一种发根农杆菌介导的菜用豌豆遗传转化体系建立的方法

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，属于一种发根农杆菌介导的菜用豌豆高效遗传转化体系建立的方法，尤其是一步法建立发根农杆菌介导的菜用豌豆高效遗传转化体系的方法。

背景技术

豌豆(Pisum.sativum L.)是世界第二大食用豆类作物，根据用途可分为粮用豌豆(干豌豆)、食用嫩豆粒的菜用豌豆(甜豌豆、青豌豆)及食用嫩荚的菜用豌豆(荷兰豆)。我国青豌豆的总产量居世界首位，在世界豌豆生产中占有重要的地位。豌豆具有固氮能力，是一种环境友好型作物，具有减肥增效、改良土壤等作用，在我国可持续发展农业系统中发挥重要作用。2019年，法国学者报道了第一个注释的染色体级别的豌豆参考基因组，基因组大小约4.45Gb，由7对同源染色体组成(2n＝2x＝14)，将加速功能基因的挖掘利用及遗传改良。

转基因技术是研究植物基因功能及其作用机制的重要手段，也是性状改良的途径之一，目前应用最为广泛的转基因方法主要是农杆菌介导法，其中包括根癌农杆菌介导法和发根农杆菌介导法。现已报道的由根癌农杆菌介导的豌豆及其它多数豆类的转基因转化周期长，污染率高，转化率低下，基因稳定转化难度很高，因此利用发根农杆菌诱导形成携带目标基因的毛状根这一策略已在大豆、菜豆等豆科作物中得到广泛应用。该技术的一般原理是利用发根农杆菌诱导植物地下部分形成转基因发状根，从而获得一种组合苗(composite plants)，其地下部分是转化体，地上部分是非转化体。发根农杆菌介导法包括两步法和一步法。现已有报道通过发根农杆菌介导豌豆毛状根遗传转化技术获得转基因发状根组合苗，如附说明书附图1(Irina et al.,2019)，这一方法属于两步法。一步法相比两步法，转化周期进一步缩短，污染率进一步降低，提高了实验操作的便捷性。一步法策略目前仅在梨和大豆有报道(Mandal et al.,2019；Fan et al.,2020)，在豌豆上尚未见相关报道。此外，与大豆种子发芽生长过程中子叶出土不同，豌豆种子在发芽生长过程，子叶不出土。因此，有必要针对菜用豌豆建立一种高效的发状根转基因体系，要求操作简便、成本低廉、转化效率高、重复性好、试验周期短、污染率低。本发明拟建立一步法发根农杆菌介导的菜用豌豆高效遗传转化体系的方法，优化组合出具有较高转化率和生根率的最佳切割位置、苗龄和培养时间，以进一步节约实验成本，缩短试验周期，降低污染率，提高实验操作的便捷性。

发明内容

本发明针对现有两步法豌豆发状根遗传转化体系的诸多缺点，以及现有体系未对菜用豌豆的毛状根生根率和阳性率及最佳切割位置、苗龄和培养时间进行优化组合等问题，通过一步法诱导豌豆发状根遗传转化及优化组合切割位置、苗龄和培养时间，提供一种一步法建立发根农杆菌介导的菜用豌豆高效遗传转化体系的方法，为菜用豌豆功能基因组研究提供技术支持。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种发根农杆菌介导的菜用豌豆遗传转化体系建立的方法，包括如下步骤：

1)外植体获取:对菜用豌豆种子作消毒无菌处理，并播于基质中并浇透无菌水，光照培养箱培养；生长5-9天后，在植株子叶节的上端或下端沿斜下45度角将植株切断，获得地上部分待侵染外植体；

2)侵染：用菌糊对所述待侵染外植体切割产生的伤口进行裹菌，所用的菌种为发根农杆菌AR1193；接着，将已裹菌的外植体种植于基质，加入浇5ml包含发根农杆菌AR1193的液体培养基；

3)发状根诱导及组合苗形成：侵染后的所述外植体，避光黑暗培养24h；之后转移至光照培养箱培养，整个过程用塑料罩密封保湿，培养10-18天；然后继续培养两周，提前两天打开塑料罩上的通风孔缓慢降低湿度，接着完全移除塑料罩，获得生长健壮的组合苗。在该步骤用于促进毛状根的产生。

作为优选，步骤1所述的植株子叶节的上端指紧邻植株子叶的交界处上端；所述下端指紧邻植株下胚轴交界处的上端。

作为优选，所述步骤1中生长时间优选7天；所述步骤3)中培养时间优选18天。

作为优选，步骤1或2中所述基质的配制方法为：蛭石和草炭按照3比1的质量比例混合，在121℃，20min高压灭菌。

作为优选，步骤2所述发根农杆菌AR1193携带含GUS报告基因的双元表达载体pCAMBIA3301。

作为优选，步骤2所述菌糊刮取自发根农杆菌AR1193的TY固体培养基；所述发根农杆菌AR1193的TY固体培养基通过下述方法制备：取200μL发根农杆菌菌株AR1193甘油菌划线涂板于TY固体培养基，并于28℃恒温培养箱中倒置培养48h；其中所述TY固体培养基含50mg/L Kan。

作为优选，步骤2所述包含发根农杆菌AR1193的液体培养基通过以下方法制备：取10μL发根农杆菌菌株AR1193甘油菌接种到1mL的TY液体培养基，于28℃恒温培养箱中以180rpm的转速培养12h；再取200μL发根农杆菌菌液接种到200mL TY液体培养基中，在28℃摇床上过夜震荡，培养至OD600＝0.6-1.0；所述TY液体培养基含50mg/L Kan。

作为优选，步骤1所述消毒无菌处理具体为用75％的次氯酸钠对所述菜用豌豆种子消毒15min，无菌水冲洗5-6遍。

作为优选，步骤1或2中所述光照培养箱的培养温度控制在22℃，光周期为16h光照，8h黑暗。

作为优选，步骤1所述菜用豌豆种子为成熟无病虫害的种子。

与传统的两步法发根农杆菌介导毛状根遗传转化技术相比，本方案缩短了试验周期，降低了污染率，节约了实验成本，使实验操作更高效更快捷。在本发明中，利用一步法诱导菜用豌豆形成毛状根，在很大程度上缩短了试验周期，大大降低了试验过程中出现污染的风险，节约了毛状根诱导的成本，具有较高的稳定性和重复性。

本方案优化组合了菜用豌豆浙豌1号材料的毛状根诱导条件，比较后得出具有较高生根率和转化率的最佳切割位置、苗龄和培养时间。将本发明首次建立的一步法发根农杆菌介导的菜用豌豆高效遗传转化体系，为高效开展菜用豌豆转基因基因功能研究奠定了基础。

因此，本发明具有如下有益效果：(1)缩短试验周期，降低了污染率，提高了实验操作的便捷性，节约了实验成本；(2)优化组合出具有较高转化率和生根率的最佳切割位置、苗龄和培养时间。

附图说明

图1是利用两步法发根农杆菌诱导豌豆形成毛状根示意图。

图2是本发明的菜用豌豆植株在基质中生长状态示意图。

图3是本发明的菜用豌豆地上部分外植体准备、侵染及组合苗发状根形成示意图。

图4是本发明的菜用豌豆经过发根农杆菌AR1193(携带含GUS报告基因的双元表达载体pCAMBIA3301)侵染后发状根中的GUS基因RT-PCR检测结果示意图。

图5是本发明的不同苗龄(5天、7天、9天)不同切割位置(子叶上端和下端)菜用豌豆外植体侵染后培养18天获得毛状根的生长状态示意图。

具体实施方式

以下将通过实施例来详细说明本申请的实施方式，借此对本申请如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

本申请中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备，均来自市售产品。本申请中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例

1)菜用豌豆地上部分外植体的准备；

挑选成熟无病虫害的菜用豌豆种子，用75％的次氯酸钠消毒15min，无菌水冲洗5-6遍，播于基质中(基质的配制：将蛭石和草炭按照3比1的比例混合，121℃，20min高压灭菌，浇透无菌水)，放置在光照培养箱(22℃，光周期16h光照/8h黑暗)中培养。生长一周左右(5天、7天、9天)，分别在紧邻植株子叶的上端和下端将植株切断，获得菜用豌豆地上部分外植体。

2)AR1193发根农杆菌菌株的活化及培养；

①取200μL发根农杆菌菌株AR1193甘油菌(携带含GUS报告基因的双元表达载体pCAMBIA3301)重新划线涂板TY(含50mg/L Kan)固体培养基，并于28℃恒温培养箱中倒置培养48h，备用。

②取10μL发根农杆菌菌株AR1193甘油菌(携带含GUS报告基因的双元表达载体pCAMBIA3301)接种到1mL的TY(含50mg/L Kan)液体培养基，于28℃恒温培养箱中以180rpm的转速培养12h；再取200μL发根农杆菌菌液接种到200mL TY(含50mg/L Kan)液体培养基中，在28℃摇床上过夜震荡，培养至OD600＝0.6-1.0，备用。

3)菜用豌豆地上部分外植体的侵染及组合苗的获得；

将步骤1中的菜用豌豆地上部分外植体从步骤2中①TY固体培养基上刮取表面的菌糊，对切割产生的伤口进行裹菌；接着，将已裹菌的外植体种植于基质(基质的配制：将蛭石和草炭按照3比1的比例混合，121℃，20min高压灭菌，浇透无菌水)，浇5ml步骤2中②TY液体培养基，整个过程在无菌环境下操作；随后，避光黑暗培养24h,之后转移至光照培养箱，22℃，16h光照/8h黑暗光周期培养，整个过程用塑料罩密封保湿；培养两周左右(10天、14天、18天)，观察毛状根数量并进行GUS染色。两周之后，前两天通过打开塑料罩上的通风孔缓慢降低湿度，接着完全移除塑料罩，获得生长健壮的组合苗。

按步骤对菜用豌豆浙豌1号材料进行发状根诱导，统计不同切割位置、苗龄和培养时间的平均生根数和阳性率，并进行差异显著性分析，通过综合比较后筛选出诱导发状形成的最佳切割位置、苗龄和培养时间。其中，结果如表1及图1-5所示。

表1是本发明的不同苗龄(5天、7天、9天)不同切割位置(子叶上端和下端)菜用豌豆外植体侵染后培养不同时间(10天、14天、18天)获得总毛状根数量、生根诱导率及阳性率分析结果。

表1不同苗龄不同切割位置菜用豌豆外植体侵染后培养不同时间获得总毛状根数量和生根诱导率分析

注：表中同列数据后无相同小写字母的表示差异显著(P<0.05)。

表2 GUS检测引物序列

表2为使用RT-PCR方法检测侵染后发状根中的GUS基因时，所用的引物序列。

图1及图2分别是两步法及本发明的发根农杆菌诱导豌豆形成毛状根及豌豆植株的示意图。

在图3中，A为菜用豌豆最佳苗龄(7天)植株生长状态及地上部分外植体的获取方式(上箭头所指为子叶的上端切割位置，下箭头所指为子叶的下端切割位置)；B为发根农杆菌AR1193(携带含GUS报告基因的双元表达载体pCAMBIA3301)固体平板的获得；C为发根农杆菌AR1193(携带含GUS报告基因的双元表达载体pCAMBIA3301)菌液的获得；D为菜用豌豆地上部分外植体切割产生伤口的裹菌方式；E为已裹菌的外植体播种于无菌基质后浇菌方式；F为侵染后菜用豌豆外植体塑料罩密封保湿培养；G为菜用豌豆组合苗形成的发状根；H为经过发根农杆菌AR1193(携带含GUS报告基因的双元表达载体pCAMBIA3301)侵染后发状根GUS染色结果。

图4中，A为菜用豌豆组合苗形成的所有发状根GUS染色情况；B中M为天根生化科技有限公司的D2000 DNA Marker，1-5为AR1193-pCAMBIA3301侵染后转基因发状根，6为AR1193-pCAMBIA3301菌株，7-9为AR1193-pCAMBIA3301侵染后非转基因发状根，10为AR1193菌株，11为H

图5是本发明的不同苗龄(5天、7天、9天)不同切割位置(子叶上端和下端)菜用豌豆外植体侵染后培养18天获得毛状根的生长状态示意图。

上述实验结果可得出，最佳切割位置是子叶的下端、苗龄是7天和培养时间是18天，毛状根诱导率是100％，平均生根数为14.4，毛状根阳性率为35.2％。

与传统的两步法发根农杆菌介导毛状根遗传转化技术相比，本方案缩短了试验周期，降低了污染率，节约了实验成本，使实验操作更高效更快捷。在本发明中，利用一步法诱导菜用豌豆形成毛状根，在很大程度上缩短了试验周期，大大降低了试验过程中出现污染的风险，节约了毛状根诱导的成本，具有较高的稳定性和重复性。

本申请还存在其它多种可实施的技术方案，在此不做一一列举，本申请权利要求中要求保护的技术方案都是可以实施的。

本申请说明书中未作详细描述的内容属于本领域技术人员的公知常识。

如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。

还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。

上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申请所附权利要求的保护范围内。