一种文心兰花粉离体萌发培养液及其制备方法和培养方法

技术领域

本发明涉及文心兰技术领域，具体为一种文心兰花粉离体萌发培养液及其制备方法和培养方法。

背景技术

文心兰是指文心兰属(Oncidium)植物及与其近缘属间杂交种的总称，栽培品种的遗传背景十分复杂。文心兰因花色丰富、花形奇特、花姿优美、且观赏期较长，是重要的观赏兰花，与蝴蝶兰、石斛、大花蕙兰并列为四大洋兰，具有较高的观赏价值和经济价值。我国文心兰种植规模不断增加，但生产用品种绝大多数依靠国(境)外引进，自主知识产权品种缺乏已成为我国文心兰产业发展的瓶颈。

目前，杂交育种仍然是国内外育种家培育文心兰等兰科植物新品种最基本也是最重要的途径。但我国收集保存的文心兰品种资源不仅数量十分有限，且遗传背景过于复杂，除文心兰属内杂交种以外，多为文心兰属与其近缘属间的人工杂交种。高度杂合的文心兰品种资源中花粉无生活力、花粉萌发异常、花粉管生长异常等现象给杂交育种造成了极大的困难，因此，为了提高杂交亲和性，研究鉴定花粉的生活力是必不可少的重要前提。

花粉生活力的测定方法主要有离体萌发测定法、染色测定法和授粉结实测定法等。相较于染色测定法、授粉结实测定法等，花粉离体萌发测定法易于识别、数据可靠、且可完全定量，在植物花粉生活力检测中应用最为广泛。

文心兰的花粉通常粘合成蜡质花粉团，且质地坚硬，极难自然分散。对文心兰而言，有见罗远华等报道采用TTC染色法对文心兰花粉生活力进行了测定[罗远华，黄敏玲，林兵，钟淮钦，叶秀仙，吴建设.文心兰花粉生活力与杂交结荚性研究[J].福建农业学报，2015，30(3)：258-263.]，但与离体萌发测定不相关，且染色液极易污染，有生活力与无生活力花粉的染色界线不分明，测定值偏高[王钦丽，卢龙斗，吴小琴，陈祖铿，林金星.花粉的保存及其生活力测定[J].植物学通报，2002，19(3)：365-373.]。

由鉴于此，研究以期得到一种配制简单、不易污染，利于镜检观察，分散性效果好的用于文心兰花粉离体萌发的培养液，及重复性强、操作简便的文心兰花粉离体萌发培养方法，从而准确掌握文心兰花粉是否具有生活力，为文心兰杂交育种亲本的选配利用等提供参考，是从业人员所迫切希望的。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种文心兰花粉离体萌发培养液及其制备方法和培养方法，解决了急缺一种配制简单、不易污染，利于镜检观察，分散性效果好的用于文心兰花粉离体萌发的培养液，及重复性强、操作简便的文心兰花粉离体萌发培养方法的问题。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种文心兰花粉离体萌发培养液，具体包括以下配方：1000ml培养液中含1.5～3.0gC

优选的，所述配方中余量为蒸馏水。

优选的，一种文心兰花粉离体萌发培养液的制备方法，具体包括以下步骤：

S1.将1.5～3.0g C

S2.然后依次加入并充分溶解50～150g蔗糖、0.01～0.03g H

S3.最后于121℃湿热灭菌20min，冷却至室温后可使用。灭菌后的培养液密闭条件下于5℃可存放60d，取用时在超净工作台上进行。

优选的，一种文心兰花粉离体萌发方法，包括如下具体操作步骤：

a.花粉团的消毒

首先采集花粉，然后在超净工作台上先用70％V/V酒精浸泡10～15S，移除酒精后再用1.0％NaClO消毒10～15min，无菌水清洗2～3次，备用；

b.花粉粒的分散

将消毒好的花粉团置入2ml无菌离心管中，添加利用权利要求1所述培养液1.0ml，浸泡45～60min后，用无菌尖头镊子轻夹花粉团，让花粉粒分散在培养液中，密闭离心管；

c.花粉粒的培养

在培养温度23～27℃，黑暗条件下培养24～72h；

d.花粉萌发的观察

经过24～72h的培养，具生活力的花粉能萌发出花粉管，在光学显微镜下可观察萌发及花粉管生长情况。

优选的，所述步骤d中统计花粉萌发率时，有花粉管长度≥花粉粒直径的花粉才被认作萌发的要求。

优选的，所述步骤a中将当天开放的花朵采集后用自封袋密封于冰盒中迅速带回室内，用尖头镊子从花朵蕊柱上采集花粉团。

(三)有益效果

本发明提供了一种文心兰花粉离体萌发培养液及其制备方法和培养方法。具备以下有益效果：

本发明提供了一种文心兰花粉离体萌发培养液及其制备方法和培养方法，本发明适用于文心兰花粉的离体培养，培养液能保持花粉形态完好，利于花粉分散，不易被细菌、真菌等微生物污染，利于镜检观察；花粉离体培养方法简便，重复性强，具生活力的花粉能快速萌发，花粉管完整，可作为鉴定文心兰花粉是否具有生活力的可靠方法。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：

文心兰品种资源花粉离体萌发鉴定其生活力。

本发明实施例提供一种文心兰花粉离体萌发培养液，具体包括以下配方：1000ml培养液中含2.0g C

一种文心兰花粉离体萌发培养液的制备方法，具体包括以下步骤：

S1.将2.0g C

S2.然后依次加入50g蔗糖、0.01H

S3.最后于121℃湿热灭菌20min，冷却至室温后使用，培养液在密闭条件下于5℃可存放60d，在超净工作台上可反复取用。

一种文心兰花粉离体萌发方法，包括如下具体操作步骤：

a.花粉团的消毒

以‘小樱桃’、‘紫薇’、‘门神’、‘香水文心’等4个文心兰品种为材料，将当天开放的花朵采集后用自封袋密封于冰盒中迅速带回室内，用尖头镊子从花朵蕊柱上采集形态完好的花粉团8～10块。在超净工作台上先用70％V/V酒精浸泡花粉团10S，移除酒精后再用1.0％NaClO消毒12min，无菌水清洗3次，备用。

b.花粉粒的分散

将消毒好的花粉团置入2ml无菌离心管中，添加利用权利要求1培养液1.0ml，浸泡50min后，用无菌移液器移除培养液，用无菌尖头镊子反复轻夹花粉团，使花粉粒从花粉团中散开，然后再加入权利要求1培养液1.5ml，密闭离心管后可进一步用振荡器振荡10S，使花粉粒更加分散。

另外，也可以在超净工作台上，将浸泡处理过的花粉团放入无菌小烧杯中，用无菌注射器的内管在烧杯中挤压花粉团，使花粉粒从花粉团中散开，再加入权利要求1培养液1.5ml，用无菌移液器将花粉溶液移入到2ml无菌离心管中，密闭离心管后也可以进一步用振荡器振荡10S，使花粉粒更加分散。

c.花粉粒的培养

在温度23～27℃，黑暗条件下培养60h，期间可将离心管轻轻颠倒旋转数次，让花粉粒保持良好的分散状态。

d.花粉萌发的观察

用移液器将少量花粉溶液移入凹槽载玻片中，用光学显微镜观察花粉萌发情况。其中，花粉萌发的花粉管长度≥花粉粒直径的花粉可认作萌发，萌发率＝(视野中花粉萌发数/视野中花粉总数)×100％，花粉萌发率指标可作为花粉生活力指标。未萌发出花粉管的花粉或有萌发但花粉管长度<花粉粒直径的可认作不能萌发。

经镜检观察统计，文心兰品种‘小樱桃’、‘紫薇’的花粉不能萌发出花粉管，说明以上品种花粉无生活力；而文心兰品种‘门神’、‘香水文心’的花粉萌发率分别为14.1％和41.3％，花粉具有较好的生活力。

另外，花粉管长度≥花粉粒直径的花粉被认作萌发，一般是作为统计尺度利于数量统计和分析，当花粉萌发但花粉管长度<花粉粒直径时，也可作为判断花粉是否具有生活力的重要参考，但作为数量分析时，应要有统一的尺度。

实施例二：

文心兰花粉离体萌发花粉管的活体染色观察。

本发明实施例提供一种文心兰花粉离体萌发培养液，具体包括以下配方：1000ml培养液中含3.0g C

一种文心兰花粉离体萌发培养液的制备方法，具体包括以下步骤：

S1.将3.0g C

S2.然后依次加入100g蔗糖、0.03H

S3.最后于121℃湿热灭菌20min，冷却至室温后使用，培养液在密闭条件下于5℃可存放60d，在超净工作台上可反复取用。

一种文心兰花粉离体萌发方法，包括如下具体操作步骤：

a.花粉团的消毒

以花粉具有较高萌发率的文心兰品种‘235’为材料，将当天开放的花朵采集后用自封袋密封于冰盒中迅速带回室内，用尖头镊子从花朵蕊柱上采集形态完好的花粉团15～20块。在超净工作台上先用70％V/V酒精浸泡花粉团15S，移除酒精后再用1.0％NaClO消毒10min，无菌水清洗3次，备用。

b.花粉粒的分散

将消毒好的花粉团置入2ml无菌离心管中，添加利用权利要求1培养液1ml，浸泡60min后，用无菌移液器移除培养液，用无菌尖头镊子反复轻夹花粉团，使花粉粒从花粉团中散开。另外，也可以在超净工作台上，将浸泡处理过的花粉团放入无菌小烧杯中，用无菌注射器的内管在烧杯中挤压花粉团，使花粉粒从花粉团中散开，然后转移至2ml无菌离心管中。本实施例中，目的在于对文心兰花粉粒萌发出的活体花粉管进行染色观察，不作萌发率数量统计，因此对花粉粒的分散程度要求较低，因此可省去用振荡器振荡的步骤。

c.花粉粒的染色处理

装有花粉粒的无菌离心管中添加0.5ml浓度为20μg/ml的C

d.花粉粒的培养

在温度23～27℃，黑暗条件下培养60h，期间可将离心管轻轻颠倒旋转数次，让花粉粒保持良好的分散状态。

e.花粉管活体染色观察

用移液器将少量花粉溶液移入凹槽载玻片中，用荧光显微镜观察，萌发出的花粉管原生质呈明显的绿色荧光。

本实施例中，染色步骤也可以在花粉培养一段时间后进行，其方法是：花粉粒培养至48h时，在培养液中直接加入0.5ml(液体体积过满时可换用更大的无菌离心管或可密闭小管)浓度为20μg/ml的C

尽管已经出示和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。