一种微载体及其制备方法，应用

技术领域

本申请涉及生物技术领域，更具体涉及一种微载体及其制备方法，应用。

背景技术

干细胞的分离和大规模培养是干细胞研究及临床应用的前提和基础。然而，通过体外分离获得的干细胞数量十分有限，远不能达到科研和临床的实际需求。另外，在传统的干细胞单层培养中，随着传代次数的增加或培养时间的延长，干细胞逐渐失去自我更新能力、多向分化潜能逐渐减弱和克隆形成率逐渐降低。

近些年，微载体培养技术是一种新兴的大规模细胞培养技术，广泛地应用于组织工程中种子细胞的扩增。细胞微载体培养技术的出现并逐渐成熟，既能保证细胞基质的均一性，又能实现细胞在短时间内高密度生长，成为了目前细胞培养的主流技术。

在微载体培养技术中，微载体是其中重要的组成部分。微载体具有比表面积大等优点，在微载体培养技术中起到决定性作用。但是，现有的微载体并不具备透明的特性，这为进一步观察细胞带来了很多挑战，只能通过荧光染色的方式进行观察细胞，不利于实时观察细胞的生长状态。因此，需要一种具有透明性质的微载体，能够实时对细胞的培养过程进行观察及监测，便于对细胞的培养条件进行及时调整。

发明内容

为了实时观察细胞的生长状态，本申请提供了一种微载体及其制备方法，应用。

第一方面，本申请提供了一种微载体，包括微载体核及包裹在所述微载体核上的表面修饰物；

所述微载体核包括海藻酸钠，阿魏酸和氯化钙。

在本申请中，海藻酸钠，阿魏酸和氯化钙的结合可以形成微载体核，微载体核呈小球状，在微载体核的表面上包裹或包被有表面修饰物，表面修饰物能够促进细胞的贴壁生长，提升了细胞的贴壁效率，制得微载体。所得微载体具有透明、可降解等性质，可以实时进行观察细胞的生长状态，从而调节细胞的扩增培育的条件，将本申请所得微载体用于细胞的扩增培养，能够提高细胞的扩增倍数，使得扩增倍数在5.53倍以上。

在一个实施方案中，所述表面修饰物选自丝素蛋白、明胶或胶原。

在本申请中，所述表面修饰物选择丝素蛋白、明胶和胶原中的一种，丝素蛋白、明胶和胶原中均含RGD三肽序列(Arg-Gly-Asp)，该序列是细胞的识别位点。因此，表面修饰物的主要作用是提供细胞识别的位点，促进细胞贴壁，提高贴壁率，进而能够提高细胞的扩增倍数。表面修饰物为胶原时，Ⅰ型胶原，优选地，所述表面修饰物为丝素蛋白。

第二方面，本申请提供了一种微载体的制备方法，包括以下步骤，

(1)微载体核的制备：将海藻酸钠溶液和阿魏酸进行混合，制得混合液；将所述混合液滴入氯化钙溶液中，制得微载体核；

(2)表面修饰：将所述微载体核置于表面修饰物中，搅拌后，制得微载体。

在本申请中，首先将海藻酸钠加入去离子水中，配制成海藻酸钠溶液；再将海藻酸钠溶液与阿魏酸进行混合，制得混合液；利用微球制备仪抽取混合液，在静电场的作用下推出混合液，混合液被分散成液滴；液滴滴入持续搅拌的氯化钙溶液中，制得微载体核。最后将微载体核放置于由表面修饰物配制的溶液中，搅拌后，即得微载体。

在一个实施方案中，所述海藻酸钠溶液的浓度为1-3％，所述阿魏酸的浓度为1-5％，所述氯化钙溶液的浓度为2-6％。

优先地，所述海藻酸钠溶液的浓度为1-3％，所述阿魏酸的浓度为1-5％，所述氯化钙溶液的浓度为4-6％。

通过采用上述技术方案，当海藻酸钠溶液的浓度大于3％时，浓度过高，导致微载体密度过大，在悬浮培养时搅拌速度也会过大，导致的细胞剪切力过大，影响细胞的成活率；当海藻酸钠溶液的浓度小于1％时，浓度过低，微载体无法成球状，因此，不能应用于细胞的培育过程中。

同样地，当阿魏酸的浓度大于5％时，过多的阿魏酸无法完全被清洗掉，在后期细胞培养过程中，影响细胞的生长，降低细胞的成活率；当阿魏酸的浓度小于1％时，降低了交联效果，从而影响细胞贴壁功效，因此，导致在细胞培育过程中，扩增倍数降低。

同样地，当氯化钙溶液的浓度大于6％时，微载体较脆，将微载体用于细胞培育时容易被破碎，进而影响细胞的培育效率；当氯化钙溶液的浓度小于2％时，微载体成球性不足，难以从液体变成固体小球，因此，在细胞培育时，导致扩增倍数较低。

在一个实施方案中，所述表面修饰物的浓度为0.1％-2％。

通过采用上述技术方案，表面修饰物包裹或包被于微载体核的表面上，从而形成微载体，微载体用于细胞的扩增培养中。在制备微载体过程中，当表面修饰物的浓度大于2％时，所得微载体无法有效地从表面修饰物中分离出来，降低了微载体的生产效率；当表面修饰物的浓度小于0.1％时，在细胞扩增培养过程中，细胞无法有效地贴在所得微载体上，也就是说，细胞的贴壁率较低，最终降低了细胞的扩增倍数。

第三方面，本申请提供了一种微载体在细胞培养中的应用，包括以下步骤，

(1)接种细胞：将所述微载体接种细胞，在反应器上扩增培养；

(2)微载体裂解：向反应器内加入三聚磷酸钠溶液对所述微载体进行裂解，制得细胞悬液；

(3)回收细胞：收集所述细胞悬液中的细胞，进行计数。

在本申请中，利用海藻酸钠，阿魏酸和氯化钙制得微载体核，微载体核具有可降解、透明等优点，可以实时观察效果的生长状态，在微载体核上包裹有表面修饰物，制得微载体，表面修饰物能够促进细胞进行贴壁生长。

将所得微载体用于细胞培养中，在微载体上进行接种细胞，然后将接种细胞后的微载体转移到反应器中进行培养；再向反应器中加入三聚磷酸钠溶液，制得细胞悬液，最后进行收集所得细胞悬液中的细胞，进行计数及分析。

在一个实施方案中，所述三聚磷酸钠溶液的浓度为2-10％。

优选地，所述三聚磷酸钠溶液的浓度为5-8％。

更优选地，所述三聚磷酸钠溶液的浓度为5％。

在反应器中加入三聚磷酸钠溶液，能够对微载体进行降解。本申请中三聚磷酸钠溶液的浓度可以为2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。当三聚磷酸钠溶液的浓度大于10％时，高浓度溶液影响细胞活率；当三聚磷酸钠溶液的浓度小于2％，微载体无法被降解。

目前，利用微载体培养技术进行培养细胞时，培养一段时间后进行收获细胞。采用现有的微载体进行细胞的培养，需要利用酶进行收获，但是，这样收获方式非常容易损伤细胞，直接导致细胞的收获率或扩增倍数的降低。本申请利用三聚磷酸钠溶液能够对由海藻酸钠，阿魏酸和氯化钙制得的微载体进行降解，然后可以进行细胞回收，所以，当微载体降解不充分时，直接影响着细胞的收获率或扩增倍数。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

1、本申请采用天然材料海藻酸钠作为制造微载体的主要材料，再与阿魏酸和氯化钙进行配合，制得微载体具有透明和可降解的特性，能够便于观察细胞的生长状态，以便及时对细胞培养条件进行调节；

2、本申请中在微载体核上包被或包裹有表面修饰物，其中表面修饰物中含有细胞识别的三肽结构，能够促进细胞贴壁伸长，进而提高细胞的扩增倍数；

3、本申请微载体的制备过程中，海藻酸钠溶液的浓度优选为1-3％，阿魏酸的浓度优选为1- 5％，氯化钙溶液的浓度优选为2-6％，将所得微载体用于细胞的扩增培养，细胞的扩增倍数在5.53倍以上；

4、本申请利用三聚磷酸钠对微载体进行降解，有效地提高细胞的扩增倍数。

附图说明

图1为实施例1在显微镜下观察的细胞图；

图2为对比例1在显微镜下观察的细胞图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。

原料

本申请所述原料来源如表1所示，如无特殊说明，均可通过市售获得。

表1本申请所用原料和设备来源

实施例

微载体的制备

实施例1

(1)微载体核的制备：

称量1g海藻酸钠固体，溶于100mL去离子水中，配制1％的海藻酸钠溶液；再加入浓度为 1％的阿魏酸，制得混合液；

称量2g的氯化钙固体，溶于100mL去离子水中，配制2％的氯化钙溶液；利用微球制备仪将制得混合液滴入氯化钙溶液中，制得微载体核；

微球制备仪的转速调整为100转/min，抽液速度调整为1mL/s，推液速度调整为0.01mL/s，电压调整为2000V。机器正常运行时，不考虑物料损失，1L的海藻酸钠溶液可获得约 400mL的微载体核。

(2)表面修饰

利用去离子水将所得微载体核清洗两次，取400mL的微载体核移入1L的微载体包被容器中，再取400mL的丝素蛋白溶液(浓度为1％)加入包被容器中，磁力搅拌10min，充分混匀，制得微载体。

实施例2-8

实施例2-8与实施例1的区别在于，海藻酸钠溶液、阿魏酸、氯化钙溶液和表面修饰物浓度的不同，具体参数如表2所示。

表2实施例2-8与实施例1的区别参数

对比例

对比例1

对比例1为GE微载体Cytodex3，购自于北京智杰方远科技有限公司。

应用例

将上述实施例1-8和对比例1所得微载体进行细胞的培养，具体操作步骤如下：

(1)接种细胞

将培养状态良好的人脐带间充质干细胞(MSC细胞)消化收集，计数。配50mL的细胞悬液待用，细胞密度为10

将无菌处理后的50mL微载体均分到5个50mL的离心管中，每个离心管中加入20mL的培养基；培养基为人脐带间充质干细胞无血清培养基；

每个离心管中加入5mL的细胞悬液，上下颠倒混匀，平躺放于二氧化碳培养箱中，记为培养第1天。第二天观察细胞是否有污染情况，细胞是否贴壁良好。若细胞贴壁良好，将细胞、微载体及其培养基移入500mL反应器中培养。反应器条件参数设置：37摄氏度，35转，间歇搅拌，通入空气和二氧化碳，表层气，流量设置为10。反应罐使用前需高压灭菌，使用反应器前需连接好气路、电极、pH和溶氧电极以及插好温度检测装置。待一切准备就绪，打开电脑软件，按照上述步骤进行参数设置，运行反应器。共培养6天；

(2)微载体裂解

向每个离心管中加入三聚磷酸钠溶液，三聚磷酸钠溶液的浓度为5％。其中对比例1中不需要加入三聚磷酸钠溶液，而是利用TryplE进行收获；

(3)回收细胞

收集所述细胞悬液中的细胞，进行计数。

具体检测结果如表3所示。

表3细胞扩增培养的检测

结合实施例1-8和对比例1并结合表3可以看出，利用海藻酸钠、阿魏酸和氯化钙制得微载体核，在微载体核上包裹有表面修饰物质，制得微载体。将所得微载体用于细胞的扩增培养，经过计数分析，培养6天后，细胞数大于2.77*10

当利用现有的GE微载体进行细胞扩增培养时，培养6天后，细胞数为1.17*10

结合实施例1和对比例1并结合图1和图2可以看出，参照图1，细胞状态良好，可以清晰的看到细胞的轮廓，细胞形态明显，呈梭形；参照图2，细胞形态不明显，细胞呈圆形的点，细胞未充分展开，不易观察细胞形态。

可以理解的是，以上实施方式仅仅是为了说明本申请的原理而采用的示例性实施方式，然而本申请并不局限于此。对于本领域内的技术人员而言，在不脱离本申请的精神和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本发明的保护范围。