双酶耦合催化富马酸合成L-丙氨酸的方法

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及利用两种酶共同作用催化底物富马酸和氨制备L-丙氨酸的方法。

背景技术

丙氨酸是组成人体蛋白质的非必需氨基酸之一，它参与体内氨基的循环、氨基酸与糖源的转换，具有重要的应用价值，也是构成食物美味的要素，L-丙氨酸在国内外已被普遍用于食品中。L-丙氨酸较其他增味剂具有明显的优势。

L-丙氨酸可增加食品的鲜味。目前L-丙氨酸已广泛用于腌制食品、粥、酱油、味噌等食品中，赋予这些食物鲜味和浓郁的香味。在酸味食品中，添加L-丙氨酸后，可缓和酸味。L-丙氨酸对于食醋、柠檬酸等的酸味，在不较大改变pH值的情况下，有中和酸因子、调和食品酸味的特点。L-丙氨酸不仅可以调整咸味或酸味食品的咸味或酸味，还能使食物更加鲜美。L-丙氨酸是甜味很强的氨基酸，甜度为蔗糖的1.2倍。因此，在甜味食品中添加L-丙氨酸后，L-丙氨酸与甜味物质之间相互反应，让食品更加浓甜。L-丙氨酸还可以淡化食物中不愉快的味道，并提高食品味道的持久性。比如，豆乳有豆腥味，蔬菜汁有苦味、涩味等不好的味道，但是其在添加0.2%~1%的丙氨酸后，能明显降低不愉快的味道，使口感更好。L-丙氨酸还可以防止发泡酒老化、减少酵母的臭味，使发泡、发酵酒的风味更加醇和。L-丙氨酸能有效缓和壳聚糖、丹宁等的涩味和收敛味，以及碳酸水素钠、贝壳钙等碱性特有的刺激性味道。还能减少葡萄柚汁等柑橘系饮料的苦味及L-缬氨酸、L-异亮氨酸等分歧氨基酸的苦味。

L-丙氨酸在医药行业具有广泛的用途。具有降低酒精中毒、减肥、增强记忆和学习能力以及治疗认知或精神障碍等作用，同时还可以作为制备L-氨基丙醇、合成依那普利、VB6等的原料。

L-丙氨酸作为一种机体需要的氨基酸，对幼畜内脏氮循环具有一定的生理作用和积极意义，在动物体氨基酸代谢方面起到了非常重要的作用，在机体的生长中具有增强免疫和生糖的作用。饲粮中添加一定量的丙氨酸，可以促进动物生长，缓解应激，预防疾病。

目前市场主要以L-天氨酸和葡萄糖作为生产L-丙氨酸的原料。大多数L-丙氨酸生产商自行获得原料，一些公司需要从其他公司购买。随着L-丙氨酸的发展，原料生产商在一定程度上也受益于L-丙氨酸行业。随着L-丙氨酸下游产品的需求增加，世界L-丙氨酸产能也将继续扩大，L-丙氨酸的生产具有广阔的市场前景。

然而，现有的L-丙氨酸生产工艺中，提纯工段成本较高，且纯度不能满足需求，急需改进生产方法。

发明内容

本发明针对L-丙氨酸生产上的高成本问题，提供一种工艺简单，成本低廉的发酵法制备L-丙氨酸的工艺，利用双酶耦合催化的方式，直接将富马酸溶液作为底物，酶反应转化生成L-丙氨酸，避免常规生产中L-天冬氨酸提纯工段，大大降低了制备L-丙氨酸的成本，并结合膜分离技术实现产物的高纯度分离，将能更加有效提高产品的市场竞争力。

本发明的总体构想是利用发酵法制备的菌种粗酶直接对底物富马酸的氨溶液进行催化反应，过程不进行纯化分离等处理，直接制备L-丙氨酸溶液，通过膜技术处理直接提取L-丙氨酸样品。

为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

一种双酶耦合催化富马酸合成L-丙氨酸的方法，包括如下步骤：

（1）将大肠埃希氏菌在培养基中培养、发酵后处理得到L-天冬氨酸粗酶液；

（2）将产L-天冬氨酸-β-脱羧酶的菌株在培养基中培养培养、发酵后处理得到L-天冬氨酸-β-脱羧酶粗酶液；

（3）将所述L-天冬氨酸粗酶液、所述L-天冬氨酸-β-脱羧酶粗酶液加入富马酸的氨溶液进行催化转化，反应完成后将反应液先后经微滤与超滤处理，获得L-丙氨酸。

优选的，步骤（1）所述的大肠埃希氏菌为ARTP诱变后高酶活的大肠埃希氏菌。

优选的，步骤（1）或步骤（2）所述的培养基为LB培养基。

优选的，步骤（1）或步骤（2）中所述的处理为经碟片分离提取湿菌泥，之后冷冻破壁处理。

优选的，步骤（1）或步骤（2）所述的发酵为在1m³发酵罐中进行。

优选的，步骤（1）或步骤（2）中各级种子的接种量体积比为0.5~1.0%。

优选的，步骤（2）所述的产L-天冬氨酸-β-脱羧酶的菌株为德阿昆哈假单胞菌提取质粒后结合大肠杆菌BL21构建的基因工程菌株。

优选的，步骤（1）或步骤（2）所述的发酵包括如下步骤：

将培养的种子液加入发酵培养基中，于150~200rpm搅拌，28~37℃， 0.6~1.0vvm通气，罐压0.05~0.08Mpa条件下培养18~24小时。

优选的，所述的发酵培养基含有如下组分：蛋白胨12份，酵母粉12份，味精5份，乳糖5份，硫酸镁0.5份，磷酸氢二钾0.25份，甘油1.5份，消泡剂1份以下，余量为水；所述发酵培养基的pH为6.8~8.0。

优选的，步骤（3）中所述富马酸的氨溶液的质量浓度为18~24%。

优选的，步骤（3）所述的催化转化的反应温度为35~45℃，pH为7.5~8.5，于50~100rpm条件下转化65~75小时。

优选的，所述微滤为采用陶瓷微滤膜处理。

本发明的有益效果在于：

本发明直接使用粗酶液与底物反应，省去中间反应所需的L-天冬氨酸的提纯步骤，将繁琐的传统工艺流程精简，减少了生产过程，设备投资，废水处理，降低了生产成本。

附图说明

图1是本发明实施例1的工艺流程示意图。

具体实施方案

下面通过具体实施例对本发明菌种培养、粗酶提取、酶反应转化及膜技术处理提纯作进一步的说明。

实施例1

（1）产L-天冬氨酸酶的大肠（编号CM026）菌株培养。

斜面培养：（LB培养基）蛋白胨 10 g/L 氯化钠 10 g/L 酵母粉 5 g/L，琼脂粉15g/L，PH调节7.0-7.5，接种环蘸取CM026甘油管保存菌株，在斜面培养基上划线，置于30-37℃培养箱培养18-24小时；

摇瓶种子培养：（LB培养基）蛋白胨 10 g/L 氯化钠 10 g/L 酵母粉 5 g/L，定容至1L，pH调节6.8-7.5，灭菌后，接种环括取斜面培养好的菌株接种于摇瓶培养基，150-200rpm，30-37℃培养6-10小时；

1 m

（2）产L-天冬氨酸-β-脱羧酶的工程菌CM036菌株培养。

斜面培养：（LB培养基）蛋白胨 10 g/L 氯化钠 10 g/L 酵母粉 5 g/L，琼脂粉15g/L，PH调节7.0-7.5，硫酸卡那霉素100mg/L，接种环蘸取CM036甘油管保存菌株，在斜面培养基上划线，置于30-37℃培养箱培养18-24小时；

摇瓶种子培养：（LB培养基）蛋白胨 10 g/L 氯化钠 10 g/L 酵母粉 5 g/L，定容至1L，pH调节6.8-7.5，灭菌后加入硫酸卡那霉素100mg/L，接种环括取斜面培养好的菌株接种于摇瓶培养基，150-200rpm，30-37℃培养6-10小时；

1 m

（3）将步骤（1）、（2）的发酵液分别利用碟片机分离固液，提取湿菌泥，置于-15℃左右的冷库保存，其目的利用菌泥及细胞含水成冰的过程将细胞破碎，释放胞内酶。将冷冻后湿菌泥冰块加入底物富马酸溶液，浓度为18-24%，同时加入液氨调控PH，进行催化转化反应。全过程控制反应温度35-45℃，PH7.5-8.5，50-100rpm，转化时长65-75小时，取样检测HPLC，测定L-丙氨酸含量及底物富马酸剩余量。

将反应液先用陶瓷微滤膜处理，除去反应液种固体杂质及破碎细胞；将清液利用超滤膜与纳滤膜处理技术，除去大分子、蛋白及色素。膜处理过程控制温度60-90℃，0.15-0.25Mpa。

将L-丙氨酸溶液粗品浓缩结晶，抽滤烘干，得L-丙氨酸样品。