一种硫酸羟氯喹中硫酸二甲酯和硫酸二乙酯的检测方法

技术领域

本发明属于检测方法技术领域，具体涉及一种硫酸羟氯喹中硫酸二甲酯和硫酸二乙酯的检测方法。

背景技术

硫酸二甲酯和硫酸二乙酯作为两种重要的化工原料，在有机合成中可作为甲基化、乙基化试剂，在染料、医药、皮革、军工、农药等多种精细化工工业都有广泛的使用，但是它们的毒性相当大，可以破坏DNA结构，是潜在的致癌物质和可引起染色体畸变的诱变剂，具有挥发性、毒性、强腐蚀性和环境危害，能在动物体内组织中缓慢水解生成甲醇和硫酸，硫酸二甲酯的剧毒是由于未分解的分子和水解后的生成物共同作用所致。硫酸二乙酯还可用作挥发油抽提剂、脱水剂等，但是其毒性及环境危害性相当强，因而两者引起各国的广泛关注。

硫酸羟氯喹是一种治疗疟疾、类风湿性关节炎、红斑狼疮的药物。目前硫酸羟氯喹的生产工艺一般为以4,7-二氯喹啉为起始原料，与羟氯喹侧链在催化剂的作用下，缩合得到羟氯喹，然后羟氯喹在醇溶液中与浓硫酸成盐反应制得硫酸羟氯喹(相关的国家合成制备工艺专利CN103724261A、CN102050781A、CN104230803A、CN109280029A等均有相关的报道)。该生产合成工艺有可能产生化学反应副产物，即基因毒性杂质硫酸二甲酯和硫酸二乙酯。故硫酸羟氯喹用药可能存在着较大的安全风险问题。

鉴于此，拟对硫酸羟氯喹中基因毒性杂质硫酸二甲酯和硫酸二乙酯进行检测研究。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，为了进一步提高用药的安全性，本发明提供了一种硫酸羟氯喹中硫酸二甲酯和硫酸二乙酯的检测方法，其具有专属性强、线性关系好，检测灵敏度高，耐用性好等特点。

本发明的目的是提供一种硫酸羟氯喹中硫酸二甲酯和硫酸二乙酯的检测方法。

根据本发明的具体实施方式的硫酸羟氯喹中硫酸二甲酯和硫酸二乙酯的检测方法，所述检测方法包括：通过在待测样品中加入衍生试剂，所述衍生试剂为无水碘化钠和硫代硫酸钠；使衍生试剂与待测样品进行反应，然后采用配有ECD检测器的气相色谱仪检测并确定待测样品中是否含有硫酸二甲酯和/或硫酸二乙酯。

根据本发明的具体实施方式的硫酸羟氯喹中硫酸二甲酯和硫酸二乙酯的检测方法，若采用所述检测方法确定待测样品中含有硫酸二甲酯和/或硫酸二乙酯，则可以计算出硫酸二甲酯或硫酸二乙酯的含量。

根据本发明的具体实施方式的硫酸羟氯喹中硫酸二甲酯和硫酸二乙酯的检测方法，进一步的，色谱条件为：以Thermo TG-WAX MS 为色谱柱；稀释剂为乙腈，采用程序升温：初温40-50℃，保持6分钟，然后升温到135℃；进样口温度为235-245℃，分流比：（45-55）:1，检测器温度为245-255℃。

优选的，所述色谱柱的规格为30m×0.32mm×0.25μm，柱流速：0.9-1.1ml/min；载气为氮气，氮气的纯度≥99.999%；进样体积为0.5-1ml。

根据本发明的具体实施方式的硫酸羟氯喹中硫酸二甲酯和硫酸二乙酯的检测方法，进一步的，色谱条件为：以Thermo TG-WAX MS 为色谱柱，所述色谱柱的规格为30m×0.32mm×0.25μm；以乙腈为稀释剂，采用程序升温：初温45℃保持6分钟，以40℃/min的升温速率升到135℃；进样口温度为240℃，检测器温度为250℃，分流进样，分流比：50:1；柱流速：1.0ml/min；载气为氮气，氮气的纯度≥99.999%；进样体积为1ml。

本发明中使用的稀释剂均为乙腈。

根据本发明的具体实施方式的硫酸羟氯喹中硫酸二甲酯和硫酸二乙酯的检测方法，具体的，所述检测方法包括以下步骤：

（1）衍生剂的制备：称取无水碘化钠和硫代硫酸钠，加水溶解并稀释，摇匀，即得所述衍生剂；

（2）待测样品处理：称取待测样品，置顶空瓶中，稀释后加入和步骤（1）得到的衍生剂，轧盖密封，振摇使溶解，摇匀，形成样品溶液；

（3）检测：以Thermo TG-WAX MS为色谱柱；检测步骤（3）得到的所述样品溶液中是否含有硫酸二甲酯衍生物和/或硫酸二乙酯衍生物，确定待测样品中是否含有硫酸二甲酯和/或硫酸二乙酯。

根据本发明的具体实施方式的硫酸羟氯喹中硫酸二甲酯和硫酸二乙酯的检测方法，进一步的，步骤（1）中，称取无水碘化钠60g，硫代硫酸钠30mg，置于同一50ml容量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度，摇匀，即得所述衍生剂。

根据本发明的具体实施方式的硫酸羟氯喹中硫酸二甲酯和硫酸二乙酯的检测方法，进一步的，步骤（2）中，称取待测样品10mg，置顶空瓶中，加入稀释剂0.5ml和衍生剂1ml，轧盖密封，振摇使溶解，摇匀，形成样品溶液；顶空平衡温度（反应温度）为55-65℃，平衡时间（反应时间）为30分钟。

根据本发明的具体实施方式的硫酸羟氯喹中硫酸二甲酯和硫酸二乙酯的检测方法，进一步的，步骤（3）中，所述检测方法中还使用了对照品，所述对照品为硫酸二甲酯和硫酸二乙酯的标品。

所述对照品溶液的配制：称取硫酸二甲酯22mg、硫酸二乙酯22mg，置于同一50ml容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品一级贮备液；量取对照品一级贮备液1ml置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品二级贮备液；量取0.8ml对照品二级贮备液置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，形成所述对照品溶液；取稀释剂作为空白溶剂，分别量取所述空白溶剂、所述对照品溶液各0.5ml分置顶空瓶中，分别加入衍生剂1ml，轧盖密封，进样检测，并取供试品溶液，进样检测，记录色谱图；所述对照品溶液依次出峰顺序为硫酸二甲酯衍生物、硫酸二乙酯衍生物，检测样品溶液，得到的色谱图中如有与对照品溶液色谱图中保留时间一致的色谱峰，则说明样品中含有硫酸二甲酯和/或硫酸二乙酯。

进一步的，得到的色谱图中如有与对照品溶液色谱图中保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算硫酸二甲酯或硫酸二乙酯的含量。

根据本发明的具体实施方式的硫酸羟氯喹中硫酸二甲酯和硫酸二乙酯的检测方法，更进一步的，所述样品溶液的色谱图中如有与所述对照品溶液的色谱图中保留时间一致的色谱峰，按外标法以所述样品溶液的色谱图中峰面积计算样品溶液中各杂质的含量，峰面积低于所述对照品溶液峰面积0.1倍的杂质计为未检出。

根据本发明的具体实施方式的硫酸羟氯喹中硫酸二甲酯和硫酸二乙酯的检测方法，更进一步的，对照品溶液中各杂质信噪比大于50。

根据本发明的具体实施方式的硫酸羟氯喹中硫酸二甲酯和硫酸二乙酯的检测方法，进一步的，定量环温度：90℃；传输线温度：100℃。

参照ICH M7中硫酸二甲酯的PDE（硫酸二乙酯参考硫酸二甲酯的数据），同时根据本品的最大日剂量，计算出硫酸二甲酯与硫酸二乙酯的限度为不得过3.75ppm。

发明人尝试直接采用GCMS直接测定硫酸二甲酯和硫酸二乙酯，结果检测灵敏度低，溶液稳定性差；参考EP9.0中2.5.38中甲磺酸酯检测方法中的试验机理（通过加入衍生试剂，与硫酸二甲酯和硫酸二乙酯分别生产碘甲烷和碘乙烷），采用ECD检测器进行检测，通过系统的方法确认，确定该方法可用于硫酸羟氯喹中硫酸二甲酯及硫酸二乙酯的测定。发明人将样品加入衍生剂后，采用GCMS的检测结果与GC-ECD方法的检测结果基本一致，验证了本发明的检测方法检测灵敏度高，GCMS检测的费用较高。

本发明采用代表性批次样品进行了专属性、系统适用性、线性、检测限、定量限以及检测限加入试验，并进行了精密度测定、回收率和耐用性考察试验。结果该方法经验证，专属性强，线性关系好、检测灵敏度高，在样品中未检出硫酸二甲酯及硫酸二乙酯的情况下，加入检测限浓度的杂质依然能有效检出，12份平行样之间精密度好，且硫酸二甲酯及硫酸二乙酯测定的准确度高；色谱系统在不同衍生剂加入量（1±0.1ml）、不同初始柱温（45±5℃）、不同流速（1±0.1ml/min）、不同进样口温度（240±5℃）、不同检测器温度（250±5℃）、不同平衡温度（60±5℃）、不同分流比（50±5：1）的微小变化下，对检测结果无影响，即在上述条件下耐用性好。综上，表明该方法适用于硫酸羟氯喹中硫酸二甲酯及硫酸二乙酯的测定。

根据系统的研究结果，拟采用外标法对硫酸羟氯喹中杂质硫酸二甲酯及硫酸二乙酯进行控制；通过专属性考察项下的分离度考察结果及方法耐用性中的混合溶液分离度考察结果可知，各考察条件下，硫酸二甲酯与硫酸二乙酯之间的分离度均大于9，所以拟不对分离度进行控制；同时为了确保检测灵敏度符合检测要求，要求对照品溶液中各杂质信噪比应大于50。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

（1）硫酸羟氯喹原料药现行的国家检验标准为国家食品药品监督管理总局标准YBH02472017，标准中未涉及硫酸二甲酯和硫酸二乙酯相关检验检测问题，存在方法标准的缺失问题，本项目研究主要是为加强用药安全，建立一种硫酸羟氯喹原料药基因毒性杂质硫酸二甲酯和硫酸二乙酯检验检测方法，作为国家标准YBH02472017的补充。

（2）通过专属性、系统适用性、线性、检测限、定量限以及检测限加入试验，并进行了精密度测定、回收率和耐用性考察试验，结果显示本发明的检测方法专属性强，线性关系好、检测灵敏度高，在样品中未检出硫酸二甲酯及硫酸二乙酯的情况下，加入检测限浓度的杂质依然能有效检出，12份平行样之间精密度好，且硫酸二甲酯及硫酸二乙酯测定的准确度高；

（3）通过对色谱系统中的多个参数进行调整，结果表明在一定范围内的参数调整对检测结果无影响，说明本发明的检测方法耐用性好，适用于硫酸羟氯喹中硫酸二甲酯和硫酸二乙酯的测定。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中空白溶液的色谱图；

图2为本发明实施例1中对照品溶液的色谱图；

图3为本发明实施例1中供试品溶液的色谱图；

图4为本发明实施例2中供试品加标溶液的色谱图；

图5为本发明的硫酸二甲酯的低浓度线性标准曲线图；

图6为本发明的硫酸二乙酯的低浓度线性标准曲线图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

在一些较为具体的实施方案中，所述检测方法包括：通过在待测样品中加入衍生试剂，所述衍生试剂为无水碘化钠和硫代硫酸钠；使衍生试剂与待测样品进行反应，然后采用配有ECD检测器的气相色谱仪检测并确定待测样品中是否含有硫酸二甲酯和/或硫酸二乙酯。

进一步的，色谱条件为：以Thermo TG-WAX MS 为色谱柱；稀释剂为乙腈，采用程序升温：初温40-50℃，保持6分钟，以40℃/min的升温速率升到135℃；进样口温度为235-245℃，分流比：（45-55）:1，检测器温度为245-255℃；优选的，所述色谱柱的规格为30m×0.32mm×0.25μm，柱流速：0.9-1.1ml/min；载气为氮气，氮气的纯度≥99.999%；进样体积为0.5-1ml。

进一步的，色谱条件为：以Thermo TG-WAX MS 为色谱柱，所述色谱柱的规格为30m×0.32mm×0.25μm；以乙腈为稀释剂，采用程序升温：初温45℃保持6分钟，以40℃/min的升温速率升到135℃；进样口温度为240℃，检测器温度为250℃，分流进样，分流比：50:1；柱流速：1.0ml/min；载气为氮气，氮气的纯度≥99.999%；进样体积为1ml。

具体的，所述检测方法包括以下步骤：

（1）衍生剂的制备：称取无水碘化钠和硫代硫酸钠，置于同一容量瓶中，加水超声溶解并稀释，摇匀，即得所述衍生剂；

（2）待测样品处理：称取待测样品，置顶空瓶中，加入稀释剂和步骤（1）得到的衍生剂，轧盖密封，振摇使溶解，摇匀，形成样品溶液；

（3）检测：以Thermo TG-WAX MS为色谱柱；检测步骤（3）得到的所述样品溶液中是否含有硫酸二甲酯衍生物和/或硫酸二乙酯衍生物，确定待测样品中是否含有硫酸二甲酯和/或硫酸二乙酯。

进一步的，步骤（1）中，称取无水碘化钠60g，硫代硫酸钠30mg，置于同一50ml容量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度，摇匀，即得所述衍生剂。

进一步的，步骤（2）中，称取待测样品10mg，置顶空瓶中，加入稀释剂0.5ml和衍生剂1ml，轧盖密封，振摇使溶解，摇匀，形成样品溶液；顶空平衡温度为55-65℃，平衡时间为30分钟。

进一步的，步骤（3）中，所述检测方法中还使用了对照品，所述对照品溶液的配制：称取硫酸二甲酯22mg和硫酸二乙酯22mg，置于同一50ml容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品一级贮备液；量取对照品一级贮备液1ml置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品二级贮备液；量取0.8ml对照品二级贮备液置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，形成所述对照品溶液；取稀释剂作为空白溶剂，分别量取所述空白溶剂、所述对照品溶液各0.5ml分置顶空瓶中，分别加入衍生剂1ml，轧盖密封，混合均匀，进样检测，并取供试品溶液，进样检测，记录色谱图；所述对照品溶液依次出峰顺序为硫酸二甲酯衍生物、硫酸二乙酯衍生物，检测样品溶液，得到的色谱图中如有与对照品溶液色谱图中保留时间一致的色谱峰，则说明样品中含有硫酸二甲酯和/或硫酸二乙酯。

更进一步的，所述样品溶液的色谱图中如有与所述对照品溶液的色谱图中保留时间一致的色谱峰，按外标法以所述样品溶液的色谱图中峰面积计算样品溶液中各杂质的含量，峰面积低于所述对照品溶液峰面积0.1倍的杂质计为未检出。

以下通过实施例并结合附图进一步详细说明本发明的技术方案。然而，所选的实施例仅用于说明本发明，而不限制本发明的范围。

实施例1

本实施例提供了一种硫酸羟氯喹中硫酸二甲酯、硫酸二乙酯的检测方法如下：

（1）衍生剂制备：精密称取无水碘化钠60g，硫代硫酸钠30mg，同置50ml量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。操作及存储均在避光阴凉处。

（2）对照品（标品）溶液的配制：取硫酸二甲酯约22mg、硫酸二乙酯约22mg，精密称定，同置50ml量瓶中，用稀释剂（乙腈）稀释至刻度，摇匀，作为对照品一级贮备液；精密量取对照品一级贮备液1ml置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品二级贮备液；精密量取0.8ml对照品二级贮备液置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

系统适用性要求对照品溶液中各杂质信噪比应大于50。

（3）供试品（供试品为硫酸羟氯喹，批号为SQK-190401-M）溶液的配制（临用新制）：取供试品10mg，精密称定，置顶空瓶中，精密加入稀释剂（乙腈）0.5ml，衍生剂1ml，轧盖密封，振摇使溶解，摇匀，即得。

（4）色谱条件以Thermo TG-WAX MS 为色谱柱，所述色谱柱的规格为30m×0.32mm×0.25μm；采用程序升温：初温45℃保持6分钟，以40℃/min的升温速率升到135℃；进样口温度为240℃，检测器温度为250℃，分流进样，分流比：50:1；柱流速：1.0ml/min；检测器为气相色谱电子捕获检测器 (GC-ECD)，顶空平衡温度为60℃，定量环温度：90℃，传输线温度：100℃；平衡时间为30分钟；上述稀释剂均为乙腈；载气为氮气，氮气的纯度≥99.999%；进样体积为1ml。

（5）测定方法取稀释剂（乙腈）作为空白溶剂，分别精密量取空白溶剂、对照品溶液各0.5ml分置顶空瓶中，各加入衍生剂1ml，轧盖密封，分别混合均匀，进样检测；取供试品溶液，进样检测，分别记录空白溶剂、对照品溶液和供试品溶液的色谱图如图1-3所示；其中，图1为空白溶液的色谱图；图2为对照品溶液的色谱图，图3为供试品溶液的色谱图。

从图1-2的比较中可以看出，标准硫酸二甲酯溶液在RT3.265min处出峰；保留时间为3.206-3.465；标准硫酸二乙酯溶液在RT3.797min处出峰；保留时间为3.742-3.911。从图3可以看出，供试品在同一保留时间处未检测到硫酸二甲酯出峰，由此可见，供试品中未检出硫酸二甲酯和硫酸二乙酯。

实施例2

本实施例与实施例1的区别仅在于：向供试品中加入了对照品（标品）。

本实施例提供了一种硫酸羟氯喹中硫酸二甲酯、硫酸二乙酯的检测方法如下：

（1）衍生剂制备：精密称取无水碘化钠60g，硫代硫酸钠30mg，同置50ml量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。操作及存储均在避光阴凉处。

（2）对照品（标品）溶液的配制：取硫酸二甲酯约22mg、硫酸二乙酯约22mg，精密称定，同置50ml量瓶中，用稀释剂（乙腈）稀释至刻度，摇匀，作为对照品一级贮备液；精密量取对照品一级贮备液1ml置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品二级贮备液；精密量取0.8ml对照品二级贮备液置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。

系统适用性要求对照品溶液中各杂质信噪比应大于50。

（3）供试品（供试品为硫酸羟氯喹，批号为SQK-190401-M）加标溶液的配制（临用新制）：取供试品10mg，精密称定，置顶空瓶中，加入0.5ml对照品溶液，精密加入稀释剂（乙腈）0.5ml，衍生剂1ml，轧盖密封，振摇使溶解，摇匀，即得供试品加标溶液。

（4）色谱条件以Thermo TG-WAX MS 为色谱柱，所述色谱柱的规格为30m×0.32mm×0.25μm；采用程序升温：初温45℃保持6分钟，以40℃/min的升温速率升到135℃；进样口温度为240℃，检测器温度为250℃，分流进样，分流比：50:1；柱流速：1.0ml/min；检测器为气相色谱电子捕获检测器 (GC-ECD)，顶空平衡温度为60℃，定量环温度：90℃，传输线温度：100℃；平衡时间为30分钟；上述稀释剂均为乙腈；载气为氮气，氮气的纯度≥99.999%；进样体积为1ml。

（5）测定方法取稀释剂（乙腈）作为空白溶剂，分别精密量取空白溶剂、对照品溶液各0.5ml分置顶空瓶中，各加入衍生剂1ml，轧盖密封，分别混合均匀，进样检测；取供试品溶液，进样检测，分别记录空白溶剂、对照品溶液和供试品加标溶液的色谱图；其中，空白溶剂、对照品溶液的色谱图与实施例1相同；图4为供试品加标溶液的色谱图。从图4可以看出，供试品分别在RT3.266min处出峰，保留时间为3.220-3.433；同时在RT3.799min处出峰，保留时间为3.744-3.933，说明供试品加标中含有硫酸二甲酯和硫酸二乙酯，由此可见，供试品中如含有硫酸二甲酯和硫酸二乙酯，是完全能够检测出来的。

实施例3方法学验证

1、仪器设备

采用的气相色谱仪：安捷伦7890B（配ECD检测器）

2、对照品和供试品

供试品同实施例1（（供试品为硫酸羟氯喹，批号为SQK-190401-M）），对照品信息如下表1：

表1 对照品

专属性试验

硫酸二甲酯、硫酸二乙酯定位溶液：取硫酸二甲酯22mg、硫酸二乙酯22mg，精密称定，分置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为硫酸二甲酯一级贮备液、硫酸二乙酯一级贮备液；精密量取硫酸二甲酯一级贮备液、硫酸二乙酯一级贮备液各1ml分置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为硫酸二甲酯二级贮备液、硫酸二乙酯二级贮备液；精密量取硫酸二甲酯二级贮备液、硫酸二乙酯二级贮备液各0.8ml分置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

对照品溶液：精密量取硫酸二甲酯二级贮备液、硫酸二乙酯二级贮备液各0.8ml同置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

检测限溶液：精密量取对照品溶液1ml置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液（临用新制）：取供试品10mg，精密称定，置顶空瓶中，精密加入稀释剂0.5ml，衍生剂1ml，轧盖密封，振摇使溶解，摇匀，即得。

混合溶液：取供试品10mg，精密称定，置顶空瓶中，精密加入对照品溶液0.5ml，衍生剂1ml，轧盖密封，振摇使溶解，摇匀，作为混合溶液。

取稀释剂作为空白溶剂，分别精密量取空白溶剂、硫酸二甲酯定位溶液、硫酸二乙酯定位溶液、对照品溶液、检测限溶液各0.5ml分置顶空瓶中，各精密加入衍生剂1ml，轧盖密封，摇匀后进样检测，并取供试品溶液及混合溶液进样检测，色谱条件同实施例1，记录并观察谱图，结果如下表2：

表2专属性考察结果

表2的试验数据表明：空白溶剂、供试品中硫酸二甲酯衍生物、硫酸二乙酯衍生物小于检测限；硫酸二甲酯衍生物、硫酸二乙酯衍生物理论板数均大于3000；硫酸二甲酯衍生物、硫酸二乙酯衍生物分离度均大于1.5，由此可见，本发明的检测方法专属性良好。

3、系统适用性试验

检测方法同上，对照品溶液：取硫酸二甲酯22mg、硫酸二乙酯22mg，精密称定，同置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品一级贮备液；精密量取对照品一级贮备液1ml置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品二级贮备液；精密量取0.8ml对照品二级贮备液置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

精密量取对照品溶液0.5ml置顶空瓶中，精密加入衍生剂1ml，轧盖密封，平行制备5份，摇匀后进样检测，记录谱图，结果如下表3。

表3系统适用性试验数据

表3的试验数据表明：对照品溶液连续进样五份，硫酸二甲酯的保留时间RSD为0.02%，小于1.0%，峰面积RSD为3.4%，小于10.0%；硫酸二乙酯的保留时间RSD为0.02%，小于1.0%，峰面积RSD为5.2%，小于10.0%。说明本发明的检测方法系统适用性良好。

5、线性范围试验

取硫酸二甲酯22mg、硫酸二乙酯22mg，精密称定，同置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品一级贮备液，精密量取对照品一级贮备液1ml置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品二级贮备液，精密量取4ml对照品二级贮备液置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，摇匀作为线性贮备液。

精密量取线性贮备液1.5ml、3ml、5ml、6ml、8ml、10ml，分别置25ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，依次作为线性溶液1、2、3、4、5、6。

色谱条件同实施例1，精密量取上述各线性溶液各0.5ml分置顶空瓶中，各精密加入衍生剂1ml，轧盖密封，摇匀后进样检测，记录谱图。以峰面积（A）为纵坐标，其浓度（C）为横坐标，进行线性回归。硫酸二甲酯和硫酸二乙酯的数据结果见下表4和表5，制作的标准曲线见图5和图6：

表4硫酸二甲酯低浓度线性数据

表5硫酸二乙酯低浓度线性数据

表4和表5的试验数据表明：硫酸二甲酯在19.6591ng/ml-131.0604ng/ml（相当于供试品0.98ppm-6.55ppm）范围内，线性相关系数为1.000，大于0.99；硫酸二乙酯在20.8282ng/ml-138.8547ng/ml（相当于供试品1.04ppm-6.94ppm）范围内，线性相关系数为0.999，大于0.99；由此可见，本发明的检测方法线性关系良好。

6、定量限试验

定量限溶液：取硫酸二甲酯22mg、硫酸二乙酯22mg，精密称定，同置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品一级贮备液；精密量取对照品一级贮备液1ml置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品二级贮备液；精密量取0.8ml对照品二级贮备液置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀作为对照品溶液；精密量取3ml置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

色谱条件同实施例1，精密量取定量限溶液0.5ml置顶空瓶中，精密加入衍生剂1ml，轧盖密封，平行制备6份，摇匀后进样检测，比较谱图，检测结果见下表6。

表6定量限数据

上表的试验数据表明：定量限溶液连续进样6份，硫酸二甲酯的峰面积RSD为7.7%，小于10.0%，S/N为294.0，大于10；硫酸二乙酯的峰面积RSD为7.0%，小于10.0%，S/N为46.9，大于10。

7、检测限

检测限溶液：取硫酸二甲酯22mg、硫酸二乙酯22mg，精密称定，同置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品一级贮备液；精密量取对照品一级贮备液1ml置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品二级贮备液；精密量取0.8ml对照品二级贮备液置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀作为对照品溶液；精密量取1ml置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得检测限溶液。

色谱条件同实施例1，精密量取检测限溶液0.5ml置顶空瓶中，精密加入衍生剂1ml，轧盖密封，平行制备3份，摇匀后进样检测，记录谱图。具体检测结果见下表7。

表7检测限数据

上表的试验数据表明：检测限溶液连续进样3份，硫酸二甲酯的峰面积RSD为4.3%，小于15.0%，S/N为91.6，大于3；硫酸二乙酯的峰面积RSD为7.2%，小于15.0%，S/N为16.3，大于3；说明本检测方法可以检测到浓度为 6.5530ng/ml硫酸二甲酯。

8、检测限加入

取供试品（供试品为硫酸羟氯喹，批号为SQK-190401-M）10mg，精密称定，置顶空瓶中，精密加入检测限溶液0.5ml，衍生剂1ml，轧盖密封，振摇使溶解，摇匀，作为检测限加入溶液（平行配制2份）。

色谱条件同实施例1，取检测限加入溶液，顶空进样检测，注入气相色谱仪中，观察谱图，结果如下表8。

表8检测限加入数据

上表的试验数据表明：加入到样品中能检出检测限浓度的杂质，S/N均大于3。

上述试验说明本发明的检测方法检测限度低，灵敏度好。

9、重复性考察

对照品溶液：取硫酸二甲酯22mg、硫酸二乙酯22mg，精密称定，同置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品一级贮备液；精密量取对照品一级贮备液1ml置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品二级贮备液；精密量取0.8ml对照品二级贮备液置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

供试品（供试品为硫酸羟氯喹，批号为SQK-190401-M）溶液（临用新制）：取供试品10mg，精密称定，置顶空瓶中，精密加入稀释剂0.5ml，衍生剂1ml，轧盖密封，振摇使溶解，摇匀，即得（平行配制6份)。

色谱条件同实施例1，精密量取对照品溶液0.5ml置顶空瓶中，精密加入衍生剂1ml，轧盖密封，摇匀后进样检测，并取各供试品溶液进样检测，记录谱图并记录数据见表9。按外标法计算杂质含量，峰面积低于对照品溶液峰面积0.1倍的杂质计为未检出。

表9重复性数据

上表的试验数据表明：对照品溶液中各杂质S/N均大于50；6份供试品中各杂质均未检出；由此可见，本发明的检测方法重复性良好。

10、中间精密度

对照品溶液：取硫酸二甲酯22mg、硫酸二乙酯22mg，精密称定，同置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品一级贮备液；精密量取对照品一级贮备液1ml置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品二级贮备液；精密量取0.8ml对照品二级贮备液置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

供试品（供试品为硫酸羟氯喹，批号为SQK-190401-M）溶液（临用新制）：取供试品10mg，精密称定，置顶空瓶中，精密加入稀释剂0.5ml，衍生剂1ml，轧盖密封，振摇使溶解，摇匀，即得（平行配制6份)。

色谱条件同实施例1，精密量取对照品溶液0.5ml置顶空瓶中，精密加入衍生剂1ml，轧盖密封，摇匀后进样检测，并取各供试品溶液进样检测，记录谱图并比较，结果如表10和表11。按外标法计算杂质含量，峰面积低于对照品溶液峰面积0.1倍的杂质计为未检出。

表10中间精密度数据

表11精密度数据统计

表10和表11的试验数据表明：对照品溶液中各杂质S/N均大于50；12份供试品中各杂质均未检出，由此可见，本发明的检测方法精密度良好。

11、回收率

对照品溶液：取硫酸二甲酯22mg、硫酸二乙酯22mg，精密称定，同置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品一级贮备液；精密量取对照品一级贮备液1ml置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品二级贮备液；精密量取0.8ml对照品二级贮备液置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

供试品（同实施例1）溶液（临用新制）：取供试品10mg，精密称定，置顶空瓶中，精密加入稀释剂0.5ml，衍生剂1ml，轧盖密封，振摇使溶解，摇匀，即得。

100%回收供试品溶液：取供试品10mg，精密称定，置顶空瓶中，精密加入对照品溶液0.5ml，衍生剂1ml，轧盖密封，振摇使溶解，摇匀，即得（平行配制6份）。

色谱条件同实施例1，精密量取对照品溶液0.5ml置顶空瓶中，精密加入衍生剂1ml，轧盖密封，摇匀后进样检测，并取供试品溶液、100%回收供试品溶液进样检测，记录谱图。按外标法计算杂质的回收率见式1，结果见下表12和13。

表12硫酸二甲酯回收率测试数据

表13硫酸二乙酯回收率测试数据

表12和表13的试验数据表明：100%浓度水平，各杂质的回收率均应在70.0%-130.0%；回收率RSD均小于10.0%；由此可见，本发明的检测方法准确度高。

12、耐用性

分别在正常条件、不同衍生剂加入量（1±0.1ml）、不同初始柱温（45±5℃）、不同流速（1±0.1ml/min）、不同进样口温度（240±5℃）、不同检测器温度（250±5℃）、不同平衡温度（60±5℃）、不同分流比（50±5：1）的微小变化下，进行耐用性考察。

对照品溶液：取硫酸二甲酯22mg、硫酸二乙酯22mg，精密称定，同置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品一级贮备液；精密量取对照品一级贮备液1ml置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品二级贮备液；精密量取0.8ml对照品二级贮备液置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

供试品（同实施例1）溶液（临用新制）：取本品约10mg，精密称定，置顶空瓶中，精密加入对照品溶液0.5ml，衍生剂1ml，轧盖密封，振摇使溶解，摇匀，即得。

色谱条件同实施例1，精密量取空白溶剂（稀释剂）、对照品溶液各0.5ml置顶空瓶中，各精密加入衍生剂1ml，轧盖密封，摇匀后在上述条件下进样检测，并取供试品溶液在上述条件下进样检测，记录谱图，结果见下表14和表15：

表14耐用性-系统适用性

表15耐用性-含量

表14和表15的试验数据表明：该方法在不同衍生剂加入量（1±0.1ml）、不同初始柱温（45±5℃）、不同流速（1±0.1ml/min）、不同进样口温度（240±5℃）、不同检测器温度（250±5℃）、不同平衡温度（60±5℃）、不同分流比（50±5：1）的微小变化下，系统适用性均满足要求；与正常条件相比，含量差值均小于1.0ppm。由此可见，本发明的检测方法耐用性良好。

从上述验证试验可知，本发明的硫酸羟氯喹中硫酸二甲酯、硫酸二乙酯的检测方法，经方法验证，空白溶剂、供试品中硫酸二甲酯衍生物、硫酸二乙酯衍生物均小于检测限；硫酸二甲酯衍生物、硫酸二乙酯衍生物理论板数均大于3000；硫酸二甲酯衍生物、硫酸二乙酯衍生物分离度大于1.5。本发明的检测方法专属性良好，系统适用性良好，线性关系良好。定量限溶液连续进样6份，硫酸二甲酯的峰面积RSD为7.7%，小于10.0%，S/N为294.0，大于10；硫酸二乙酯的峰面积RSD为7.0%，小于10.0%，S/N为46.9，大于10。检测限溶液连续进样3份，硫酸二甲酯的峰面积RSD为4.3%，小于15.0%，S/N为91.6，大于3；硫酸二乙酯的峰面积RSD为7.2%，小于15.0%，S/N为16.3，大于3。样品中加入检测限浓度的杂质，能被有效检出；本发明的检测方法精密度良好，准确度高，系统适用性均满足要求，耐用性良好。总之，本发明的检测方法适用于硫酸羟氯喹中硫酸二甲酯、硫酸二乙酯的检测。

对比例1

本实施例提供了一种硫酸羟氯喹中硫酸二甲酯、硫酸二乙酯的检测方法，与实施例1的方法基本相同，唯一区别在于：衍生剂仅为碘化钠溶液。

结果如下：

1）专属性

空白溶剂、供试品不干扰杂质检测；

硫酸二甲酯在3.266min出峰，峰面积：2146.231，理论板数：78170.3。硫酸二乙酯在3.799min出峰，峰面积：364.415，理论板数：61979.4。

2）灵敏度

硫酸二甲酯在7ng/ml下 S/N 564.8。

硫酸二乙酯在7ng/ml下 S/N 73.4。

3）系统适用性

连续进样五针，硫酸二甲酯峰面积RSD为4.1%。

硫酸二乙酯峰面积RSD为3.6%。

4）线性

硫酸二甲酯在14.4ng/ml-115.2ng/ml浓度范围内；

线性方程：y = 35.951x+ 52.206，相关系数：0.998；硫酸二乙酯在14.4ng/ml-115.2ng/ml浓度范围内线性方程：y = 4.9371x+ 44.484，相关系数：0.996；

回收率（57ng/ml）

硫酸二甲酯在57ng/ml下回收率111.0%；

硫酸二乙酯在57ng/ml下回收率106.2。

5）检测限加入（7ng/ml），结果如下表16：

表16 加入7ng/ml的检测结果

6）衍生剂加入量

硫酸羟氯喹10mg在0.5ml衍生剂中不能完全溶解，调整衍生剂（碘化钠溶液）加入量为1ml，结果如下表17和表18。

表17 衍生剂加入量为0.5ml

表18 衍生剂加入量为1ml

以上结果显示：本对比例的衍生剂仅采用碘化钠溶液，峰形较差，加入7ng/ml时杂质S/N均大于50，说明只采用碘化钠作为衍生物，检测不够灵敏；本发明采用无水碘化钠和硫代硫酸钠作为衍生物，检测更加灵敏。

对比例2

本实施例提供了一种硫酸羟氯喹中硫酸二甲酯、硫酸二乙酯的检测方法，与实施例1的方法基本相同，区别在于：

衍生剂为碘化钠溶液，量取衍生剂0.5ml，样品溶液0.5ml，同置顶空瓶中，顶空衍生；

检测时的分流比为20:1；

稀释剂为80%的乙腈。

结果显示：

1.空白、供试品不干扰检测；

2.硫酸二甲酯、硫酸二乙酯峰形较差。

对比例3

本对比例提供了一种硫酸羟氯喹中硫酸二甲酯、硫酸二乙酯的检测方法，采用GCMS方法直接对硫酸二甲酯和硫酸二乙酯进行检测，未加入衍生剂，首先对其定性扫描后，选取定量离子进行定量研究。

色谱柱：HP-5 MS UI 30m*0.25mm*0.25um

进样口温度：290℃

辅助加热器温度：270℃

分流比：10:1

进样体积：1μl

柱流速：0.5ml/min

升温程序如下表19：

表19 升温程序

MS部分：扫描模式：Scan 扫描范围：10-550

溶剂延迟：3.5min

试验结果如下：

（1）定性扫描结果如下表20：

表20定性扫描结果

（2）选取定量离子进行定量研究

MS部分实验条件：

定量离子：95（硫酸二甲酯）、125（硫酸二乙酯）

通道停留时间：均为100ms

溶剂延迟：3.5min

MS运行时间：8min

结果如下表21-23：

表21 灵敏度

表22 系统适用性

表23 溶液稳定性

结论：硫酸二甲酯浓度在35.0ng/ml-233.4ng/ml范围内，相关系数r-0.991；硫酸二乙酯浓度在35.4ng/ml-235.8g/ml范围内，相关系数r-0.989；相关系数均小于0.995，线性关系不好。GCMS方法灵敏度低，溶液稳定性不好，线性不符合要求。

验证试验

采用实施例1的检测方法对51批代表性样品（均来自国内制药公司的硫酸羟氯喹）中的硫酸二甲酯及硫酸二乙酯进行检测，检测结果如下表24：

表24代表性批次检测结果

续表24

表24的试验数据表明：51批代表性样品中硫酸二甲酯及硫酸二乙酯检测结果均符合限度要求。

方法再确认

为了验证以上方法（GC-ECD）的可靠性，采用GCMS对检测方法进行确认。

（1）定性确认

实验条件：

色谱柱 DB-WAX MS 30m*0.25mm*0.25μm；

程序升温：初温45℃保持6分钟，以40℃/min的升温速率升到135℃。

进样口温度：240℃

检测器：MS；离子源：EI；辅助加热器温度：250℃；扫描范围：10-550

溶剂延迟：2min；MS运行时间4.5min；

柱流速：1.0ml/min ；

载气：氦气；

分流比：50：1

进样体积：1ml（顶空）

顶空平衡温度：60℃；定量环温度：90℃；传输线温度：100℃；顶空平衡时间：30min；

样品配制：

衍生剂：精密称取无水碘化钠60g，硫代硫酸钠30mg，同置50ml量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。操作及存储均在避光阴凉处。

对照品溶液的配制：取硫酸二甲酯22mg、硫酸二乙酯22mg，精密称定，同置50ml量瓶中，用稀释剂（乙腈）稀释至刻度，摇匀，作为对照品一级贮备液；精密量取对照品一级贮备液1ml置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

精密量取对照品溶液0.5ml置顶空瓶中，精密加入衍生剂1ml，轧盖密封，进样检测，记录总离子流图，对各峰进行定性确认。

结果：RT2.191的峰特征离子为141.9、126.9，数据库确认为碘甲烷（匹配度95.6%）；RT2.685的峰特征离子为155.9、126.9，数据库确认为碘乙烷（匹配度94.3%）。

（2）定量确认

照气相色谱-质谱联用法（中国药典2020年版四部通则0521、0431）测定。

实验条件：

色谱柱 DB-WAX MS 30m*0.25mm*0.25μm；

程序升温：初温45℃保持6分钟，以40℃/min的升温速率升到135℃。

进样口温度：240℃；

检测器：MS；离子源：EI；辅助加热器温度：250℃；

质谱采集模式：SIM ；定量离子：142（硫酸二甲酯），156（硫酸二乙酯）；通道停留时间：均为100ms；

溶剂延迟：2min； MS运行时间4.5min；

柱流速：1.0ml/min；

载气：高纯氦；

分流比：50：1；

进样体积：1ml（顶空）；

顶空平衡温度：60℃；定量环温度：90℃；传输线温度：100℃；顶空平衡时间：30min；

样品配制：

对照品溶液的配制：取硫酸二甲酯22mg、硫酸二乙酯22mg，精密称定，同置50ml量瓶中，用稀释剂（乙腈）稀释至刻度，摇匀，作为对照品一级贮备液；精密量取对照品一级贮备液1ml置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品二级贮备液；精密量取0.8ml对照品二级贮备液置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

检测限溶液：精密量取对照品溶液1ml置10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液的配制（临用新制）：取验证试验中的一个代表性批次（04-SQK-200705-M批）10mg，精密称定，置顶空瓶中，精密加入稀释剂0.5ml，衍生剂1ml，轧盖密封，振摇使溶解，摇匀，即得。

取稀释剂作为空白溶剂，分别精密量取空白溶剂、对照品溶液、检测限溶液各0.5ml分置顶空瓶中，各精密加入衍生剂1ml，轧盖密封，进样检测，并取供试品溶液，进样检测，记录质谱图。按外标法计算各杂质含量。结果见下表25：

表25代表性批次检测结果

上表的试验数据表明：样品加入衍生剂后，采用GCMS的检测结果与GC-ECD方法的检测结果基本一致，进一步验证了本发明的检测方法精密度良好，准确度高，适用于硫酸羟氯喹中硫酸二甲酯、硫酸二乙酯的检测。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。