500pM时q值为0％,82％,100％,得出检测限为500pM，即当待测物中含有500pM以上的miRNA时即可从质谱图中得出miRNA的种类与相对含量。

所述的0.1M PBS磷酸缓冲盐溶液为0.1M NaCl，10mM磷酸盐。

所述的三种烷基硫醇分别为Mass tag 1[HS-(CH

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。