一种外泌体的分离提取方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种外泌体的分离提取方法。

背景技术

外泌体(Exosomes)是细胞所分泌的直径为30～150nm，密度在1.13～1.21g/mL的双层磷脂囊泡，通常情况下是以胞吐形式释放到细胞外环境。其表面含有和功能相关的蛋白质和脂质成分，其膜表面表达特异性的蛋白质如CD9、CD63、CD81、TSC101和HSP70等，内部包裹了供体来源的蛋白质、核酸等活性物质。当外泌体和靶细胞接触后，其携带的生物分子以胞吞的形式被接收，在靶细胞中释放出来并发挥作用。近年来，随着对外泌体研究的进一步加深，发现不同组织细胞来源的外泌体呈现组织细胞的特异性，能够携带来源细胞的生物活性蛋白质、脂质、核酸等；在机体生理和病理状态下，外泌体内含的物质会随着细胞环境的变化而发生变化，因此，外泌体诊断在临床应用中越来越被重视。

外泌体能够在细胞间穿梭，有利于细胞间物质和信息的交换，通过装载外来药物来改变受体细胞的功能和状态，实现靶向治疗的目的。外泌体作为装载的工具，能够携带各种类型的药物，到达体内的各个系统，在神经系统疾病中，药物很难通过血脑屏障进入到靶细胞发挥作用，而外泌体可以通过实现对疾病的治疗。

外泌体的提取主要有以下几种方式：(1)超速离心法，是目前的金标准方法，此种方法采用低速离心高速离心交替进行分离外泌体，纯度高，但综合产量不高；(2)密度梯度离心法，使外泌体聚集在特定的密度阶层，纯度高，综合产量较好，但操作繁琐；(3)超滤离心法，利用不同截留相对分子质量的超滤膜对样品进行分离，此方法比较粗糙，操作简单；(4)磁珠免疫法，用包被抗标记物的磁珠分离外泌体，这种方法特异性较高，标记物标记的抗体较难拿到，有严格的要求。现在虽然有不同的外泌体提取方法，但均无法解决规模化提取的问题，常用的超速离心法一次离心的液体量有限；超滤法可以上规模但纯度有限；凝胶柱可以达到纯化效果但一次上样量有限。这些提取方法各有优缺点，多数方法只能做到小批量提取，能够做到大规模提取的，目前还没有一种很有效的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种可实现大规模高纯度提取外泌体的方法，整个操作过程不需要离心机，操作过程简单，只经过一次超滤膜过滤，过一次凝胶、一次色谱柱就可实现大规模提取，且整个实验过程中没有使用化学性质强的试剂和剧烈的反应，过程温和没有造成对所提外泌体结构性质的影响，提取的外泌体结构完整、性质稳定，能够实现对各种外泌体的提取。

针对上述目的，本发明采用的外泌体的分离提取方法包括下述步骤组成：

1、将含外泌体的液体样品用孔径0.45nm的超滤膜进行过滤，收集滤液；

2、将步骤1收集的滤液穿过多聚赖氨酸修饰的阳离子树脂柱，再用洗脱液洗脱树脂柱，收集粗提的外泌体溶液；其中，所述多聚赖氨酸修饰的阳离子树脂是将含-COOH或-NH

3、将粗提的外泌体溶液穿过CD63-CNBr-Sepharose 4B层析柱或CD81-CNBr-Sepharose 4B层析柱或CD9-CNBr-Sepharose 4B层析柱，再用盐酸-甘氨酸洗脱层析柱，对外泌体进行进一步的精提；

4、将精提的外泌体溶液和PBS缓冲液等体积混合，然后用100KD孔径的超滤膜超滤，此过程重复3～5次，得到纯度95％以上的外泌体。

上述步骤1中，所述含外泌体的液体样品为牛奶、羊奶、人乳、细胞培养上清、尿液、血清中任意一种。

进一步优选，上述步骤2中，先用1.5～2倍柱体积的20mmol/L pH＝7.35的PBS缓冲液平衡树脂柱，待电导及紫外吸收值稳定后，将步骤1收集的滤液进行上样，上样量为1.5～2个柱体积，上样速度为0.5～3mL/分钟，上样结束后静置5～10分钟，用1～2个柱体积的20mmol/L pH＝7.35的PBS缓冲液再次平衡树脂柱；基线稳定后，用1个柱体积的洗脱液洗脱树脂柱，然后静置5～10分钟，继续用洗脱液洗脱树脂柱，收集粗提的外泌体溶液。

上述步骤2中，所述含-COOH的阳离子树脂为羧基化硅胶、羧基化琼脂糖、羧基化葡聚糖中任意一种；所述含-NH

上述步骤2中，所述多聚赖氨酸修饰的阳离子树脂是在缩合剂、添加剂的作用下，将含-COOH的阳离子树脂与多聚赖氨酸的-NH

上述两端均为-COOH的Linker为HOOC-CH

上述缩合剂为N,N'-二异丙基碳二亚胺、二环己基碳二亚胺中任意一种；所述添加剂为2-肟氰基乙酸乙酯、1-羟基苯并三唑、N-羟基琥珀酰亚胺中任意一种或多种。

上述步骤2中，所述尿素溶液、盐酸胍溶液、异硫氰酸胍溶液用PBS缓冲液配制或者纯水配制。

本发明的有益效果如下：

1、本发明将含有外泌体的液体样品溶液用孔径0.45nm的超滤膜进行过滤，收集滤液，所得滤液穿过多聚赖氨酸修饰的阳离子树脂柱，外泌体被多聚赖氨酸吸附，其他杂蛋白、脂类、盐从柱子穿过，通过尿素溶液、盐酸胍溶液、异硫氰酸胍溶液等洗脱液进行洗脱得到粗提的外泌体溶液；粗提的外泌体溶液再经过CD63/81/9-CNBr-Sepharose 4B层析柱，外泌体再次和层析柱结合，用盐酸-甘氨酸(HCl-Gly)缓冲液进行洗脱，根据峰形收集外泌体，这一步分离去除杂蛋白和凋亡小体，还可以除去所引入的尿素、盐酸胍、异硫氰酸胍等化学试剂对外泌体的影响，达到了对外泌体的精细提取；最后用100KD孔径的超滤膜超滤，除去盐酸-甘氨酸及部分小分子蛋白和水分，对精提的外泌体进行浓缩，获得纯度95％以上的外泌体。

2、本发明提取的外泌体包括牛奶、羊奶、人乳、细胞培养上清、尿液、血清等含外泌体的液体，提取方法无需超速离心，即可实现从培养上清和乳品中提取高纯度外泌体，整个提取过程操作简单，稳定，容易操作，提取的外泌体结构完整、纯度高、回收率高，并且不需要复杂的仪器就能完成外泌体的提取，是一种从微量提取到规模提取的全新方法。

附图说明

图1是实施例1中粗提的外泌体的颗粒粒径分布图片(NTA)。

图2是实施例1中粗提的外泌体的电镜验证图片(TEM)。

图3是实施例1中精提的外泌体的颗粒粒径分布图片(NTA)。

图4是实施例1中对提取的外泌体标志物CD63进行蛋白标志物进行验证(Westernblot)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。

实施例1

以人脐带间充质干细胞中的外泌体提取为例

1、将第三代人脐带间充质干细胞的培养基离心去除杂质，分离出培养上清液，将50mL上清液用孔径0.45nm的超滤膜进行过滤，除去细胞及细胞碎片，收集滤液。

2、先用2倍柱体积的20mmol/L pH＝7.35的PBS缓冲液平衡α-多聚赖氨酸修饰的硅胶柱，柱子的长度为10cm、内径为16mm，平衡速度2mL/分钟；待电导及紫外吸收值稳定后，将步骤1收集的滤液进行上样，上样量为50mL，上样速度为1mL/分钟，上样结束后静置5分钟，用1个柱体积的20mmol/L pH＝7.35的PBS缓冲液再次平衡硅胶柱；基线稳定后，用1个柱体积的洗脱液洗脱硅胶柱，然后静置5分钟，继续用洗脱液洗脱硅胶柱，观测峰形图，大约在4～7min起峰时收集溶液，得到粗提的外泌体溶液。其中，α-多聚赖氨酸修饰的硅胶是将羧基化硅胶在N,N'-二异丙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑的作用下，α-多聚赖氨酸的-NH

3、先用2倍柱体积的平衡液(1000mL 50mmol/L Tris-HCl缓冲液加入29g NaCl配制而成)冲洗CD63-CNBr-Sepharose 4B层析柱(长度为10cm、内径为16mm)，流速为2mL/分钟；待电导及紫外吸收值稳定后，将步骤2粗提的外泌体溶液进行上样，上样量为2个柱体积，上样速度为1mL/分钟，上样结束后静置15分钟，用1个柱体积的平衡液再次冲洗层析柱，流速为0.5mL/分钟；基线稳定后，用1个柱体积的pH＝2.8的盐酸-甘氨酸(HCl-Gly)缓冲液(16.8mL 200mol/L HCl水溶液和50mL 200mol/L甘氨酸水溶液混合后加33.2mL去离子水配制而成)洗脱层析柱，流速为0.5mL/分钟，洗脱完后静置5分钟，继续用HCl-Gly缓冲液洗脱层析柱，观测峰形图，大约在4～7min起峰时收集溶液，得到精提的外泌体溶液，精提外泌体NTA检测结果见图3。由图3可见，精提的外泌体颗粒粒径分布在100～200nm之间。

4、将精提的外泌体溶液和20mmol/L pH＝7.35的PBS缓冲液等体积混合，然后用100KD孔径的超滤膜超滤，除去尿素、盐酸-甘氨酸及部分小分子蛋白和水分，此过程重复3次，得到纯度95％以上的外泌体。采用Western blot验证所得外泌体的定性检测结果，由图4可见，条带清楚，可满足实验要求。

实施例2

本实施例的步骤2中，α-多聚赖氨酸修饰的硅胶是将氨基化硅胶在N,N'-二异丙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑的作用下，α-多聚赖氨酸的-COOH与氨基化硅胶的-NH

实施例3

本实施例的步骤2中，用ε-多聚赖氨酸修饰的硅胶柱替换实施例1中α-多聚赖氨酸修饰的硅胶柱，所述ε-多聚赖氨酸修饰的硅胶是将羧基化硅胶在N,N'-二异丙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑的作用下，ε-多聚赖氨酸的-NH

实施例4

本实施例的步骤2中，用ε-多聚赖氨酸修饰的硅胶柱替换实施例2中α-多聚赖氨酸修饰的硅胶柱，所述ε-多聚赖氨酸修饰的硅胶是在N,N'-二异丙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑的作用下，将ε-多聚赖氨酸的-COOH与氨基化硅胶的-NH

实施例5

本实施例的步骤2中，以HOOC-CH

实施例6

本实施例的步骤2中，以H

实施例7

本实施例的步骤2中，以HOOC-CH

实施例8

本实施例的步骤2中，以H

表1

由表1可见，洗脱液选择浓度为3～7mol/L尿素溶液时均可以获得较高的外泌体回收率，其中尿素浓度为5～6mol/L时外泌体回收率达到峰值。且对比实施例1～8的结果可见，实施例5中所采用的α-多聚赖氨酸修饰的硅胶柱相比较其他7个实施例，外泌体分离回收效果最好，在尿素浓度为6mol/L时回收率达到80％。

实施例9

本实施例的步骤2中，洗脱液选取0.5mol/L、1mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L、6mol/L、7mol/L盐酸胍溶液和异硫氰酸胍溶液，其他步骤与实施例5相同，洗脱液中尿素浓度对外泌体回收率的影响见表2。

表2

由表2可见，盐酸胍和硫氰酸胍的浓度为3～7mol/L时均可以获得较高的外泌体回收率，其中盐酸胍浓度为5～6mol/L时外泌体回收率达到峰值。

实施例10

以鲜牛奶中的外泌体提取为例

1、将新鲜牛乳50mL用孔径0.45nm的超滤膜进行过滤，收集滤液。

2、先用2倍柱体积的20mmol/L pH＝7.35的PBS缓冲液平衡α-多聚赖氨酸修饰的硅胶柱，柱子的内径为16mm、长度为10cm，平衡速度2mL/分钟；待电导及紫外吸收值稳定后，将步骤1收集的滤液进行上样，上样速度为0.5mL/分钟，上样结束后静置10分钟，用1个柱体积的20mmol/L pH＝7.35的PBS缓冲液再次平衡硅胶柱；基线稳定后，用1个柱体积的洗脱液洗脱硅胶柱，然后静置5分钟，继续用洗脱液洗脱硅胶柱，观测峰形图，大约在4～7min起峰时收集溶液，得到粗提的外泌体溶液。其中，α-多聚赖氨酸修饰的硅胶与实施例5相同；所述洗脱液选取浓度为5mol/L尿素溶液，所选用的尿素溶液用20mmol/L pH＝7.35的PBS缓冲液配制。

3、该步骤与实施例1步骤3相同。

4、该步骤与实施例1步骤4相同，得到纯度95％以上的牛奶外泌体，冻存即可。