益生菌牙膏对口腔致病菌抑菌效果的评价方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种益生菌牙膏对口腔致病菌抑菌效果的评价方法。

背景技术

口腔中定殖的细菌达700多种，构成了复杂的微生态系统，当这一系统失衡时，其中的有害菌例如变异链球菌（S.

益生菌是一类对人体健康有益的活的微生物，主要通过分泌抗菌物质、与致病菌竞争性定殖、调节毒力相关基因表达、调节宿主免疫反应、调节氧化应激反应、参与硝酸盐—亚硝酸盐—一氧化氮代谢循环通路、调整生物膜pH值等过程发挥其益生效能。

刷牙等物理清洁方式是维持口腔健康状态的重要手段，而利用益生菌对有害菌的抑制作用改善口腔微生态，则是近年兴起的促进口腔健康的新颖途径。

牛津杯法，是国内外较为通用且认可的抑菌试验方法，该方法能更好的利用有效物质在特定试验敏感菌的琼脂培养基内进行球形立体扩散的原理，加样量精确，扩散与保持效果更为持久，能有效减小体外实验误差。结合实际刷牙时牙膏在口腔中的充盈状态，杯碟法所使用的牛津杯中的样品状态与口腔更为接近。

益生菌牙膏的抑菌效果如何，采用什么口腔致病菌进行测评，目前文献报道较少。大部分采用牛津杯作为抑菌试验方法都是将抑菌检测平板接菌和牛津杯中加抑菌物质同步进行，但是这个方法并不能模拟真实口腔致病菌与牙膏对口腔作用的关系，口腔中根植的致病菌是长期（提前）定植状态。

基于以上问题，本发明引入提前定植口腔致病菌（变异链球菌、远缘链球菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌和幽门螺旋菌）方法，模拟致病菌定植于口腔中，先将检测平板培养至整板表面铺满致病菌（变异链球菌、远缘链球菌36℃需氧48h，具核梭杆菌36℃厌氧48h，牙龈卟啉单胞菌36℃厌氧7d，幽门螺杆菌36℃微需氧（6%O2、7.2%CO2、7.2%H2、79.7%N2）培养96h），再于牛津杯中加入牙膏样品，每个牛津杯孔加入200µL进行抑菌效果验证。相比同步接种法，该方法模拟口腔中致病菌与牙膏作用的状态，更能反映牙膏对口腔致病菌的作用。

但是该方法在实际抑菌效果评价中遇到了许多问题，主要是致病菌制备中幽门螺杆菌的定量制备、抑菌检测平板的制备等，但都在该发明中得到了解决。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明设计的目的在于提供一种可模拟口腔中致病菌与牙膏作用状态的益生菌牙膏对口腔致病菌抑菌效果的评价方法。

具体通过以下技术方案加以实现：

益生菌牙膏对口腔致病菌抑菌效果的评价方法，包括以下步骤：

1）口腔致病菌种类的选择及制备相应致病菌的菌悬液；

2）抑菌圈平板培养基的选择及制备：根据步骤1）制得的菌悬液选择相应的平板培养基，平板制备包括顶层培养基和底层培养基，牛津杯插入到顶层培养基和底层培养基的交界处，制备完整的抑菌检测平板；

3）模拟致病菌定植于口腔中的场景：先将步骤2）制得的抑菌检测平板培养至整板表面铺满致病菌，备用；

4）益生菌牙膏的制备：模拟牙膏与口腔接触的实际场景，牙膏制备为原液1份及与纯水1:1稀释液1份，同时，设置阳性对照为2ug/mL诺氟沙星，阴性对照为无菌纯水，加入步骤3）表面铺满致病菌的抑菌检测平板上的牛津杯中，每孔分别加入200µL后继续培养；

5）使用自动计数仪测量抑菌圈的直径，抑菌圈标准判断及抑菌效果评价方法：抑菌圈直径大于20mm为高度敏感，15～20mm为中度敏感，7～15mm为轻度敏感，小于7mm为无抑制活性。

进一步地，口腔致病菌种类为变异链球菌、远缘链球菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌及幽门螺杆菌。

进一步地，致病菌的菌悬液采用以下方法制备：

1） 复苏：变异链球菌、远缘链球菌,划线接种于 BHI琼脂于36℃培养48h；具核梭杆菌，划线接种厌氧菌琼脂于36℃厌氧培养48h；牙龈卟啉单胞菌，划线接种厌氧菌琼脂于36℃厌氧培养7天；幽门螺杆菌，使用哥伦比亚血琼脂于36℃微需氧条件下培养96h；

2）活化：变异链球菌、远缘链球菌，从培养的各平板上各挑取一环菌接种在BHI琼脂斜面上，36℃有氧培养48h；具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌，从培养的各平板上各挑取一环菌接种在厌氧菌琼脂斜面上，具核梭杆菌36℃厌氧培养48h，牙龈卟啉单胞菌36℃厌氧培养7d；幽门螺杆菌，从培养的平板上挑取一环接种于幽门螺旋杆菌液体培养基中36℃微需氧条件下培养96h；

3）菌悬液制备：吸取3.0 ml～5.0ml无菌PBS加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用5.0ml吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合振荡20s，或在手掌上振敲80次，以使细菌悬浮均匀；初步制成的菌悬液，先用细菌浓度比浊测定法粗测其含菌浓度，然后以稀释液稀释至浓度为1.0×10

进一步地，微需氧条件是指6%O

进一步地，平板制备具体步骤为：

先在无菌培养皿中倾注10mL无菌BHI琼脂，待凝固后作为底层；顶层培养基按照菌悬液:培养基1：9体积比混合，充分混匀后倾注10mL于底层培养基上，在顶层培养基未完全凝固前，插入牛津杯，牛津杯插入于底层和顶层交界处，制备成完整的抑菌检测平板。

进一步地，平板制备过程中培养基选用BHI琼脂培养基，幽门螺杆菌选择使用哥伦比亚雪琼脂。

进一步地，平板培养具体为变异链球菌、远缘链球菌36℃需氧48h、具核梭杆菌36℃厌氧48h、牙龈卟啉单胞菌36℃厌氧7d，幽门螺杆菌36℃微需氧培养96h。

本发明具有以下有益效果：

1）提供了符合实际应用场景的牙膏样品制备方法；

2）提供了5种口腔致病菌，变异链球菌、远缘链球菌、核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌、幽门螺杆菌配制成菌悬液的方法；

3）提供了抑菌圈平板的制作方法；

4）提供接近口腔中致病菌与牙膏对于口腔作用的先后顺序的抑菌效果的评价方式，对于益生菌牙膏的体外抑菌效果作用评价提供了科学的方法。

附图说明

图1 益生菌牙膏（原液）对提前定植牙龈卟啉单胞菌的抑菌效果图（左：牙龈卟啉单胞菌定植图；右：加入益生菌牙膏后抑菌效果图）；

图2 益生菌牙膏（原液）对提前定植具核梭杆菌的抑菌效果图（左：具核梭杆菌定植图；右：加入益生菌牙膏后抑菌效果图）。

具体实施方式

以下结合说明书附图及具体实施例对本发明做进一步详细描述，以便更好地理解本技术方案。

益生菌牙膏对口腔致病菌抑菌效果的评价方法：

步骤一、口腔致病菌种类的选择及菌悬液的制备，所述口腔致病菌为变异链球菌、远缘链球菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌及幽门螺杆菌，菌悬液制备方法：（1）复苏：变异链球菌、远缘链球菌,划线接种于 BHI琼脂于36℃培养48h；具核梭杆菌，划线接种厌氧菌琼脂于36℃厌氧培养48h；牙龈卟啉单胞菌，划线接种厌氧菌琼脂于36℃厌氧培养7天；幽门螺杆菌，使用哥伦比亚血琼脂于36℃微需氧（6%O

步骤二、抑菌圈平板培养基的选择及制备，平板制备分为2步，顶层培养基及底层培养基，先在无菌培养皿中倾注10mL无菌BHI琼脂，待凝固后作为底层。顶层培养基按照菌悬液:培养基（BHI琼脂，幽门螺杆菌选择使用哥伦比亚血琼脂）1：9体积比混合，充分混匀后倾注10mL于底层培养基上，在顶层培养基未完全凝固前，插入牛津杯，牛津杯插入于底层和顶层交界处，制备成完整的抑菌检测平板。

步骤三、模拟致病菌定植于口腔中的场景，先将检测平板培养至整板表面铺满致病菌（变异链球菌、远缘链球菌36℃需氧48h、具核梭杆菌36℃厌氧48h、牙龈卟啉单胞菌36℃厌氧7d，幽门螺杆菌36℃微需氧（6%O2、7.2%CO2、7.2%H2、79.7%N2）培养96h），备用；

步骤四、益生菌牙膏的制备，模拟人体刷牙使用牙膏浓度性状的实际场景，所述牙膏制备为原液1份及与纯水1:1稀释液1份，同时，设置阳性对照为2ug/mL诺氟沙星，阴性对照为无菌纯水，加入步骤三的备用检测平板中的牛津杯中，每孔分别加入200µL后继续培养；

步骤五、使用自动计数仪测量抑菌圈的直径，抑菌圈标准判断及抑菌效果评价方法：抑菌圈直径大于20 mm为高度敏感，15～20 mm为中度敏感，7～15 mm为轻度敏感，小于7mm为无抑制活性。

实施例1

从市面采购的益生菌牙膏，使用牙龈卟啉单胞菌作为抑菌试验对象，牙龈卟啉单胞菌，使用厌氧菌琼脂于36℃厌氧培养7天，从培养的各平板上各挑取一环菌接种在BHI琼脂斜面上，牙龈卟啉单胞菌36℃厌氧培养7d，菌悬液制备浓度为1.0×10

实施例2

从市面采购的益生菌牙膏，使用作为具核梭杆菌抑菌试验对象，具核梭杆菌，使用厌氧菌琼脂于36℃厌氧培养48h，从培养的各平板上各挑取一环菌接种在BHI琼脂斜面上，具核梭杆菌36℃厌氧培养48h，菌悬液制备浓度为1.0×10