用于检测碱性磷酸酶的单分子荧光生物传感器及其方法

技术领域

本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种ALP超灵敏单分子荧光生 物传感器。

背景技术

碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的荧光测定法通常需要复杂 和昂贵的程序来合成荧光纳米材料或小分子荧光探针。此外，非核酸分子如酚 酞磷酸、对苯二酚二磷酸、多肽、对硝基苯基磷酸(PNPP)、焦磷酸、鸟嘌呤 一磷酸、三磷酸腺苷等常被用作ALP的底物，但它们不像DNA或RNA一样容易 扩增，因此，这些检测方法的灵敏度较低，无法准确检测罕见样品中低丰度的 ALP靶点。为了解决这一问题，已发展了多种核酸信号扩增的方法用于ALP的 检测，但需要多种特异性酶触发扩增系统，如DNA连接酶介导的连接酶扩增反应，DNA、RNA聚合酶和Cas13a核酸酶介导RNA转录偶联环状切割反应，RNA 聚合酶和双特异性核酸酶介导的RNA转录诱导双信号放大，以及DNA聚合酶和 内切酶介导的指数信号放大，然而上述方法势必会增加实验成本，使反应过程 复杂化。此外，酶活性的不稳定性和非特异性扩增也会极大地影响分析的准确 性和重现性。

因此，非常需要开发一种操作简单，经济有效，特异性强和超灵敏的ALP 的测定方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明构建了一种新型的单分子荧光生物传感器用 于ALP检测，可准确、灵敏地监测细胞和血清样品中的碱性磷酸酶水平。该生物 传感器中涉及的所有探针都是商业可用的，避免了制备功能性荧光纳米材料或 小分子荧光探针的昂贵和费力的步骤。该生物传感器的信号扩增和转导通过无 酶组装和拆卸过程实现，大大简化了检测方案，降低了检测成本，减少了非特 异性信号。结合单分子检测技术，ALP活性可在单分子水平超灵敏准确检测，检 出限为2.61×10

一种用于检测碱性磷酸酶的单分子荧光生物传感器，其包括：在3'端标记 生物素的5'磷酸化的单链DNA、发夹探针1(HP1)、发夹探针2(HP2)、 链霉亲和素偶联磁珠、氢氧化钠溶液；其中，发夹探针1(HP1)和发夹探针 2(HP2)为Cy5标记的发夹探针1(HP1)和发夹探针2(HP2)；单链DNA 和发夹探针1(HP1)和发夹探针2(HP2)通过链置换反应形成探针·HP1·HP2 三重链。

所述单链DNA从5'端到3'端的序列为：P-AGT CTA GGA TTC GGC GTG GGT TAA TTTTTT-Biotin；

发夹探针1(HP1)从5'端到3'端的序列为：TTA ACC CAC GCC GAA TCC TAG ACTCAA AGT AGT CTA GGA TTC GGC GTG-Cy5；

发夹探针2(HP2)从5'端到3'端的序列为：AGT CTA GGA TTC GGC GTG GGT TAACAC GCC GAA TCC TAG ACT ACT TTG-Cy5。

进一步的，所述氢氧化钠溶液浓度为1.5-2mol/L，优选1mol/L。

进一步的，单分子荧光生物传感器包括λexo酶。

一种利用单分子荧光生物传感器的碱性磷酸酶检测方法，包括如下步骤：

(1)将含碱性磷酸酶的待测物、在3'端标记生物素的5'磷酸化的单链DNA 和缓冲液混合，在适当温度下进行孵育；(2)然后加入λexo酶在适当温度 下反应；(3)将反应得到的消化产物加入到含有杂交缓冲液、HP1和HP2的 溶液中，在适当温度下反应；(4)随后加入链霉亲和素偶联磁珠捕获杂交产 物，并通过磁分离去除未反应的HP1和HP2；(5)用反应缓冲液洗涤后，加 入NaOH溶液反应，诱导DNA链解体，得到含有游离HP1和HP2的上清液， 用于进一步测定。

进一步的，所述步骤(1)中，在3'端标记生物素的5'磷酸化的单链DNA 的浓度为200-300纳摩尔每升，优选250纳摩尔每升；缓冲液为10×CutSmart 缓冲液；在37℃下孵育30-50分钟，优选40分钟；

进一步的，步骤(2)中，λexo的用量为3-5U，优选4U；在37℃下 反应20-40分钟，优选30分钟。

进一步的，步骤(3)中，杂交缓冲液由50毫摩尔每升Na

进一步的，步骤(4)中，链霉亲和素包覆的磁珠的用量为4-6微升，优 选5微升。

进一步的，步骤(5)中，加入含1摩尔每升NaOH的蒸馏水50微升，反 应5分钟，诱导DNA链解体。

有益效果

该生物传感器中涉及的所有探针都是商业可用的，避免了制备功能性荧光 纳米材料或小分子荧光探针的昂贵和费力的步骤。与基于酶辅助核酸扩增的碱 性磷酸酶(ALP)检测方法相比，该生物传感器的信号扩增和转导通过无酶组 装和拆卸过程实现，大大简化了检测方案，降低了检测成本，减少了非特异性 信号。结合单分子检测技术，ALP活性可在单分子水平超灵敏准确检测，检出 限为2.61×10-6U/mL。此外，该生物传感器可用于ALP抑制试验和动力学分 析，适用于人体细胞和临床血清样品中内源性ALP水平的准确检测，且样品 消耗量小，为ALP相关的临床应用和基础生物学研究提供了可替代平台。

附图说明

图1：本发明基于去磷酸化引发的荧光DNA链组装和拆卸用于碱性磷酸酶 测定的原理图。

图2：本发明检测方法可行性试验结果图；其中，A图为聚丙烯酰胺凝胶 电泳分析检测探针的消化；泳道M：DNA标记；泳道1：λexo；泳道2：λexo +ALP；DNA标记物和反应产物均用SYBR金染料进行染色。B图为聚丙烯酰胺凝 胶电泳分析荧光DNA链的组装。泳道M：DNA标记；泳道1：探针；泳道2：探 针+ALP；泳道3：λexo+ALP；DNA标记用SYBR金染色，杂交产物无染色。C 图为不存在(对照)和存在ALP时的磁珠成像。比例尺＝10微米。D图为存在或 不存在(对照)ALP的荧光光谱。B–D实验所用量为0.1U/mL ALP,4Uλexo, 250纳摩尔检测探针，400纳摩尔HP1和400纳摩尔HP2。

图3：单分子荧光检测可行性试验结果图；其中，A图为对存在ALP和不 存在ALP的对照组的单个Cy5分子的成像；比例尺＝5微米；B图为Cy5计数 对存在或不存在ALP(对照)孵育时间响应的方差。ALP用量为0.1U/mL。

图4：灵敏度分析结果图；其中，A图为Cy5计数对ALP从0到2U/mL不 同浓度的响应；插图显示Cy5计数与ALP浓度的对数在1×10

图5：特异性分析结果图；其中，A图为初始速率随检测探针浓度从1增 加到250nM的变化。B图为在10～400μM范围内，随着Na

图6：实际样品检测结果图；其中，A图为分别响应对照，HEK，HEK+Na

图7：临床血清样本的检测结果图；其中，A图为临床血清标本中ALP水 平的测定。B图为Cy5计数对0到1μL血清中的响应。

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施 例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚地描述，显然，所描述 的实施例是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其 他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

本发明的原理(如图1所示)为，先设计了一个在3'端标记生物素的5' 磷酸化的单链DNA作为ALP的检测探针和杂交链反应的启动子。在不存在 ALP的情况下，探针将被λ外切酶(λexo)从5'端到3'端完全消化，由于缺 乏引发剂，则不会发生杂交链式反应。相反，靶ALP存在时将催化检测探针 去磷酸化，从而去除5'磷酸基团，可有效保护检测探针免受λ外切酶的破坏。 检测探针的a*结合发夹探针1(HP1)的支点域a(GGA TTC GGC GTG)，触发 支点介导的DNA置换，随着支点域cb*(GAA TCC TAG ACT CAA AGT AGT CTA)的 暴露形成稳定的探针·HP1双工链，随后HP2的c*(AGT CTA GGA TTC)与探针 HP1双链的c(GAA TCC TAGACT)结合，引发链置换反应，形成探针·HP1·HP2 三重链。因此，HP2的支点域b*(TAG ACTACT TTG)暴露出来，与探针序列相 同，可以与新的HP1结合，触发下一轮杂交反应。由于HP1和HP2之间的高 效杂交，产生一个长荧光DNA链探针·(HP1·HP2)

该方法在单细胞水平和临床血清样本中均可用于实际样品中ALP的灵敏定 量，在早期临床诊断中具有巨大潜力。此外，该方法可用于酶动力学参数的测 定和ALP抑制剂的筛选，在生物医学研究，药物发现和临床诊断中具有巨大的 应用潜力。

药品及材料。所有寡核苷酸均由上海生工生物技术有限公司(中国，上海) 合成。碱性磷酸酶(ALP)，λ核酸外切酶(λexo),尿嘧啶-DNA糖基化酶 (UDG),CpG甲基转移酶(M.SssI)和链霉亲和素磁珠从新英格兰生物实验 室(伊普斯威奇，马萨诸塞州，美国)购买。牛血清白蛋白(BSA)、葡萄糖 氧化酶(GOX)和钒酸钠(Na

ALP的检测。检测探针由ALP介导的去磷酸化反应，在10微升反应体系中 包含不同浓度的ALP、250纳摩尔每升引物和1微升10×CutSmart缓冲液，在37℃下孵育40分钟。然后将4Uλexo添加到反应溶液中，在37℃下反应 30分钟。将消化产物加入含有10微升的5×杂交缓冲液(50毫摩尔每升Na

荧光测量。50微升反应产物在FLS-1000荧光光谱仪(英国利文斯顿爱丁 堡仪器有限公司)上使用痕量石英比色皿测量。设置激发和发射狭缝宽度为4 纳米，激发波长设置为635纳米，测量650～750纳米内的发射光谱。

单分子检测和数据分析。通过全内反射荧光(TIRF)显微镜(尼康，Ti-E， 日本)获取单个分子的图像。反应产物用成像缓冲液(10毫摩尔每升Tris-盐 酸，pH 8.0，50毫摩尔每升氯化钾，1毫摩尔每升水溶性维生素E，5毫摩尔 每升氯化镁，pH 8.0)稀释。然后直接将10微升样品滴到盖玻片上进行全内 反射荧光单分子成像。使用红色640纳米激光源(50毫瓦,Coherent,USA) 激发Cy5，通过100×物镜(Olympus，Japan)收集Cy5产生的光子，最后用AndorIxon DU897EMCCD相机以500毫秒的曝光时间成像。使用image J软件选 择500×500像素大小的图像区域进行Cy5荧光团的单分子计数。

聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。对20微升的反应产物进行聚丙烯酰胺凝胶电 泳(PAGE,12％)分析，在1×TBE缓冲液中，在110V恒定电压下电泳1小时, 最后通过伯乐ChemiDoc MP成像系统(赫尔克里石，加利福尼亚，美国)获取 凝胶图像。

ALP抑制剂的检测。将不同浓度的ALP抑制剂Na

其中C

其中N

细胞培养和碱性磷酸酶提取。所有细胞(HeLa、HEK和MCF-7细胞)在37℃、 5％CO2培养箱中使用杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)，其中含有10％胎牛 血清和1％青霉素-链霉素。根据说明书使用核提取物试剂盒(ActiveMotif, Carlsbad,CA)制备细胞提取物用于ALP的活性测定。

实施例1检测方法的可行性验证

我们首先利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE,12％)分析ALP介导的 对检测探针的保护作用。反应产物用SYBR金染料染色，与核酸结合后发出强 烈的绿色荧光信号。如图2A所示，经λ外切酶处理后，在不存在ALP的情况 下，未观察到检测探针的条带(图2A,泳道1)，表明没有靶标存在时检测探 针被完全消化。相反，当ALP存在时，检测探针产生了一条明显的条带(图2A， 泳道2)，表明ALP可阻止λ外切酶对检测探针的消化。我们进一步利用PAGE 分析ALP通过直接激发Cy5引发的自组装反应(图2B)。在不存在ALP的情况 下，观察到HP1和HP2的单一条带(图2B,泳道1)，这与不含检测探针组的 情况类似(图2B,泳道2)，说明在不含ALP的情况下，检测探针完全消化， 没有发生后续的组装反应。与此相反，在ALP存在的情况下，产生了一个明显 的色散带，证明了ALP引导的荧光探针DNA链探针·(HP1·HP2)n的成功组 装。另外，荧光成像结果显示，当ALP存在时，磁珠周围产生明显的荧光信号， 而在没有ALP的对照组中，荧光信号消失(图2C)，说明ALP介导荧光DNA 链在磁珠上组装。此外，将反应产物从磁珠中分离出来，并对上清进行荧光测 量(图2D)。不存在ALP的对照组没有产生明显的荧光(图2D，黑线)，而 在ALP存在时产生了峰值波长为670纳米的强荧光发射(图2D，红线)，进 一步证实ALP对信号的有效放大。结果表明，该传感器可用于碱性磷酸酶活性 的监测。

单分子荧光检测优于传统的整体平均荧光检测，可以消除内部过滤效应， 即使在复杂的样品中，也能以高分辨率和极低的样品消耗对单个目标分子进行 可视化和定量。我们采用TIRF成像辅助单分子检测来监测ALP衍生的Cy5信 号。在640纳米的激发波长下，加入0.1U/mL的ALP可以检测到明显的Cy5 荧光信号(图3A)，而不加入ALP的对照组则没有检测到荧光信号的产生。时间 过程实验(图3B)显示，Cy5点数随着ALP孵育时间增加而增加，在40分钟后 达到饱和，对照组Cy5信号无明显升高。这些结果清楚地表明，基于单分子计数监测ALP的活性是可以实现的。

实施例2灵敏度分析

在最佳实验条件下，我们进一步通过测定不同浓度ALP产生的Cy5计数来 评估实验方法的灵敏度。随着ALP浓度从0增加到2U/mL,Cy5计数逐渐增加 (图4A)。Cy5计数与ALP浓度在1×10-5至1×10-5U/mL呈线性相关。回 归方程为N＝104.36+16.29log10 C(R2＝0.9937)，其中N为Cy5计数， C为ALP的浓度，计算出检出限为2.61×10-6U/mL(3σ/K)，明显优于其 他碱性磷酸酶测定方法。超高的灵敏度可归因于以下三点:(1)利用λ外切 酶完全消化多余的磷酸化探针，并从组装的DNA链中分离出未杂交的发夹探针， 导致低本底信号，(2)通过催化组装和拆卸过程有效的目标信号放大和转导， (3)单分子检测固有的高灵敏度。

实施例3特异性分析

我们通过计数Cy5信号对牛血清白蛋白(BSA)，葡萄糖氧化酶(GOX)， 胰蛋白酶，过氧化氢酶，CpG甲基转移酶(MSssI)，尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG) 等各种干扰酶的响应，进一步研究该生物传感器的选择性。如图3B所示，在 不添加任何酶的对照组观察到低背景信号，而靶标ALP产生明显放大的Cy5信 号，BSA、胰蛋白酶、GOX、过氧化氢酶、MSssI、UDG组无信号增加。此外，加 热后ALP产生的Cy5信号与对照组相似，说明热处理后ALP活性完全丧失。因 此，所提出的生物传感器可以精确应用于ALP检测，具有良好的特异性。

实施例4动力学分析

我们进一步将所提出的生物传感器应用于ALP酶动力学分析。在不同检测 探针浓度下测量初始速度(V)并拟合到的Michaelis-Menten方程中，V＝Vmax [S]/(Km+[S])，其中Vmax，[S]和Km分别代表最大的初始速度，检测探 针的浓度和Michaelis–Menten常数。当检测探针浓度从0增加到250纳摩尔 时，初始速度逐渐增加。Vmax为29.97每分钟，Km为260.96纳摩尔。这些结 果表明，所提出的纳米传感器适用于ALP动力学分析。

实施例5抑制剂分析

ALP抑制剂被认为是治疗各种疾病如血管平滑肌细胞钙化和心血管疾病的 有前途的药物。我们使用一种广泛的竞争性碱性磷酸酶抑制剂钒酸钠(Na3VO4) 来验证所提出的生物传感器检测碱性磷酸酶抑制剂的能力。随着Na3VO4浓度 从10μM增加到400μM，ALP的相对活性(RA)呈剂量依赖性下降(图5B)。 IC50定义为ALP活性降低至50％所需的Na3VO4浓度，根据ALP相对活性与 Na3VO4浓度拟合的校准曲线，IC50值为78.65μM，与聚合物点免疫分析(25.9 μM)和配位聚合物纳米颗粒荧光分析(148.6μM)的结果相似。结果表明， 所提出的生物传感器适用于ALP抑制剂的检测，在ALP靶向药物的开发中具有 很大潜力。

实施例6实际样品分析

细胞ALP活性异常与包括癌症在内的多种人类疾病有关，因此我们进一步 验证了所提出的生物传感器在检测细胞ALP方面的适用性。如图5所示，与没 有细胞提取物的对照组的低背景信号相比，在人胚肾HEK细胞中产生明显的 Cy5信号，在人乳腺癌MCF-7细胞和人宫颈癌HeLa细胞中Cy5信号进一步增强。 Cy5信号以HeLa＞MCF-7＞HEK的顺序不断降低，表明不同细胞系的细胞中ALP 活性水平不同，与文献报道的研究相一致，上述结果证明所提出的生物传感器 能够区分癌细胞和正常细胞以及不同类型癌细胞之间的ALP水平。此外，添加 Na3VO4处理可明显导致HEK、MCF-7和HeLa细胞产生的信号降低，表明Na3VO4 有效抑制了内源性ALP活性。Cy5计数随着HeLa细胞数量在10到10000细胞 范围内呈线性相关(图6B)。回归方程为N＝-0.0471+21.27log10X，其中 N和X分别为Cy5计数和HeLa细胞数，检出限为2个细胞。这些结果表明，所 提出的生物传感器能够灵敏、准确地检测人细胞中的内源性ALP。

我们进一步检测了临床血清样本中的ALP。5份血清标本中均可定量检测 到ALP，平均浓度为154.9U/L(图7A)，与报道的血清ALP浓度在140U/L 左右一致。在0～1微升的稀释血清中均可检测到ALP，在0.05微升的血清中 可与不含血清的对照样品区分出ALP水平。该生物传感器的样品消耗量比基于 对硝基苯基磷酸盐的比色法ALP(5微升)低100倍。这些结果表明，该生物 传感器能够检测血清ALP水平，具有较高的准确性和最小的样品消耗量。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参 照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其 依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术 特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同 替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东师范大学

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<170> PatentIn version 3.5

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