乳膏制剂中4种阴离子的定量分析方法

技术领域

本发明涉及采用HPLC-CAD对乳膏制剂中4种以上阴离子同时定量分析的方法，特别是，对氯离子、硝酸根、磷酸根、硫酸根同时定量分析的方法。

背景技术

乳膏剂是原料药物溶解或分散于乳状液型基质中形成的均匀半固体制剂。乳膏剂中的酸根离子主要来源于带酸根的原料药或辅料(如无水磷酸氢钙、磷酸二氢钠、十二烷基硫酸钠等)中杂质，酸根离子的种类包括Cl-、NO

Cl-、NO

由于Cl-、NO

综上所述，需要开发一种酸根离子含量的检测方法，作为一种新的检测手段，对乳膏中酸根离子进行准确定量，从而保证产品的质量。

电雾式检测器(CAD)是一种通用检测器，与HPLC联用，将洗脱液经雾化器中氮气的作用雾化，其中较大的液滴在碰撞器的作用下经废液管流出，较小的溶质液滴在室温下干燥，形成溶质颗粒。同时，用于载气的氮气分流形成的第二股氮气流经过电晕式装置(含高压铂金丝电极)形成带正电荷的氮气颗粒，与溶质颗粒反向相遇时经碰撞使溶质颗粒带上正电。它不依赖于分析物的结构，也不需要将分析物电离，只要该物质属于半挥发性或非挥发性化合物就可以被检出，且灵敏度可以达到pg级别，重现性良好，是紫外(UV)、质谱(MS)、示差折光(RI)与蒸发光散射(ELSD)等常用检测器的有力补充。本项目采用HPLC-CAD检测技术，既能满足多种酸根离子的同时测定，同时相较于离子色谱、GC、MS等分析技术，操作简便，维护及使用成本较低。

发明内容

本发明要解决的技术课题

如上所述，乳膏制剂中存在的Cl-、NO

鉴于上述技术问题，本发明的目的是提供一种成本低、简便、可及性高、且能够同时检测乳膏中磷酸根离子、氯离子、硝酸根离子和硫酸根离子的含量的方法。

解决技术课题的技术方案

本发明包括如下技术方案。

一种采用液相色谱同时测定乳膏制剂中四种以上离子含量的方法，所述四种以上离子包括氯离子、硝酸根离子、磷酸根离子和硫酸根离子，其特征在于，所述液相色谱条件如下：

色谱柱：C18柱，

流动相A：10mM正辛胺水溶液，

调节pH值至4.5±0.5，优选4.5±0.3，更优选4.5±0.2，

流动相B：乙腈，

梯度洗脱程序：

检测器：CAD检测器。

本发明的测定方法中，色谱条件还包括，检测波长：210±5nm，优选210±2nm，流速：1.0±0.2mL/min，柱温：30±5℃，优选柱温为30±3℃，更优选为30±2℃。

本发明的测定方法还包括配制乳膏制剂样品的步骤，称取乳膏制剂，加入稀释剂，均匀分散，过滤，优选通过微孔滤膜进行过滤。

本发明的测定方法，通过外标法计算乳膏制剂中四种离子的含量。

本发明的测定方法中，色谱条件还包括：蒸发器温度为35℃，幂律函数值(PowerFunction)为1.00，采集频率为5Hz。

本发明的测定方法中，优选通过冰醋酸调节流动相A的pH。

本发明的测定方法中，所述乳膏制剂为利多卡因乳膏。

有益的技术效果

本发明的有益效果：

1.采用电喷雾检测器(CAD)，可以准确定量乳膏制剂中磷酸根离子、氯离子、硝酸根离子和硫酸根离子的含量，为酸根离子的检测提供一种新的方法。

2.采用HPLC和常规C18反向色谱柱，方法可普及性高，检测成本低。

3.该方法样品制备简便，总检测时间短，便于快速出具检验结果。

4.该方法经过验证，符合专属性和准确度要求，为酸根离子含量测定提供了一种新的检测手段。

附图说明

图1.使用Aglilent Poroshell 120HILIC-Z(150×3.0mm，2.7μm)色谱柱的色谱图；

图2.稀释剂、四种离子对照品和乳膏制剂样品的色谱图。

具体实施方式

本发明提供一种基于高效液相色谱-电喷雾检测器(HPLC-CAD)联用技术，同时测定乳膏制剂中4种酸根离子含量的方法，所述4种酸根离子分别为Cl

具体步骤如下：

1.色谱条件筛选：以混合离子对照品溶液，分别考察了不同色谱柱(AglilentPoroshell 120HILIC-Z(150×3.0mm，2.7μm)、Welch Ultimate AQ-C18(250×4.6mm，5μm)、Waters Xselect HSS-T3(150×4.6mm，3.5μm))对目标离子的分离情况，根据峰对称性、峰分离度确定合适的色谱条件。

使用Aglilent Poroshell 120HILIC-Z(150×3.0mm，2.7μm)色谱柱，如图1所示，氯离子、硫酸根、磷酸根以及硝酸根离子可以确定出峰位置，但峰型较差。

使用Welch Ultimate AQ-C18(250×4.6mm，5μm)色谱柱，氯离子、硫酸根、磷酸根以及硝酸根离子可以确定出峰位置，峰形也尚可，但出峰位置和色谱梯度波动略有重合，虽然也可以使用，但是色谱图整体效果不如Waters Xselect HSS-T3(150×4.6mm，3.5μm)。考察了不同流动相体系(100mM甲酸铵水溶液(甲酸调pH＝3.0)-乙腈、10mM正辛胺水溶液(冰醋酸调pH＝4.5)-乙腈)、不同稀释剂(50％乙腈、水)、不同梯度洗脱顺序对目标离子的分离情况，根据峰对称性、峰分离度确定合适的流动相为：A：10mM正辛胺水溶液，调节pH值至4.5±0.5，流动相B：乙腈，梯度洗脱程序：

2.样品制备方法的确定：根据乳膏制剂中目标离子的含量范围，精密称取乳膏制剂适量，置离心管中，加入适量稀释剂，涡旋使其均匀分散，用稀释剂稀释至合适浓度，摇匀，滤过(优选用0.22μm的尼龙66滤膜)，取续滤液，作为供试品溶液。

3.样品测定

(1)样品制备

1)精密量取氯离子标准溶液、硝酸根标准溶液、硫酸根标准溶液、磷酸根标准溶液适量，以水为溶剂，配制对照品储备液；

2)精密量取对照品储备液，以水为溶剂，配制对照品溶液；

3)精密称取乳膏制剂适量，加入适量水，涡旋使分散，转移至量瓶中，用水稀释至刻度摇匀，用0.22μm滤膜过滤，取续滤液，即为供试品溶液。

(2)检测条件

1)色谱条件：

4.结果计算

按外标法，以峰面积计算4种酸根离子的含量。

实施例

下面结合实施例对本发明做详细的说明。实施例例举了详细的实施方式和过程，用于充分公开和展示发明可实施，实施例并不代表对发明的限制，本发明的保护范围并不限于下述的实施例。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施方式，都属于本发明的保护范围。

在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明反应的进程可采用本领域中的常规监测方法(例如TLC、LCMS或NMR)进行监测，一般以反应底物消失时为反应终点。说明书实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

本发明中，如无特别说明，“以上”、“以下”、“以内”表示包括本数。

实施例1：运用HPLC-CAD法对乳膏制剂中4种酸根离子的定量分析；

溶液配制

精密量取氯离子标准溶液、硝酸根标准溶液、硫酸根标准溶液、磷酸根标准溶液适量，以水为溶剂，配制对照品储备液(储备液浓度为200μg/mL)；

精密量取对照品储备液，以水为溶剂，配制对照品溶液(对照品溶液浓度为50μg/mL)；

精密称取利多卡因乳膏制剂适量约100mg，加入适量水(约5mL)，涡旋使分散，转移至10mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用0.22μm尼龙滤膜过滤，取续滤液，即为供试品溶液；

稀释剂为水。

检测条件

色谱参数：

进样顺序

将稀释剂(水)、对照品溶液、供试品溶液分别注入液相色谱仪，记录色谱图。

测试结果

分别对稀释剂、对照品溶液和供试品溶液进行分析，所得色谱图如图2所示，其中Cl-、PO

计算公式如下：

表1制剂中4种酸根离子的检测结果

实施例2：

本发明实施例1提供的测试方法的专属性考察

1)溶液配制

稀释剂：水。

空白溶液：即稀释剂。

混合溶液(200μg/ml)：精密量取氯离子标准溶液(1000μg/ml)、硝酸根标准溶液(1000μg/ml)、硫酸根标准溶液(1000μg/ml)、磷酸根标准溶液(1000μg/ml)各5ml，置25ml量瓶中用稀释剂稀释至刻度，摇匀。

对照品混合溶液(50μg/ml)：精密量取混合溶液(200μg/ml)2.5ml，置10ml量瓶中用稀释剂稀释至刻度，摇匀。

氯离子定位液(200μg/ml)：精密量取氯离子标准溶液(1000μg/ml)1ml，置5ml量瓶中用稀释剂稀释至刻度，摇匀。

硝酸根离子定位液(200μg/ml)：精密量取硝酸根标准溶液(1000μg/ml)1ml，置5ml量瓶中用稀释剂稀释至刻度，摇匀。

硫酸根离子定位液(200μg/ml)：精密量取硫酸根标准溶液(1000μg/ml)1ml，置5ml量瓶中用稀释剂稀释至刻度，摇匀。

磷酸根离子定位液(200μg/ml)：精密量取磷酸根标准溶液(1000μg/ml)1ml，置5ml量瓶中用稀释剂稀释至刻度，摇匀。

供试品溶液(10mg/ml)：精密称取乳膏制剂约100mg，置5ml离心管中，加入2.5ml稀释剂，涡旋使其均匀分散，转移至10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，用0.22μm滤膜(尼龙66)滤过，取续滤液。

2)取各离子定位溶液、混合对照品溶液和供试品溶液进样，结果如图2所示。由图2可看出，空白溶液在各目标峰处均无干扰，本发明的方法专属性良好。

实施例3：

实施例1提供的测试方法的进样精密度考察

1)取对照品溶液进样6针，得到如下结果：

表2磷酸根离子进样精密度结果

表3氯离子进样精密度结果

表4硝酸根离子进样精密度结果

表5硫酸根离子进样精密度结果

2)进样精密度考察结果：对照品溶液连续进样6针，磷酸根离子、氯离子、硝酸根离子、硫酸根离子保留时间RSD均小于0.10％，峰面积RSD均小于2.0％，进样精密度良好。

实施例4：

实施例1提供的测试方法的溶液稳定性考察

1)取对照品溶液和加标供试品溶液在不同时间点进样，考察溶液稳定性。结果如下：

表6磷酸根离子溶液稳定性结果

N/A:不适用

表7氯离子溶液稳定性结果

表8硝酸根离子溶液稳定性结果

表9硫酸根离子溶液稳定性结果

稳定性考察结论：磷酸根离子、氯离子、硝酸根离子、硫酸根离子对照品溶液在经过2、9、12、14小时后测定的峰面积与0h峰面积比值均在90％～110％之间，说明对照品溶液在14h内稳定；加标供试品溶液在经过1、3、7、11.5小时后测定的峰面积与0h峰面积比值均在90％～110％之间，说明加标供试品溶液在11.5h内稳定。

实施例5：

实施例5提供的测试方法的检测限和定量限考察

1)溶液配制

定量限溶液：精密量取对照品混合溶液(50μg/ml)1ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。

检测限溶液：精密量取LOQ溶液5ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。

2)取检测限和定量限溶液进样，得到如下结果：

表10磷酸根离子检测限和定量限结果

表11氯离子检测限和定量限结果

表12硝酸根离子检测限和定量限结果

表13硫酸根离子检测限和定量限结果

3)检测限和定量限精密度结果：检测限溶液中磷酸根离子、氯离子、硝酸根离子、硫酸根离子S/N均大于3；取定量限溶液连续进样6针，磷酸根离子、氯离子、硝酸根离子、硫酸根离子S/N均大于10，峰面积RSD均不大于10％。说明该方法检测限低，精密度良好。该方法对于磷酸根离子、氯离子、硝酸根离子及硫酸根离子的检测限均为2.50μg/ml、定量限均为5μg/ml。

实施例6：

实施例1提供的测试方法的线性范围考察

1)线性溶液配制

取混合对照品储备液(Stock STD)制成含氯离子、硝酸根离子、磷酸根离子、硫酸根离子的LOQ～150μg/ml的线性溶液。

2)线性溶液样品检测

取线性系列标准溶液(LOQ、L-50％、L-100％、L-150％、L-200％、L-300％)，每份溶液各进样1次。以离子浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性拟合，结果见下表。

表14各离子线性结果

3)线性考察结果

试验结果表明：磷酸根离子、氯离子、硝酸根离子、硫酸根离子在5～150μg/ml浓度范围内峰面积与浓度呈线性，相关系数大于0.990，符合可接受标准。

实施例7：

实施例1提供的测试方法的准确度考察

1)0.5％加标供试品溶液配制

精密称取乳膏制剂约100mg，置5ml离心管中，加入2.5ml混合对照品储备液(200μg/ml)，涡旋均匀使其分散，转移至10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，用0.22μm滤膜(尼龙66)滤过，取续滤液。平行配制6份。

2)取加标供试品进样，结果如下：

表15磷酸根离子准确度结果

表16氯离子准确度结果

表17硝酸根离子准确度结果

表18硫酸根离子准确度结果

3)准确度考察结论：取加标供试品溶液进样，磷酸根离子、氯离子、硝酸根离子、硫酸根离子回收率均在90％～110％范围内，方法准确度良好。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和替换都被包括在本发明中，并以所附的权利要求书界定保护范围。