用于女性高度近视风险预测以及女性高度近视辅助诊断的生物标志物组合及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体地，本发明涉及用于女性高度近视风险预测以及女性高度近视辅助诊断的生物标志物组合及其应用。

背景技术

近视是一种由环境与遗传因素共同作用引起的屈光不正。高度近视是引起眼病患者眼盲和低视力的主要原因之一，给患者及其家庭带来了严重的经济负担。高度近视通常伴有眼轴延长、眼后极部的变形改变，包括巩膜变薄、脉络膜萎缩变薄等病理性改变，可伴有弱视、青光眼、白内障、玻璃体混浊、视网膜脱离等多种并发症，是严重影响视力健康乃至生存质量的一种重要疾病。

高度近视的发生发展是一个涉及多因素参与的复杂过程，具体机制仍不清晰，大多患者存在发病年龄逐渐低龄化、发病周期长的特点，人类基因储存并传递着疾病疾病相关发生风险的遗传信息。由此可见，寻找更有效的方法对高度近视易感人群进行早期检测以及干预具有重要的临床意义。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种女性高度近视易感人群的SNP位点组合标志物，用于女性高度近视易感人群的诊断以及风险预测。

本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：

本发明提供了一组检测女性高度近视易感人群的SNP位点组合，所述SNP位点组合包括以下任意一个、多个或全部：

rs9517546、rs9513522、rs533280354、rs35985881、rs35730227、rs72839911、rs6054605、rs11554776、rs7380272、rs7380824、rs78233829、rs3741252、rs181206、rs2234075、rs11544072、rs2272274、rs13214720、rs2035068、rs191479100、rs7308594。

进一步，所述SNP位点组合包括rs9517546、rs9513522、rs533280354、rs35985881、rs35730227、rs72839911、rs6054605、rs11554776、rs7380272、rs7380824。

进一步，所述SNP位点组合包括rs9517546、rs9513522、rs533280354、rs35985881、rs35730227、rs72839911、rs6054605、rs11554776、rs7380272、rs7380824、rs78233829、rs3741252、rs181206、rs2234075、rs11544072。

进一步，所述SNP位点组合包括rs9517546、rs9513522、rs533280354、rs35985881、rs35730227、rs72839911、rs6054605、rs11554776、rs7380272、rs7380824、rs78233829、rs3741252、rs181206、rs2234075、rs11544072、rs2272274、rs13214720、rs2035068、rs191479100、rs7308594。

本发明提供了一种女性高度近视易感人群的诊断系统，所述诊断系统包括使用前面所述的SNP位点组合的基因型对受试者高度近视情况进行判断的判断装置。

进一步，所述判断装置包括用于处理数据的以下多基因风险评分计算公式：

其中多基因风险评分

进一步，所述PRS的得分高于0.010时定级为较高风险。

进一步，所述受试者高度近视情况为受试者未来患高度近视的可能性。

进一步，所述受试者是青少年。

进一步，所述诊断系统还包括收集受试者样本信息的收集装置。

进一步，所述诊断系统还包括输出预测结果的输出装置。

进一步，所述诊断系统还包括SNP位点的基因型的检测装置。

进一步，所述诊断系统包括任意一个、多个或全部前面所述的SNP位点组合的基因型的试剂。

进一步，所述试剂包括以下方法检测SNP位点时所使用的试剂：TaqMan探针法、测序法、芯片法、飞行质谱仪检测、限制性片段长度多态性法、单链构象多态性法、等位基因特异性PCR、SNaPshot法、SNPlex法、变性高效液相色谱法、变性梯度凝胶电泳法。

进一步，所述试剂还包括扩增SNP位点所在的基因片段的试剂。

进一步，所述扩增SNP位点所在的基因片段的试剂包括特异性引物或探针。

进一步，所述特异性引物或探针是放射性标记的，或通过其他非放射性荧光标签手段来标记的。

进一步，所述样本包括体液、渗出液、骨髓、腹水、骨盆冲洗液、胸膜液、脊髓液、淋巴液、眼液、鼻拭子的提取物、喉拭子的提取物、口腔拭子的提取物、生殖器拭子的提取物、消化组织的细胞悬浮液、粪类物质的提取物、以及来自人、动物的组织和器官样本，以及由此衍生出的加工样本。

进一步，所述体液包括血液、血浆、血清、脑脊髓液、滑液、尿液、汗液、精液、粪便、痰、眼泪、粘液、羊水。

进一步，所述样本包括口腔拭子的提取物。

本发明提供了一种检测女性高度近视易感人群的试剂盒，所述试剂盒包括检测受试者样本的前面所述的SNP位点组合的基因型的试剂。

进一步，所述试剂包括以下方法检测SNP位点时所使用的试剂：TaqMan探针法、测序法、芯片法、飞行质谱仪检测、限制性片段长度多态性法、单链构象多态性法、等位基因特异性PCR、SNaPshot法、SNPlex法、变性高效液相色谱法、变性梯度凝胶电泳法。

进一步，所述试剂还包括扩增SNP位点所在的基因片段的试剂。

进一步，所述扩增SNP位点所在的基因片段的试剂包括特异性引物或探针。

进一步，所述特异性引物或探针是放射性标记的，或通过其他非放射性荧光标签手段来标记的。

进一步，所述试剂盒包括检测SNP位点的试剂或仪器。

进一步，所述试剂盒包括说明书，所述说明书记载了女性高度近视易感人群、女性高度近视不易感人群样本的前面所述的SNP位点组合水平参考数据集合。

进一步，所述受试者包括青少年。

进一步，所述样本包括体液、渗出液、骨髓、腹水、骨盆冲洗液、胸膜液、脊髓液、淋巴液、眼液、鼻拭子的提取物、喉拭子的提取物、口腔拭子的提取物、生殖器拭子的提取物、消化组织的细胞悬浮液、粪类物质的提取物、以及来自人、动物的组织和器官样本，以及由此衍生出的加工样本。

进一步，所述体液包括血液、血浆、血清、脑脊髓液、滑液、尿液、汗液、精液、粪便、痰、眼泪、粘液、羊水。

进一步，所述样本包括口腔拭子的提取物。

本发明提供了如下任一项应用，所述应用包括：

1)前面所述的SNP位点组合在制备检测女性高度近视易感人群的产品中的应用。

2)前面所述的诊断系统或前面所述的试剂盒在制备检测女性高度近视易感人群的产品中的应用。

本发明提供了一种检测女性高度近视易感人群的方法，所述方法检测从受试者分离的含核酸样本中指示女性易感高度近视的遗传变异，该方法包括：

1)使该样本与能够检测基因中遗传变异的试剂接触，所述基因包括前面所述的SNP位点组合的等位基因；

2)得到前面所述的SNP位点组合的基因型的检测结果；

3)根据检测结果中前面所述的SNP位点组合的基因型诊断女性高度近视易感程度，具体为：

rs9517546是DOCK9基因的SNP，其等位基因为G时；

rs9513522是DOCK9基因的SNP，其等位基因为A时；

rs533280354是FKBP5基因的SNP，其等位基因为A时；

rs35985881是FAM65B基因的SNP，其等位基因为C时；

rs35730227是FAM65B基因的SNP，其等位基因为G时；

rs72839911是FAM65B基因的SNP，其等位基因为A时；

rs6054605是SLC52A3基因的SNP，其等位基因为A时；

rs11554776是TMEM173基因的SNP，其等位基因为T时；

rs7380272是TMEM173基因的SNP，其等位基因为T时；

rs7380824是TMEM173基因的SNP，其等位基因为T时；

rs78233829是TMEM173基因的SNP，其等位基因为G时；

rs3741252是DAGLA基因的SNP，其等位基因为T时；

rs181206是IL27基因的SNP，其等位基因为G时；

rs2234075是ETV7基因的SNP，其等位基因为A时；

rs11544072是ZFAND3基因的SNP，其等位基因为A时；

rs2272274是CACNB2基因的SNP，其等位基因为T时；

rs13214720是JARID2基因的SNP，其等位基因为A时；

rs2035068是LRP4基因的SNP，其等位基因为C时；

rs191479100是TMEM173基因的SNP，其等位基因为T时；

rs7308594是OR6C6基因的SNP，其等位基因为G时，或者其中两种以上的组合时，女性高度近视的预测发病风险增加；

rs9517546是DOCK9基因的SNP，其等位基因为A时；

rs9513522是DOCK9基因的SNP，其等位基因为G时；

rs533280354是FKBP5基因的SNP，其等位基因为G时；

rs35985881是FAM65B基因的SNP，其等位基因为T时；

rs35730227是FAM65B基因的SNP，其等位基因为A时；

rs72839911是FAM65B基因的SNP，其等位基因为G时；

rs6054605是SLC52A3基因的SNP，其等位基因为G时；

rs11554776是TMEM173基因的SNP，其等位基因为C时；

rs7380272是TMEM173基因的SNP，其等位基因为C时；

rs7380824是TMEM173基因的SNP，其等位基因为C时；

rs78233829是TMEM173基因的SNP，其等位基因为C时；

rs3741252是DAGLA基因的SNP，其等位基因为C时；

rs181206是IL27基因的SNP，其等位基因为A时；

rs2234075是ETV7基因的SNP，其等位基因为G时；

rs11544072是ZFAND3基因的SNP，其等位基因为C时；

rs2272274是CACNB2基因的SNP，其等位基因为C时；

rs13214720是JARID2基因的SNP，其等位基因为G时；

rs2035068是LRP4基因的SNP，其等位基因为T时；

rs191479100是TMEM173基因的SNP，其等位基因为G时；

rs7308594是OR6C6基因的SNP，其等位基因为A时，或者其中两种以上的组合时，女性高度近视的预测发病风险降低。

进一步，所述方法包括根据PRS计算公式计算女性高度近视易感人群风险判定，所述PRS计算公式为

其中多基因风险评分

进一步，所述PRS的得分高于0.010时定级为较高风险。

术语“SNP”(单核苷酸多态性)是指DNA中的单个碱基位置，在该单个碱基位置上存在一个群体的不同的等位基因或替代的核苷酸。该SNP位置通常前接和后接所述等位基因的高度保守序列(例如，在种群中小于1/100或1/1000的成员中不同的序列)。对于在每个SNP位置的等位基因，个体可以是纯合的或杂合的。本发明的SNP位点以“rs-”方式命名，本领域技术人员能够根据上文的rs-命名，从适合的数据库和相关的信息系统如单核苷酸多态性数据库(dbSNP)中确定其确切的位置、核苷酸序列。

术语“基因型”指存在于个体或样本中的等位基因的同一性。典型地，其指与感兴趣的特定基因相关的个体的基因型；在多倍体个体中，其指个体携带有基因等位基因的何种组合。

术语“等位基因”又称对偶基因，是一些占据染色体的基因座的可以复制的脱氧核糖核酸。大部分时候是脱氧核糖核酸列，有的时候也被用来形容非基因序列。在一个个体里，某个基因的基因型是由该基因所拥有的一组等位基因所决定。例如，二倍体生物，也就是每条染色体都有两套的生物，两个等位基因决定了该基因的基因型。

术语“诊断”是指判定受试者是否存在高度近视的发病可能性，若有发病可能性，则判定受试者高度近视的发病可能性相对正常人群高。

术语“近视”是屈光不正的一种。当眼在调节放松状态下，平行光线进入眼内，其聚焦在视网膜之前，这导致视网膜上不能形成清晰像，称为近视眼(myopia)。此时检查验光则会提示近视度数，例如通常称近视50度，记录为“-0.50D”。在眼调节放松的状态下，外界的平行光进入眼内，其焦点正好落在视网膜上，则形成清晰像，此称为正视；若焦点无法落在视网膜上，则称为非正视，也就是屈光不正。

术语“高度近视”是近视一种发展严重的病症，屈光度为-6D(D指屈光度)或以上的近视眼为高度近视。远视力降低，近视力正常。集合减弱，可有眼位外斜或外隐斜，常有视疲劳。高度近视眼，多属于轴性近视，眼球前后轴伸长，其伸长几乎限于后极部。故常表现眼球较突出，前房较深，瞳孔大而反射较迟钝。在极高度近视眼可使晶体完全不能支撑虹膜，因而发生轻度虹膜震颤。

术语“易感人群”是对某种传染病易感的人群整体。易感者是对某种传染病缺乏特异性免疫力而容易被感染的人群整体中的某个人。易感者的抵抗力超低，其易感性就越高。

在本发明的语境中，术语“受试者”包括有此需求的检查人群，其中包括眼部屈光度异常的人群，或其他有高度近视相关眼部问题的人群，在本发明的实施方式中，所述受试者为人。

术语“样本”是指哺乳动物的组织、细胞或者体液的样本。在本发明的实施方案中，所述样本包括血液、血浆、血清、脑脊髓液、滑液、尿液、汗液、精液、粪便、痰、眼泪、粘液、羊水、渗出液、骨髓、腹水、骨盆冲洗液、胸膜液、脊髓液、淋巴液、眼液、鼻拭子的提取物、口腔拭子的提取物、咽喉拭子的提取物、生殖器拭子的提取物、消化组织的细胞悬浮液、或粪类物质的提取物、以及来自人、动物(例如非人哺乳动物)的组织和器官样本，以及由此衍生出的加工样本。

术语“引物”是指单链寡核苷酸，它与靶核酸中的序列(“引物结合位点”)杂交并且能够用作在适用于合成的条件下沿着核酸的互补链启动该合成的点。

术语“探针”指能与特别预期的靶生物分子，例如由内在基因编码的或相应于内在基因的核苷酸转录物的分子。探针可以由本领域技术人员合成，或者可以来自于合适的生物制备物。可以特异性地设计探针以对其进行标记。

术语“遗传变异”是指许多生物的遗传信息(或基因组)由长长的一串遗传密码组成，这些遗传密码以DNA(脱氧核糖核酸)的形式存在，DNA是编码生命的分子，被包装成染色体。人类有23对染色体，每对染色体中的一条来自母亲，一条来自父亲。染色体包含基因，这些基因是遗传密码的可定位区域，编码一个可遗传信息单元，但是并非所有的遗传序列都属于基因区域，并且染色体的大部分由称为非编码DNA的中间遗传物质组成。每个染色单体有两条链，每条链由一个可以由字母A(腺嘌呤)、T(胸腺嘧啶)、C(胞嘧啶)和G(鸟嘌呤)表示的核苷酸序列组成。这些核苷酸链以互补方式配对(A与T配对，C与G配对)，这样每个链包含相同的信息，因此仅考虑其中一个链。所有个体都包含许多遗传变异，其DNA编码与人群中普遍发生的DNA编码有所不同，其中特定位点的单个核苷酸碱基已被不同的核苷酸取代，而出现在每个基因座上的不同可能的核苷酸称为等位基因。

附图说明

图1是发现队列中基因型的关联分析图；

图2是不同SNP位点组合的ROC曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变换、修改、替换或变型，本发明的范围由权利要求极其等同物限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例

1、实验研究对象及实验方法

对青少年女性高度近视人群和正常对照人群进行口腔拭子采样。随后对采集到的口腔拭子样本进行遗传物质DNA的提取，提取出来的DNA进行全外显子测序。青少年女性高度近视人数总数为4821例，正常对照人群总数为5695例，将全部人群分成发现队列和验证队列，分组情况见表1。

表1发现队列和验证队列信息

2、发现队列检测

1)对发现队列全外显子测序，测序数据进行质控、比对和变异检测，共检测到1913569变异位点。

2)对女性人群队列进行关联分析(logisti回归)，找出在高度近视人群和正常人群频率差异大的变异位点，结果如图1所示。

3)去除位置上强连锁的位点后选取在发现队列关联分析结果中最显著的20个位点进行验证分析。

20个位点及其在发现队列关联分析的P值如表2所示。

表2 20个队列关联分析的SNP位点具体信息

3、验证队列验证

选取表1中的20个位点进行多基因风险评分(Polygenic Risk Score，PRS)，检验这些位点组合对验证队列的区分效果。

对20个SNP位点按照P值从小到大开始组合，使用R包ggplot2绘制验证队列受试者工作曲线(ROC)，分析AUC值、敏感性和特异性，判断指标单独和组合下的高度近视诊断效能，结果如图2所示。

组合SNP1至SNP10，对验证队列计算风险的区分结果为PRS10，AUC＝0.630；

组合SNP1至SNP15，对验证队列计算风险的区分结果为PRS15，AUC＝0.641；

组合SNP1至SNP20，对验证队列计算风险的区分结果为PRS20，AUC＝0.672。

20个位点联合使用时AUC值为0.672，敏感性为0.632，特异性为0.613，从女性高度近视遗传队列的候选风险致病变异位点对女性高度近视的表型诊断显示出较高的效能。

4、女性易感人群风险评判公式

根据PRS计算公式，若PRS得分高于0.010定级为较高风险。公式如下：

在数学形式中，估计的多基因风险评分

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。