一种修复镉砷复合污染土壤的修复剂及其应用

技术领域

本发明涉及土壤重金属污染技术领域，尤其涉及一种修复镉砷复合污染土壤的修复剂及其应用。

背景技术

Cd和As的复合污染在我国南方污染土壤中非常典型，且二者的理化性质有较大差异。在土壤中，Cd通常以阳离子形式存在；As多以阴离子形式存在，如

目前，重金属的修复方法可分为物理、化学和微生物三大类。特别是微生物修复不仅具有高效、环保的特点，还能促进植物生长和改善微生物群落结构。细菌可以通过与不同重金属离子的静电作用来产生相互影响，带有不同性质的重金属之间的协同或抑制作用也会对微生物的功能和结构产生多维度的影响。因此，了解它们共存的生物地球化学行为是一个巨大的挑战，但也是非常必要的。但是，目前对重金属修复的研究主要集中在单一菌株上。例如，利用间歇吸附实验、电位滴定法、傅里叶变换红外光谱(FTIR)等方法探索单一细菌胞外聚合物对Cd或As的生物吸附。关于合成微生物学的研究主要集中在pH值、养分利用率、接种比例和运动能力等方面。有关于细菌互作对于复合污染重金属修复的报道很少。这涉及到重金属性质差异带来的协同或竞争作用，以及细菌互作带来的促进或抑制作用两对影响因素。目前已有大量研究表明单菌可以利用其胞外聚合物或相关基因固定或转化重金属，并且效果十分显著，这也为开展细菌共培养相关研究奠定了良好的基础。目前细菌共培养对重金属的生物吸附和转化效应、细菌绝对丰度以及功能基因如(arsB基因)表达的影响尚不清楚，因此我们要揭示复合污染条件下共培养体系中的机理与效果。

发明内容

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种修复镉砷复合污染土壤的修复剂，所述修复剂由铜绿假单胞菌和地衣芽孢杆菌组成。

优选的，所述铜绿假单胞菌和地衣芽孢杆菌的活菌数量比为10:1～20:1。

优选的，所述铜绿假单胞菌为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)NBRC12689，在NCBI上的基因组序列号为NR_113599.1；所述地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)P8_B2，在NCBI上的基因组序列号为CP_045814.1。

本发明还提供了一种所述的修复剂用于修复镉砷复合污染土壤的应用。

优选的，所述镉砷复合污染土壤中重金属镉和砷的质量比为0.5～100:90。

本发明提供的由铜绿假单胞菌和地衣芽孢杆菌组成的修复剂对镉砷复合污染土壤具有协同修复/还原作用，将铜绿假单胞菌和地衣芽孢杆菌在镉砷复合污染体系中共培养能够提高对Cd的修复效率和对As(Ⅴ)的还原效率。本发明的研究还表明：Cd和As两种重金属的添加分别促进了arsB基因的表达，但两种重金属的组合会减弱这种促进作用，但修复效果仍然是正向的。

因此，我们认为微生物共培养下的环境导致细菌运动和繁殖能力的差异，最终体现在重金属修复能力以及相关基因表达方面的差异。基于以上差异，导致特定细菌在共培养条件下对于重金属修复能力的提升作用大于单一细菌培养。本发明为微生物修复重金属复合污染提供了更加经济绿色的途径。

附图说明

图1为地衣芽孢杆菌共培养前后各处理下Cd的修复效率折线图；

图2为地衣芽孢杆菌共培养前后各处理下As的还原效率折线图；

图3为铜绿假单胞菌共培养前后各处理下Cd的修复效率折线图；

图4为铜绿假单胞菌共培养前后各处理下As的还原效率折线图；

图5为两株菌共培养前后地衣芽孢杆菌数量与铜绿假单胞菌数量的比值；

图6为地衣芽孢杆菌共培养前后各处理下单位细菌对Cd的修复效率折线图；

图7为地衣芽孢杆菌共培养前后各处理下单位细菌对As(Ⅴ)的还原效率折线图；

图8为铜绿假单胞菌共培养前后各处理下单位细菌对Cd的修复效率折线图；

图9为铜绿假单胞菌共培养前后各处理下单位细菌对As(Ⅴ)的还原效率折线图；

图10为两株菌共培养前后各处理下单位细菌arsB基因的表达量；

图11为两株菌中采用特异性引物验证arsB基因的电泳图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

利用平板计数和酶标仪测定两株菌的光密度，绘制被测菌的生长曲线，通过生长曲线确定两株菌株培养24h时均达到对数生长期，因此选择这一时期作为实验节点。本试验共11种重金属处理，可分为单一污染体系和复合污染体系。其中，单一污染体系包括Cd污染体系(浓度为0.5、5、10、50、100mg/L)和As污染体系(浓度为90mg/L)；复合污染体系为Cd+As污染体系(对应的Cd+As浓度为0.5+90、5+90、10+90、50+90、100+90mg/L)。

同时，设置三种细菌培养体系：地衣芽孢杆菌P8_B2纯培养体系、铜绿假单胞菌NBRC 12689纯培养体系和两株菌的共培养体系。共设33个处理，每个处理3个重复。试验在LB液体培养基中进行，各处理菌株的接种体积比例为6％(共培养体系下，两株菌的接种体积比例分别为3％，总接种体积为6％)，铜绿假单胞菌接种活菌数浓度为10

培养24h后，收集各处理的培养液，在8000rpm离心10min，得到上清液，用超纯水将上清液稀释1000倍，过0.22μm滤膜，收集滤液，备用。

实施例2

用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)(NEXION300XX，PerkinElmer，Inc)测定各处理滤液中Cd的含量(mg/L)；采用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP-MS)(PerkinElmer Series 200HPLC和NEXION300XX，ICP-MS)测定各处理滤液中As(Ⅲ)的含量，计算As的还原效率(As的还原效率＝As(III)浓度/初始添加的As(V)浓度)。结果如表1～2所示。

仪器所需的20mM NH

结果分析：

表1共培养前后各处理下Cd的修复效率

表2共培养前后各处理下As的还原效率

从表1中可以得知，地衣芽孢杆菌共培养前各处理对Cd的平均去除率为63％，而两种菌共培养后各处理对Cd的平均去除率为72％。可见，将地衣芽孢杆菌和铜绿假单胞菌共培养后对Cd的去除率由63％提高到了72％。其中，在Cd污染体系中，提升效果最显著的是Cd污染水平为100mg/L，共培养体系的修复效率是地衣芽孢杆菌纯培养体系的1.8倍；在Cd+As污染体系中，提升效果最显著的Cd+As污染水平为50+90mg/L，共培养体系的修复效率是地衣芽孢杆菌纯培养体系的1.23倍。

从表1中可以得知，铜绿假单胞菌共培养前各处理对Cd的平均去除率为73％，而两种菌共培养后各处理对Cd的平均去除率为72％。从Co-Culture/P.aeruginosa平均比值看，将铜绿假单胞菌和地衣芽孢杆菌共培养后对Cd的平均去除率略无显著影响。但是，在Cd污染体系中，Cd污染水平为0.5mg/L时，供养体系的提升效果比较明显，此时共培养体系的修复效率是地衣芽孢杆菌纯培养体系的1.6倍；在Cd+As污染体系中，提升效果最显著的Cd+As污染水平为10+90mg/L，共培养体系的修复效率是地衣芽孢杆菌纯培养体系的1.06倍。

根据表1中地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的数据绘制地衣芽孢杆菌共培养前后各处理下Cd的修复效率折线图，如图1所示。从图1中比较地衣芽孢杆菌共培养前后对Cd的修复效果可知，除少数处理(0.5、0.5+90mg/L)外，共培养体系对Cd的去除效率显著提高。

根据表2中地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的数据绘制地衣芽孢杆菌共培养前后各处理下As的还原效率折线图，如图2所示。从图2中可以看出：在As与Cd的复合污染体系中，两株菌的共培养体系均能提高As(Ⅴ)的还原效率，两株菌共培养的生物转化效率比单一地衣芽孢杆菌培养平均提高31％(参见表2)。

根据表1中铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的数据绘制铜绿假单胞菌共培养前后各处理下Cd的修复效率折线图，如图3所示。从图3中可以看出：在处理(0.5、5、100mg/L)中，两株菌共培养对Cd的修复效率有显著增加。

根据表2中铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的数据绘制铜绿假单胞菌共培养前后各处理下As的还原效率折线图，如图4所示。从图4中可以看出：在所有处理下，两株菌共培养后As形态的转化率都没有显著提升，且在0.5+90、5+90mg/L这两个处理下，两株菌共培养后的As修复效率显著低于铜绿假单胞菌纯培养。

实施例3

定量测定各个处理下的地衣芽孢杆菌和铜绿假单胞菌的细菌数量，并将地衣芽孢杆菌的细菌数量与铜绿假单胞菌的细菌数量作比，得到地衣芽孢杆菌/铜绿假单胞菌的比值，结果如表3。

表3共培养前后各处理下细菌数量及比值(对数值)

根据表3绘制地衣芽孢杆菌和铜绿假单胞菌共培养前后细菌数量的比值变化折线图，如图5所示。从图5中可以看出：在不添加重金属胁迫时(CK组)，两种菌的共培养体系可以显著增加地衣芽孢杆菌的比例。而在受梯度浓度重金属影响后，两种菌的纯培养体系和共培养体系的地衣芽孢杆菌比例在多数情况下无显著差异。但在两株菌的共培养体系中的高浓度Cd+As复合污染(10+90、50+90、100+90mg/L)体系下，地衣芽孢杆菌数量逐渐占主导，其比值(共培养：纯培养)依次为：1.17(50+90)>1.14(100+90)>1.05(10+90)。

实施例4

将不同处理下Cd的修复效率、As形态的转化率和arsB基因的绝对丰度除以不同处理中的细菌总数，得到表4～6。

表4地衣芽孢杆菌和铜绿假单胞菌共培养前后单位细菌修复Cd能力

表5地衣芽孢杆菌和铜绿假单胞菌共培养前后单位细菌还原As能力

表6地衣芽孢杆菌和铜绿假单胞菌共培养前后单位细菌arsB基因单位拷贝数

并根据表4绘制两株菌共培养前后单位细菌修复重金属能力和arsB基因单位拷贝数的比较图，如图6～10所示。

其中，arsB基因的拷贝数通过以下方法测定：

采用Ezup柱式细菌基因组DNA纯化试剂盒(中国生工生物技术公司)从各处理所选菌株中提取DNA。以提取的DNA作为模板进行PCR扩增，引物序列如下：arsB-F：ggtgtggaacatcgtctggaaygcnac，arsB-R：caggccgtacaccaccagrtacatncc。扩增总体系为20μL，包括10μL SYBR Premix Ex Taq(Takara)、1μL DNA模板(20～200ng/μL)、各0.16μL的前引和后引(50μM)和8.68μL灭菌后的ddH

采用独立样本T检验比较两种培养体系各指标是否存在显著差异。结果表明：

如图6所示，在两株菌共培养后，单位细菌对Cd吸附效率在大多数处理中增加，说明地衣芽孢杆菌和铜绿假单胞菌共培养能够促进对Cd的修复作用。通过将共培养体系与地衣芽孢杆菌纯培养体系对比，在Cd浓度为100mg/L时，共培养体系对Cd的修复效率最高，此时两株菌的共培养体系对Cd的修复效率是地衣芽孢杆菌纯培养体系的2.25倍。

如图7所示，在两株菌的共培养体系中，在高Cd浓度复合污染体系下，单位细菌拷贝数对As的转化率也有所提高。随着Cd浓度从0mg/L增加到50mg/L，共培养体系的促进作用也逐渐增强。将共培养体系下的转化率除以纯培养体系下的转化率，可以得到以下关系：5.8(50+90)>1.6(10+90)>1.3(5+90)>1.1(0.5+90)，而100+90mg/L处理的比率是4.2(<5.8)，表明在某种程度上Cd可以促进As(Ⅴ)转化为(Ⅲ)，超出这个浓度促进作用会受到抑制。

如图8所示，在两株菌共培养后，单位细菌对Cd吸附效率在大多数处理中增加，说明地衣芽孢杆菌和铜绿假单胞菌共培养能够促进对Cd的修复作用。最显著的是Cd浓度为100mg/L时，此时两株菌的培养体系对Cd的修复效率是铜绿假单胞菌纯培养体系的1.8倍。

如图9所示，与铜绿假单胞菌纯培养相比，除0.5+90mg/L的处理外，其余重金属处理下单位细菌砷转化能力在共培养体系后没有出现显著差异。

如图10所示，在两株菌的共培养体系中，各处理下arsB基因的细菌单位拷贝数表达均显著升高。100mg/L处理的增加效果最显著为地衣芽孢杆菌纯培养2.07倍，两株菌共培养体系下的平均促进效果是地衣芽孢杆菌纯培养体系的1.7倍(不含CK组)。同时，除50+90和100+90mg/L外，各处理组的促进效果均高于对照组(CK组)的促进效果(1.54倍)。这表示Cd和As可以分别刺激arsB的基因表达，但高浓度的Cd和As复合污染体系可以抑制其表达，这不是细菌数量的变化引起的arsB基因单位拷贝数的减少，因为这里使用的是单位细菌表达数量。

此外，我们将As作为变量进行进一步讨论。将共培养的菌株单位基因表达量除以纯培养的菌株单位基因表达量，得到1.8(0.5)>1.6(0.5+90)、1.9(5)>1.8(5+90)、1.9(10)>1.8(10+90)、1.8(50)>1.5(50+90)、2.1(100)>1.5(100+90)。也就是说，在共培养体系中，所有Cd单一污染体系都更有利于arsB基因的表达。表明As抑制了arsB基因的表达。而As单一处理(90mg/L)的比例为1.7，高于CK组(1.5)，说明单一As的存在也促进了arsB基因的表达。综上所述，Cd和As两种重金属的添加分别促进了arsB基因的表达，但两种重金属的组合会减弱这种促进作用，但修复效果仍然是正向的。

实施例5

通过凝胶电泳对地衣芽孢杆菌P8_B2和铜绿假单胞菌NBRC 12689中arsB基因进行验证(做四个重复)，结果如图11所示。由电泳胶图可知，两种细菌均含有arsB基因且特异性良好，条带大小为746bp。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种修复镉砷复合污染土壤的修复剂及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggtgtggaac atcgtctgga aygcnac 27

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caggccgtac accaccagrt acatncc 27