一种机体健康状态评估的组合生物标志物检测方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体为一种机体健康状态评估的组合生物标志物检测方法。

背景技术

单核细胞是外周血单个核细胞中髓系来源固有免疫系统中的重要组分，在健康人群中的占比10-30％。外周血单核细胞来源于骨髓粒单系前体，在骨髓单核系造血过程中，EGR1的表达是决定粒单系前体向单核细胞还是中性粒细胞分化的一个重要核转录调控因子。表达EGR1的新生单核细胞从骨髓进入外周血，组成外周血固有免疫系统中的单核细胞。

外周血单核细胞是循环中的免疫一线细胞，能够快速感知、识别入侵病原体以及内源性危险物质。致病微生物、肿瘤和自身免疫等炎性病理状态下所释放的一些炎性因子，如TLR激动剂、病毒核酸、以及炎性细胞因子等，将刺激外周血稳态单核细胞快速地产生固有免疫应答，表达多种趋化因子和炎性细胞因子，如趋化因子CCL3和CCL4,IL-1B等；而且单核细胞在反应过程中也将分化为具有不同免疫主导功能的多种单核细胞亚群，包括具有正向免疫刺激功能为主要特征的单核来源树突状细胞，具有交叉抗原提呈功能、表达干扰素应答基因的干扰素印记单核细胞，具有负向免疫调控功能的髓样抑制细胞等。

这些不同功能特点的反应性单核细胞亚群的存在，反映了机体固有免疫系统处于应答状态，在一定程度上说明个体处于疾病活动期或者恢复早期，或者亚健康状态，对于疫苗接种人群来说处于应答期，因此检测外周血中代表稳态单核细胞和反应性单核细胞亚群的生物标志物的表达水平和比较，有助于评判机体固有免疫系统是处于稳态还是应答状态，对疾病进展和恢复，疫苗接种后反应、机体潜在亚健康状态的评估和筛查具有指导意义，发展靶向这些标志物的检测技术和方法在个体健康状态的初步诊断和筛查中具有广阔的应用价值。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种机体健康状态评估的组合生物标志物检测方法，采用定量PCR方法检测人外周血单个核细胞中EGR1和CCL3基因的初始和成熟转录本的相对水平，用于评估感染、肿瘤以及炎症性疾病，健康个体疫苗接种后，或潜在亚健康等个体的固有免疫系统是处于免疫应答活动期还是健康稳态，进而实现对机体健康状态的评估和筛查。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种机体健康状态评估的组合生物标志物检测方法，以COVID-19为例，疾病活动期、恢复期个体和健康个体的外周血单核细胞的单细胞测序数据表明：健康个体中的单核细胞主体是表达EGR1的稳态单核细胞群体；COVID-19活动期和重症个体单核细胞表达CCL3和EGR1的水平均显著升高，说明机体存在骨髓异常活跃的造血和外周血单核细胞处于活跃的反应期；COVID-19恢复早期个体是表达EGR1和CCL3的水平均降低，但以多种反应性单核细胞亚群为主体，包括高表达MHC-II的单核来源树突状细胞，高表达干扰素应答基因和交叉提呈抗原为特征的干扰素印记单核细胞，以及高表达VNN2的髓样抑制细胞。通过对不同健康状态人群单核细胞中这两个基因表达的差异分析，我们推测健康个体中是以稳态单核细胞为主体，其特征是表达高水平的EGR1和中等水平的CCL3，作为将来受到应激后能够快速产生CCL3代表的一类炎性细胞因子的储存预备；感染活动期和重症个体，存在因骨髓异常造血生成大量高表达EGR1的新生单核细胞，以及单核细胞受到感染刺激，上调表达CCL3等炎性因子的早期反应性单核细胞；恢复期个体，随着感染等病原体和炎性刺激物水平的降低，骨髓造血恢复稳态，但前期疾病活动期产生的反应性单核细胞依然存在，因此主体单核细胞为低或无表达EGR1和CCL3。因此，利用EGR1和CCL3表达的相对水平，可以对固有免疫系统中单核细胞处于稳态还是反应态做出判断，从而对机体健康状态评估。

我们的设想是，新生或者稳态单核细胞表达的EGR1水平的下调，标志着单核细胞受到活化刺激开始和向各功能特化的单核来源树突状细胞、髓样抑制细胞以及干扰素反应单核细胞的分化；而CCL3表达的上调是单核细胞活化早期的产物，因此CCL3与EGR1表达的相对比值增高标志着单核细胞受到刺激进入应答状态，反映机体存在激活单核细胞的物质，如病原体、炎性因子以及内源性危险物质；CCL3与EGR1表达的相对比值降低，标志着骨髓中可能存在单核细胞来源造血的异常活跃，与单核细胞异常增生以及单核细胞来源白血病有关。

在上述设想基础上，我们进一步对单细胞测序数据，进行EGR1和CCL3转录本的RNA速度分析，发现这两个基因的表达存在RNA速度的前后关联。

通过体外实验，我们研究EGR1和CCL3的表达是否具有负相关关联。用TLR激动剂刺激外周血单核细胞，证实EGR1的表达水平减低伴随着CCL3的表达上调。

进一步通过体外实验，TLR激动剂刺激外周血单核细胞，EGR1基因转录后未剪切的初始转录本发生显著降低，标志着EGR1的转录下调；同时，CCL3的初始转录本和剪切后的成熟转录本都上调，标志着单核细胞向各炎性和功能特化的单核来源细胞各亚群的分化。进一步证实了EGR1和CCL3的表达在单核细胞活化分化中具有负关联。CCL3和EGR1表达的相对比值，优选的，选取靶向EGR1的初始转录本；更优的，选取靶向CCL3的成熟转录本和EGR1的初始转录本。

我们通过对COVID-19恢复早期患者和健康个体外周血单个核细胞表达EGR1和CCL3的检测和相对水平的研究，证实COVID-19恢复早期患者的CCL3/EGR1表达的相对比值显著的高于健康人，说明COVID-19恢复早期人群机体固有免疫系统的反应性依然存在，尚未恢复稳态。

我们通过对接种不同疫苗的普通型COVID-19病人恢复早期的CCL3/EGR1表达的相对比值进行研究，发现接种腺病毒疫苗的恢复期病人的CCL3/EGR1表达的相对比值显著高于接种灭活疫苗的病人，说明CCL3/EGR1表达的相对比值能够反应疫苗接种后的反应。

因此组合检测EGR1和CCL3的相对表达，能够反映机体固有免疫系统中稳态和反应性单核细胞的相对水平，对疾病进展和恢复、疫苗反应、以及亚健康等机体健康状态做出初步评估，在临床以及社会筛查有健康问题个体的应用方面提供了科学指标和用途。

优选的，本发明的第一方面，是RNA速度分析揭示单核细胞中EGR1和CCL3表达的相互关系。

优选的，本发明的第二方面，提供TLR激动剂刺激外周血单个核细胞后，EGR1和CCL3表达水平。

优选的，本发明的第三方面，提供TLR激动剂刺激外周血单个核细胞后，EGR1和CCL3的初始和成熟转录本的表达以及不同组合的相对水平。

优选的，本发明的第四方面，对比了COVID-19恢复早期患者和健康个体外周血单个核细胞表达EGR1和CCL3的相对比值。

优选的，本发明的第五方面，对比了接种不同疫苗的普通型COVID-19病人恢复早期的CCL3/EGR1表达的相对比值。

(三)有益效果

本发明提供了一种机体健康状态评估的组合生物标志物检测方法。具备以下有益效果：

1、本发明提供了一种机体健康状态评估的组合生物标志物检测方法，目的在于提供一种采用定量PCR方法检测人外周血单个核细胞中EGR1和CCL3各转录本的表达和相对水平，判断机体固有免疫系统处于稳态还是应答状态，实现对疾病进展、健康个体疫苗接种后反应、亚健康状态等方面机体健康状态的评估。

2、本发明提供了一种机体健康状态评估的组合生物标志物检测方法，发明人经过对COVID-19活动期、恢复期个体和健康个体的外周血单核细胞单细胞测序数据的对比研究，筛选出EGR1和CCL3表达的相对水平，能够体现机体异常单核造血、稳态单核细胞、和反应性单核细胞的相对水平，从固有免疫应答角度反映疾病进展和恢复、疫苗接种后反应以及潜在亚健康等机体健康状态。

3、本发明提供了一种机体健康状态评估的组合生物标志物检测方法，可用于判断机体固有免疫系统中单核细胞处于稳态抑或反应态，对疾病进展和恢复以及潜在健康问题做出初步评估，具有重要的实用价值。

附图说明

图1为本发明的单细胞测序显示健康人和COVID-19恢复早期患者外周血单核细胞包含多种亚群的UMAP分析

图2为本发明的RNA速度分析COVID-19恢复期和健康个体外周血单核细胞表达EGR1和CCL3的关系示意图；

图3为本发明的TLR激动剂刺激外周血单个核细胞后，EGR1和CCL3的mRNA的水平示意图；

图4为本发明的TLR激动剂刺激外周血单个核细胞后，EGR1和CCL3的初始和成熟转录本的不同组合相对水平示意图；

图5为本发明的健康个体和COVID-19恢复早期患者EGR1和CCL3 mRNA表达的相对水平示意图

A：为本发明的接种不同疫苗的健康人和普通型COVID-19恢复早期患者EGR1和CCL3表达的EGR1和CCL3 mRNA相对水平

B:为本发明的接种不同疫苗的健康人和普通型COVID-19恢复早期患者CCL3/EGR1比值；

图6为本发明的接种腺病毒疫苗的普通型恢复期病人的CCL3/EGR1表达的相对水平示意图；

图7为本发明的核酸序列示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图1-7，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：RNA速度分析COVID-19轻型和普通型患者恢复早期和健康个体单核细胞EGR1和CCL3表达的相互关系

采集Omicron感染轻症和普通型患者恢复期(23例，从发病到采集的中位时间42天)和健康志愿者(6例，灭活或者腺病毒疫苗末次接种到采集的中位时间46天)的外周血。采用1.077梯度密度离心分离外周血单个核细胞，进行基于BD Rhapsody微孔的单细胞捕获、建库和单细胞测序。测序数据经过过滤处理清除低活性细胞、双(多)联体细胞和批次差校正，获得413,299高质量单细胞数据。通过UMAP分析基因表达的特征，获得34个细胞群体，其中单核细胞包含5个亚群，其中4个亚群为CD14+CD16-，1个CD14-CD16+亚群。4个CD14+CD16－亚群分别为：c21群，高表达EGR1；c22群，高表达VNN2；c23群，高表达HLA-DMA；c24，高表达干扰素反应基因。其中健康人组，以c21群，高表达EGR1为主体亚群，而恢复期患者以各反应性单核细胞亚群为主，说明疾病诱导稳态单核细胞分化为功能不同的单核细胞亚群，并在疾病进入恢复期后仍然维持，结果如图1所示。

通过对单核细胞各亚群独立分析，发现稳态单核群体中EGR1和CCL3基因的表达存在负关联关系，RNA速度分析显示存在表达先后，结果如图2所示。这表明，单核细胞向各反应性单核亚群分化时，EGR1的表达将降低，而CCL3的表达将升高。

实施例2：TLR激动剂刺激外周血单个核细胞表达EGR1和CCL3的水平

采集并按如上操作分离恢复期和健康人的外周血单个核细胞。用TLR激动剂(LPS,100ng/ml+PolyI:C,25μg/ml)进行刺激，16h后，收集细胞，进行EGR1和CCL3的定量PCR检测。引物核酸序列分别为，SEQ ID11,12(EGR1)和SEQ ID13,14(CCL3)。经过用内参ACTB校正后，结果显示，TLR激动剂诱导单核细胞显著的上调CCL3的表达，同时伴随着EGR1表达的降低(A,B:恢复期病人；C,D：健康人；如图3所示)，表明EGR1和CCL3的表达存在负关联，这两个基因的表达比值变化与单核细胞的活化有关。

实施例3：TLR激动剂刺激外周血单个核细胞表达EGR1和CCL3的水平

如上操作分离健康人的外周血单个核细胞，用TLR激动剂(LPS,100ng/ml+PolyI:C,1g/ml)进行刺激，16h后，收集细胞，进行EGR1和CCL3的初始和成熟转录本的定量PCR检测。引物核酸序列分别为，SEQ ID No.1-2(EGR1初始转录本)；SEQ ID No.3,4(EGR1成熟转录本)；SEQ ID No.5-8(CCL3初始转录本)；SEQ ID No.9,10(CCL3成熟转录本)。经过用内参ACTB校正后，结果显示，TLR激动剂诱导单核细胞显著的上调CCL3的成熟和初始转录本的表达，成熟转录本上调更显著；显著的下调EGR1成熟和初始转录本的表达，以初始转录本降低更高，如图4所示。在CCL3和EGR1不同转录本之间的组合比值方面，TLR激动剂刺激后从高到低的顺序为：CCL3cds/EGR1 IR>CCL3cds/EGR1cds>CCL3 IR1/EGR1 IR>CCL3IR1/EGR1 cds>CCL3IR2/EGR1 IR>CCL3IR2/EGR1cds,因此根据比值的灵敏度大小，最优选择成熟的CCL3转录本与EGR1的初始转录本的相对比值(CCL3cds/EGR1 IR)，较优选择CCL3的成熟转录本与EGR1的成熟转录本的相对比值(CCL3cds/EGR1cds)，一般也可以不考虑初始和成熟转录本。

实施例4：COVID-19恢复期和健康个体中CCL3和EGR1表达的相对水平

我们对采集的COVID-19恢复期和健康个体的外周血单个核细胞进行了表达CCL3和EGR1的定量PCR检测，通过对CCL3/EGR1的比值进行对比，发现恢复期病人的CCL3/EGR1的比值显著的高于健康人，如图5所示。因此，采用组合检测外周血单个核细胞中CCL3和EGR1的相对表达，可以用于评估单核细胞所在状态，进而对疾病进展程度进行判断。

实施例5：接种不同疫苗普通型COVID-19恢复期病人中CCL3和EGR1表达的相对水平

我们从接种不同疫苗普通型COVID-19恢复期个体的单细胞测序数据中提取单核细胞群体，通过统计CCL3和EGR1的read counts，进行比值分析，发现接种腺病毒疫苗(AdV)的普通型恢复期病人的CCL3/EGR1的比值显著的高于接种灭活疫苗(IV2和IV3，如图6所示)。因此，CCL3和EGR1的相对表达，也可以用于评估疫苗接种后的反应性。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。