一种针对Kdo糖蛋白缀合物的单克隆腹水抗体及其应用

技术领域

本发明涉及药物领域，特别涉及一种针对Kdo糖蛋白缀合物的单克隆腹水抗体及其应用。

背景技术

面对抗生素的挑战，细菌可以迅速演变出耐药性，甚至演变成具有多重耐药性的超级细菌。尤其是感染率很高的严重耐药致病菌之一的金黄色葡萄球菌，会引起骨髓炎、肺炎、脑膜炎和中毒性休克综合征等严重甚至致命性疾病。随着耐药细菌在世界范围内的泛滥以及感染病例的不断上升，人类有可能重新面临没有抗生素可用的危险局面。目前已经上市的脑膜炎奈瑟菌疫苗，b型流感嗜血杆菌疫苗，肺炎链球菌疫苗、伤寒杆菌疫苗等的抗菌范围较窄，对耐药菌预防和诊断的方法仍然具有一定的局限性。因此，需要研发针对不同耐药菌的疫苗和诊断工具，让人类获得更多对抗耐药细菌感染的工具。

3-脱氧-D-甘露-2-辛酮糖酸(Kdo)属于存在于耐药菌细胞壁表面的一种特异性的高度保守结构，通常参与维持细胞膜的完整性，又可以刺激免疫系统产生特异性抗体，具有优秀的免疫原性，对于开发针对耐药菌感染的疫苗和诊断工具有重要的潜在应用价值。

为了进一步探索Kdo衍生物在抗耐药菌疫苗和细菌检测及诊断中的应用，需要将其与适当的载体蛋白偶联后形成糖蛋白缀合物，引起T细胞依赖性的免疫应答，有效增强糖类物质的免疫原性，这是开发糖类疫苗的一个重要策略。与已报道的抗菌糖蛋白缀合物疫苗相比，本发明利用结构简单且构型明确的Kdo糖蛋白缀合物作为抗原，小剂量即能够在体内激发出大量抗体，通过单克隆技术制备的单克隆腹水抗体表现出与Kdo存在于细菌表面不同部位的耐药菌，如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等，有着不同的识别和结合能力，有潜力应用于抗耐药菌疫苗和诊断工具的开发。

发明内容

本发明的第一个目的在于，提供一种可以产生针对Kdo糖蛋白缀合物的单克隆腹水抗体的Kdo单克隆杂交瘤细胞株。

本发明的第二个目的在于，提供一种针对Kdo糖蛋白缀合物的单克隆腹水抗体，单克隆抗体可以作为含有Kdo结构的耐药细菌的诊断工具，并有潜力应用于抗菌疫苗的开发。

本发明的第三个目的在于，提供Kdo单克隆杂交瘤细胞株的应用。

为了实现本发明第一个目的，本发明提供了一种Kdo单克隆杂交瘤细胞株，其保藏编号为CCTCC NO:C2022211。

杂交瘤细胞株命名为Kdo单克隆杂交瘤细胞株3N11，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏日期为2022年09月18日，保藏编号为CCTCC NO：C2022211。

为了实现本发明第二个目的，本发明提供了一种针对Kdo糖蛋白缀合物的单克隆腹水抗体，由所述Kdo单克隆杂交瘤细胞株所分泌。

为了实现本发明第三个目的，本发明提供了所述Kdo单克隆杂交瘤细胞株在制备金黄色葡萄球菌或大肠杆菌抗菌疫苗中的应用。

进一步的，还提供所述Kdo单克隆杂交瘤细胞株在制备耐药菌检测和诊断试剂中的应用，所述耐药菌是指耐金黄色葡萄球菌或耐大肠杆菌。

在本发明的优选实施例中，Kdo糖蛋白缀合物结构式如CRM197-1或HSA-1所示：

在下述实施例中，过量的化学交联剂双琥珀酰亚胺戊二酸酯与Kdo单糖C-2位衍生的氨基反应形成酰胺键，转化为相应的活化单酯，通过离心萃取法有效除去有机溶剂后，与载体蛋白CRM197或HSA共价偶联，并使用超滤离心法进行蛋白的浓缩和纯化获得Kdo糖蛋白缀合物。利用10％十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-4800plus)分析并计算平均每个载体蛋白偶联上的单糖数量。

在本发明优选实施例中，Kdo糖蛋白缀合物与弗氏佐剂(FA)混合形成乳剂，按照0-14-28天的免疫程序腹股沟皮下免疫雌性C57BL/6J小鼠，混合乳剂诱导产生更多的交叉反应抗体，并于最后一次免疫7天后取眼眶血分离得到抗血清，通过酶联免疫吸附实验结果发现小鼠血清中IgG抗体滴度水平显著提高，免疫应答强烈。尤其是IgG1、IgG2b、IgG3抗体滴度水平也有明显的升高，证明该糖蛋白缀合物能诱导机体产生较强的T细胞依赖性保护性免疫反应，可以作为开发抗耐药菌疫苗的潜在抗原。

在优选实施例中，Kdo糖蛋白缀合物与弗氏佐剂(FA)混合形成乳剂，按照0-14-28-42天的免疫程序皮下多点免疫雌性BALB/c小鼠，并于最后一次免疫7天后取眼眶血选择抗血清效价达到8K稀释度的小鼠。按照B淋巴细胞能够产生抗体，瘤细胞体外无限传代的原理，提取小鼠脾脏和淋巴组织与对数生长期并预先用8-AG处理的骨髓瘤SP2/0细胞融合形成既可以无限增殖又可以产生抗体的杂交瘤细胞，并进行多次细胞亚克隆，直至得到Kdo抗原识别率达到100％的细胞株。继续将挑选出的细胞株腹腔注射10周龄左右的BALB/c小鼠体内，一周后采集腹水得到针对Kdo的大量腹水单抗。

在优选实施例中，选取含有或不含有Kdo结构的几种灭活耐药菌首先与单抗腹水抗体共孵育，基于AF488的山羊抗小鼠IgG抗体(绿色)染色标记，可以抽取约10％的细菌通过流式细胞仪进行荧光分析，并可利用共聚焦激光显微镜(LeicaTCS SP8)观察灭活细菌和腹水抗体之间的结合情况。实验结果表明Kdo存在于细菌表面不同位置时，细菌与单克隆腹水抗体的结合结果差异明显，因此大量制备的单克隆抗体可以作为含有Kdo结构的耐药细菌的诊断工具，并有潜力应用于抗菌疫苗的开发。

本发明的优点在于，本发明提供一种Kdo单克隆杂交瘤细胞株，可以产生针对Kdo糖蛋白缀合物的单克隆腹水抗体，表现出与Kdo存在于细菌表面不同部位的耐药菌，如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等，有着不同的识别和结合能力，有潜力应用于抗耐药菌疫苗和诊断工具的开发。

附图说明

图1A和图1B所示的是本发明实施例1中获得的糖蛋白缀合物CRM197-1的表征结果。

图2所示的是本发明所述糖蛋白缀合物CRM197-1在C57BL/6J小鼠体内的免疫反应结果。

图3为ELISA分析六种腹水3N11、4G9、4P20、2E6、3N14和2G20的IgG抗体滴度。

图4为免疫荧光分析腹水单克隆抗体3N11、2E6、2G20分别与灭活细菌的结合，其中(4A、4C、4E、4G、4I、4K)激光共聚焦显微镜观察灭活细菌的AF488荧光标记结果；(4B、4D、4F、4H、4J、4L)流式细胞仪分析腹水3N11、2E6、2G20与灭活细菌的结合。注：灭活细菌：灭活肺炎链球菌-19F(Streptococcus pneumoniae-19F,ATCC49619/BNCC238812)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,ATCC6538/BNCC186335)、大肠杆菌-K12(Escherichia coli-K12,ATCC25404/BNCC313406)、大肠杆菌-DH5α(Escherichia coli-DH5α)、产碱普罗威登斯菌-O36(Providencia alcalifacien-O36,ATCC9886/BNCC137352)、幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori,NCTC 11637)；(a)未经腹水处理的细菌，(b)腹水3N11处理的细菌，(c)腹水2E6处理的细菌，(d)腹水2G20处理的细菌；关联的面板a’-c’显示明场图像，关联的面板a”-c”显示AF488荧光场和明场叠加的图像，白条的长度为10μm。

具体实施方式

以下，结合具体实施方式对本发明的技术进行详细描述。应当知道的是，以下具体实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本发明，而非对本发明的限制。

实施例1.Kdo糖蛋白缀合物

在本实施例中，提供一种Kdo糖蛋白缀合物，使用的Kdo单糖衍生物由本课题组合成研究的同学提供，也可以根据Gold(I)-catalyzed Synthesis of β-Kdo GlycosidesUsing Kdo ortho-Hexynylbenzoate as Donor.Xuemeng Mi,Qixin Lou,Wenjing Fan,Liqin Zhuang,You Yang*.Carbohydr.Res.2017,448,161–165.中公开的方法进行合成。该糖蛋白缀合物由Kdo衍生物与载体蛋白CRM197通过连接子二(N-羟基琥珀酰亚胺)戊二酸酯(DSG)连接而成，具有结构式CRM197-1的结构：

在本实施例中，以活化酯法将Kdo衍生物和连接子二(N-羟基琥珀酰亚胺)戊二酸酯偶联。然后，将活化后的Kdo衍生物连接到载体蛋白CRM197上，得到所述糖蛋白缀合物CRM197-1。

在本实施例中，所述糖蛋白缀合物CRM197-1的合成路线为：

所述糖蛋白缀合物CRM197-1的制备方法具体为：

向双琥珀酰亚胺戊二酸酯(15mg，46μmol)和三乙胺(10μL,0.07mmol)的DMSO溶液(200μL)中加入Kdo衍生物1(1.5mg,4.6μmol)的DMSO溶液(80μL)。室温搅拌反应2小时后，反应液中加入PBS(100mM,pH＝7.4,640μL)，再加入5mL氯仿离心萃取(2min,1800g)。上层水相移至1.5mL EP管中离心(1min,14500g)，至观察溶液无分层时取上层水相。取1mg CRM197(17.3nmol,Creative BioMart)溶于1mLPBS(100mM,pH＝7.4)，加入上述水相室温搅拌18小时。反应完全后转移至超滤管(30kDaMWCO,Millipore)加入超纯水和PBS分别离心3次(4000rpm，15min，4℃)，获得所述糖蛋白缀合物CRM197-1。

以10％SDS-PAGE(120V,90min)和MALDI-TOF-MS检测获得的所述糖蛋白缀合物CRM197-1的平均分子量，获得如图1A和图1B所示的结果。结果表明，所述糖蛋白缀合物CRM197-1中每个CRM197蛋白平均连接约9.2个kdo衍生物。

实施例2.糖蛋白缀合物CRM197-1的免疫活性测试

在本实施例中，提供实施例1获得的糖蛋白缀合物CRM197-1的免疫活性测试结果，通过酶联免疫吸附实验的免疫结果表明该糖蛋白缀合物CRM197-1能诱导机体产生较强的免疫应答。产生高滴度的IgG1、IgG2b和IgG3抗体，特别是IgG1和IgG3抗体的产生，表明CRM197-1糖缀合物可以诱导更强有力的T细胞依赖的保护性免疫反应，这对于预防性疫苗是非常理想的。

在本实施例中，所述糖蛋白缀合物CRM197-1的免疫活性测试具体包括以下几个具体步骤。

1.糖蛋白缀合物CRM197-1免疫C57BL/6J小鼠

用6-8周雌性C57BL/6J小鼠(每组4-6只)皮下免疫CRM197-1糖缀合物抗原，给药组每只小鼠在第0天注射含0.4μg糖抗原的糖蛋白缀合物CRM197-1，第14和28天加强免疫含0.8μg糖抗原的糖蛋白缀合物CRM197-1，每只小鼠注射100μL糖蛋白缀合物CRM197-1与弗氏佐剂1:1(V/V)混合制成的乳剂。对照组只注射PBS或PBS加佐剂，给药组只注射糖缀合物抗原或糖缀合物加佐剂。初次免疫加弗氏完全佐剂，加强免疫加弗氏不完全佐剂。在第0,14,21,35天眼眶取血，提取血清。

2.免疫后C57BL/6J小鼠多抗血清酶联免疫吸附实验(ELISA)

使用高结合力96孔酶标板(康宁)进行ELISA试验。将HSA-1(10μg/mL)溶于碳酸盐缓冲液(0.05M,pH＝9.6)中，4℃下静置20小时包被酶标板。第二天，酶标板用PBS-T(含0.1％Tween-20的PBS)洗3次，用2％BSA-PBS在37℃下封闭1小时。PBS-T洗3次后，加入1％BSA-PBS倍比稀释的抗血清,37℃下孵育2小时。PBS-T洗3次，分别加入HRP标记的IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3山羊抗小鼠二抗，37℃下避光孵育1小时。用PBS-T洗3次，加入TMB底物在37℃下孵育20分钟至显色。加入2％硫酸终止反应并用Synergy2多功能酶标仪读取450nm下吸光度，获得如图2所示的检测结果。

结果表明，免疫35天后，小鼠血清中IgG抗体滴度水平显著提高，免疫应答强烈。免疫后IgG1、IgG2b、IgG3抗体滴度水平也有明显的升高。该糖蛋白缀合物能诱导机体产生较强的T细胞依赖性保护性免疫反应。

实施例3.基于Kdo糖蛋白缀合物的腹水单克隆抗体的制备及结合能力评价

1.腹水单克隆抗体的制备：

糖蛋白缀合物CRM197-1与弗氏佐剂(FA)混合形成乳剂后，按照0-14-28-42天的四次常规免疫程序皮下多点注射雌性BALB/c小鼠，并于最后一次免疫一周后提取免疫后血清，ELISA测定后选择血清抗体效价达到1：8K稀释度的小鼠进行细胞融合。提取小鼠脾脏和淋巴细胞与对数生长期的SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，并进行多次细胞亚克隆。通过间接ELISA实验对杂交瘤细胞质控，HSA-1糖蛋白偶联物用作抗原捕获试剂，细胞上清稀释倍数为1：3.125K/6.25K/12.5K/25K/50K/100K，获得6种效价达到1：100K以上的杂交瘤细胞(表1)，认为这6种杂交瘤细胞对Kdo的识别率达到100％。继续将挑选出的杂交瘤细胞进行培养，通过体内制备的方法获得腹水单克隆抗体。将对数生长期的杂交瘤细胞腹腔注射于预先用弗氏不完全佐剂处理的10周龄以上的BALB/c雌鼠体内，一周后收集腹水后离心去除红细胞和油脂，即可获得大量的针对CRM197-1糖蛋白缀合物的腹水单克隆抗体。

表1特异性识别Kdo的6种杂交瘤细胞上清吸光度值

2.腹水单克隆抗体与抗原的结合能力

将HSA-1糖蛋白偶联物作为抗原捕获试剂，PBS处理的小鼠血清为阴性对照，酶标IgG抗体作为研究对象，利用ELISA评价六种腹水单克隆抗体的滴度并计算其效价。

腹水ELISA结果显示，以绿色曲线表示腹水单克隆抗体，蓝色曲线表示第35天血清抗体，橘红色曲线表示PBS空白对照。发现其中五种腹水单克隆抗体的曲线高于表示血清抗体的蓝色曲线，说明腹水单克隆抗体比血清抗体更容易识别Kdo。根据P/N≥2.1为阳性结果的规则，计算六种腹水单克隆抗体的效价，结果发现：腹水3N11、4G9、4P20三者的效价都在1：6400000左右；腹水2E6和3N14二者的效价在1：3200000左右；腹水2G20的效价在1：80000左右(图3)。从每一类效价中各选择一种腹水(3N11、2E6、2G20)再次进行免疫荧光分析，观察不同效价的腹水与细菌结合能力的差别。

3.腹水单克隆抗体与灭活细菌的结合能力

选取一种不含Kdo结构的革兰氏阳性细菌肺炎链球菌-19F与含Kdo结构的细菌形成对照。几种灭活的耐药菌首先与单抗腹水共孵育，基于AF488的山羊抗小鼠IgG抗体(绿色)染色标记，抽取约10％的细菌通过流式细胞仪进行荧光分析，剩余细菌使用激光共聚焦显微镜观察其与腹水抗体之间的荧光结合情况。AF488荧光染料与FITC荧光染料的激发波长(494nm)和发射波长(513nm)基本相同，而且AF488染料的荧光褪色更慢，荧光效果更好，因此本次免疫荧光实验选择AF488作为荧光染料。

结果显示：三种腹水与不含Kdo结构的肺炎链球菌-19F均没有荧光信号出现，表明二者之间不发生结合(图4A、4B)。而免疫荧光实验中，三种腹水均可以与金黄色葡萄球菌产生显著的荧光效果(图4C)，流式数据中三种腹水对应曲线的最高峰较空白组灰色阴影曲线最高峰发生明显位移(图4D)，进一步说明腹水可以与金黄色葡萄球菌可以发生结合。同理可以观察到三种腹水与大肠杆菌-K12的结合也十分明显(图4E、4F)，结合能力次之的是产碱普罗维登斯菌(图4I、4J)，结合较弱的是大肠杆菌-DH5α和幽门螺旋杆菌(图4G、4H、4K、4L)。

综上，腹水单克隆抗体能够更明显的观察到与不同细菌结合的差异性，Kdo结构越靠近细菌表面外层越容易与腹水单克隆抗体发生识别。并且腹水3N11与几种细菌的结合能力最强，可以考虑继续纯化制备成辅助耐药菌检测的医疗诊断工具或试剂。3N11杂交瘤细胞保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏日期为2022年09月18日。所述菌株命名为Kdo单克隆杂交瘤细胞株3N11，保藏编号为CCTCCNO：C2022211。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。